沙門氏菌效應物SopF調節(jié)腸上皮細胞泛凋亡以加重全身感染

       S. Typhimurium是引起廣泛宿主腹瀉的最常見食源性致病菌之一?？股啬退嶴. Typhimurium的出現(xiàn)是一個重大的公共衛(wèi)生問題。另一方面，S. Typhimurium也是研究宿主-細菌相互作用機制的一個有用的模式生物研究細菌與宿主免疫反應相互作用的新模式，將為鼠傷寒沙門菌感染及其他感染性疾病的防治提供新思路。腸上皮細胞（IECs）本身不僅是保護黏膜免受病原體入侵的機械屏障，而且還協(xié)調一些固有免疫防御。泛凋亡（PANptosis）是一種以細胞焦亡、凋亡和（或）壞死性凋亡為主要特征的炎性程序性細胞死亡（PCD）。目前已知IECs的泛凋亡在宿主抵抗S. Typhimurium感染的過程中起關鍵作用。細胞焦亡和凋亡驅動被感染的IECs排出，以限制S. Typhimurium的復制。死亡和被擠壓的IECs引起鄰近上皮的收縮，以維持腸屏障的完整性。相反，IECs的壞死性凋亡可導致腸屏障破壞，并促進S. Typhimurium擴散至固有層。目前尚不清楚S. Typhimurium如何克服IECs的泛凋亡以維持生存。該研究發(fā)表在《Gut Microbes》，IF：12.2。

技術路線

示意圖

主要研究結果
1. 鼠傷寒沙門菌效應蛋白SopF通過抑制腸道炎癥加重全身感染
       為了研究SopF在S. Typhimurium發(fā)病機制中的潛在作用，作者首先監(jiān)測了在感染過程中的死亡率和體重變化。鏈霉素預處理小鼠經(jīng)口感染STM-WT、STM-ΔsopF或STM-ΔsopF/ psopF。小鼠在4 dpi時出現(xiàn)多種瀕死狀態(tài)，灌胃STM-WT的小鼠在第2天死于感染。在同一時間內，70%的STM-ΔsopF-infected小鼠仍然存活。此外，感染STM-ΔSopF/pSopF的小鼠在6天內死于感染（圖1a）。隨著感染的進行，作者觀察到小鼠的體重逐漸下降，但3組之間沒有任何顯著差異（圖1b）。SopF在S. Typhimurium的早期固有免疫應答中發(fā)揮重要作用，并影響感染的結局。與之前的研究一致，與感染STM的小鼠相比，感染攜帶SopF的S. Typhimurium的小鼠在48 hpi時其肝臟和脾臟中的細菌負荷約為STM-ΔsopF的2倍，在120 hpi時觀察到細菌負荷顯著增加（圖1c-d）。這些數(shù)據(jù)證實，SopF是S. Typhimurium在腸外器官播散所必需的。
       腸道炎癥反應是宿主與病原體相互作用的重要機制接下來，作者關注SopF對S. Typhimurium誘導的腸道炎癥的影響。在感染STM-ΔSopF的小鼠中，在48 hpi時觀察到的結腸長度收縮大于感染STM-WT和STM-ΔSopF/pSopF的小鼠（圖1e-f）。所有鼠傷寒沙門菌感染的小鼠均出現(xiàn)進行性病理改變，包括腫脹和炎性細胞浸潤至固有層和黏膜下層。重要的是，SopF缺乏加重了S. Typhimurium誘導的盲腸組織病理學損傷，包括48 hpi時的IECs排出和120 hpi時的黏膜組織中IECs丟失（圖1g-h）。為了進一步表征SopF引起的腸道炎癥反應，作者分析了與宿主防御細胞內病原體密切相關的炎癥細胞因子水平如圖1i-k所示，隨著感染時間的延長，盲腸中Il-6、Tnf-α和Il-1β的轉錄水平被誘導的最明顯，在感染后120 hpi時，與STM- wt和STM-ΔSopF /pSopF感染小鼠相比，STM-ΔSopF感染小鼠盲腸中細胞因子的表達顯著增加。綜上所述，這些結果表明SopF抑制腸道炎癥，從而加重S. Typhimurium感染的全身性感染。

