膜蛋白聯(lián)動(dòng)——TREM2/CD36促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成加速AS進(jìn)展

       動(dòng)脈壁上的脂質(zhì)堆積異常是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的一個(gè)標(biāo)志。以前研