圖1 SopF抑制腸道炎癥，加重全身感染

2. S. Typhimurium效應因子SopF通過限制IECs的脫落促進細菌播散
       IECs在將管腔中的微生物群落從無菌系統(tǒng)環(huán)境中分離出來方面起著重要作用。受感染的IECs排出限制了病原體的上皮內增殖，是機體抵御腸道病原體感染的一般防御機制。為了確定由SopF介導的S. Typhimurium與IECs之間的相互作用，作者采用熒光顯微鏡觀察IECs屏障的完整性和S. Typhimurium的分布。在120 hpi時，作者觀察到在感染STM-ΔsopF的小鼠的黏膜組織中，總IECs數(shù)量顯著丟失，每10倍視野的上皮間隙較多（圖2a-d）。作者進一步用透射電子顯微鏡觀察盲腸的超微結構（圖2b）。在感染早期（12 hpi）腸腔內可見細菌（圖2b-c）。為了評估IECs排出與細菌播散開始之間可能的相關性，作者通過監(jiān)測感染的時間進程來擴展這些研究。感染后48 h，小鼠盲腸出現(xiàn)刷狀邊緣結構紊亂、微絨毛減少、變短等異常。相比之下，感染攜帶SopF的S. Typhimurium的小鼠在48 hpi時的IECs中出現(xiàn)輕微損傷，但在120 hpi時黏膜下層的細菌載量顯著較高（圖2b）?？筍. Typhimurium- LPS染色顯示，在感染STM的小鼠中，盲腸的細菌定植在12 hpi時增加（圖2c）。在感染后期（120 hpi），攜帶SopF的S. Typhimurium主要定植在黏膜下層，而STM-ΔsopF仍在黏膜中（圖2c-e）。綜上所述，這些結果表明SopF限制IECs的排出以促進細菌的傳播。

圖2 SopF限制IECs的移位以促進細菌傳播

3. 鼠傷寒沙門菌效應蛋白SopF在宿主防御鼠傷寒沙門菌感染過程中調節(jié)腸上皮細胞的泛凋亡
       雖然上皮細胞主要被認為是一個機械屏障，但研究表明，IECs的細胞命運允許它們對抗病原體。作者研究了SopF在S. Typhimurium感染后IECs細胞死亡中的作用。在攜帶SopF的S. Typhimurium感染的人結腸癌Caco-2細胞和人正常結腸上皮NCM460細胞中，發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶（LDH）釋放減少，揭示了SopF抑制了IECs的細胞死亡（圖3a-b）。最近的證據(jù)表明，在全凋亡方面，病原體和宿主之間存在相互作用。為了評估SopF對IECs凋亡的影響，作者從S. Typhimurium感染的小鼠盲腸中分離IECs。蛋白質印跡分析顯示，STM-ΔsopF-infected小鼠體內GSDMD-NT片段蛋白水平較高，可形成膜孔誘導細胞焦亡。被Caspase-3裂解的上皮源性GSDME也參與腸道炎癥的發(fā)病機制32因此，作者在STM-ΔsopF-infected小鼠中發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)健的GSDME激活（圖3c-d）。上述結果提示SopF抑制IECs細胞焦亡。除了細胞焦亡，作者發(fā)現(xiàn)在感染STM-ΔsopF的小鼠中，凋亡執(zhí)行體caspase（caspase-3）的切割增加（圖3e-f）。焦亡和凋亡的IECs尖化以維持上皮屏障的完整性，而SopF阻止感染的IECs被清除。IECs的壞死性凋亡也會導致上皮屏障功能障礙，從而促進S. Typhimurium的傳播。接下來，作者研究了SopF是否也參與了IECs的程序性壞死。正如預期的那樣，在攜帶SopF的S. Typhimurium感染的小鼠中，在12 hpi時觀察到混合譜系激酶結構域樣蛋白（MLKL）的強勁磷酸化，這表明SopF促進IECs的壞死性凋亡，從而使S. Typhimurium播散到固有層甚至腸外器官（圖3g-h）。在Caco-2細胞（圖3i-n）中顯示類似結果。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明SopF通過抑制細胞凋亡和焦亡而促進IECs的壞死性凋亡來調節(jié)泛凋亡，這可能與S. Typhimurium的系統(tǒng)性感染有關。

圖3 SopF調節(jié)腸上皮細胞的泛凋亡以防御宿主感染S. Typhimurium

4. 鼠傷寒沙門菌效應蛋白SopF可抑制細胞凋亡的分子開關Caspase-8的激活
       Caspase-8通過細胞表面死亡受體連接和寡聚化激活，是細胞凋亡、壞死性凋亡和細胞焦亡的分子開關。此外，Caspase-8調控上皮細胞PCD，防止了S. Typhimurium感染時上皮細胞屏障功能障礙為了了解SopF對Caspase-8的潛在影響，作者從S. Typhimurium感染的小鼠盲腸分離IECs進行了檢測。與野生型或補充突變株感染的小鼠相比，缺乏SopF的沙門菌感染的小鼠在12和48 hpi時，Caspase-8的切割增加（圖4a-b）。相應的，在Caco-2細胞和NCM460細胞中，SopF的缺失導致Caspase-8在24 hpi時的切割增加（圖4c-f）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，SopF通過抑制Caspase-8的激活來調節(jié)IECs的泛凋亡。

圖4 SopF抑制Caspase-8的活化，Caspase-8是泛凋亡的分子開關

5. 在SopF介導的S. Typhimurium感染中，PDK1-RSK信號對Caspase-8阻斷是必需的
       Caspase-8可能作為調控泛凋亡的守門人。Yang等人之前的工作表明，3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）-核糖體S6激酶（RSK）信號是減少Caspase-8阻斷的內在機制26值得注意的是，SopF與宿主細胞膜的磷脂酰肌醇結合，從而促進新生沙門菌空泡（SCV）的穩(wěn)定9因此，作者假設PDK1-RSK信號通路參與了SopF介導的Caspase-8激活的阻斷。蛋白質印跡分析顯示，攜帶SopF的S. Typhimurium感染的小鼠中，PDK1和磷酸化RSK的蛋白水平可能高于STM-ΔSopF-infected組（圖5a-b），表明SopF可以激活PDK1-RSK通路，從而取消Caspase-8的激活。在293 T細胞中表達的His或His-SopF被免疫沉淀，并評估其與內源性PDK1相互作用的能力。結果顯示，在His-SopF免疫沉淀樣品中，未檢測到PDK1（圖5c）。然后，作者檢測了在感染的Caco-2細胞中，被S. Typhimurium易位的SopF:His是否與內源性PDK1相互作用。構建攜帶空pBAD的STM-ΔsopF（STM-ΔsopF/pBAD）或帶His標簽的SopF表達的pBAD（STM-ΔsopF/p sopF: His）構建感染模型。在SopF中也未檢測到PDK1：His免疫沉淀樣本在感染早期和晚期均未檢測到PDK1，這表明SopF不能直接與PDK1相互作用（圖5d）。
       AR-12和BI-D1870分別是PDK1和RSK的ATP拮抗劑。PDK1抑制劑AR-12可能消除了24 hpi時RSK磷酸化的增加，但逆轉了SopF引起的Caspase-8活化的降低。此外，在S. Typhimurium感染的Caco-2細胞中，RSK抑制劑BI-D1870對Caspase-8也有相同的作用（圖5e-g）。結果表明，SopF通過PDK1-RSK信號通路抑制Caspase-8的切割。鑒于Caspase-8在調節(jié)泛凋亡中起核心作用，作者進一步用AR-12或BI-D1870預處理Caco-2細胞。蛋白質印跡分析顯示，AR-12和BI-D1870處理后，GSDMD-NT、GSDME-NT和cleaved Caspase-3蛋白水平升高，MLKL磷酸化水平降低。經(jīng)抑制劑治療后，3組感染組間差異無統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)表明，AR-12和BI-D1870均恢復了停止的細胞焦亡和凋亡以及提示的壞死性凋亡（圖5f-h）。

圖5 在SopF介導的S. Typhimurium感染中，PDK1-RSK信號對Caspase-8阻斷是必需的

結論
       綜上所述，作者確定了SopF在調節(jié)IECs 泛凋亡以加重S. Typhimurium播散方面的一種新功能。在這一范式中，PIP結合效應因子SopF通過PDK1-RSK信號通路阻斷了Caspase-8的激活。由于Caspase-8在PCD中的重要作用，Caspase-8位點作為調控泛凋亡的十字路口。抑制Caspase-8可減少細胞焦亡和凋亡，增加程序性壞死。阻斷PDK1或RSK的潛在治療靶點逆轉了對Caspase-8的阻斷和隨后的IECs 泛凋亡。SopF抑制的細胞焦亡和凋亡阻礙了感染IECs的清除，而SopF誘導的程序性壞死促進了S. Typhimurium的內化，從而促進細菌的播散。這些發(fā)現(xiàn)揭示了SopF調控IECs細胞命運的新機制，這可能為控制S. Typhimurium感染和其他相應疾病提供有吸引力的治療策略。

實驗方法
乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗，轉染實驗，免疫沉淀，蛋白質印跡分析，定量聚合酶鏈反應
參考文獻
Yuan H, Zhou L, Chen Y, You J, Hu H, Li Y, Huang R, Wu S. Salmonella effector SopF regulates PANoptosis of intestinal epithelial cells to aggravate systemic infection. Gut Microbes. 2023 Jan-Dec;15(1):2180315.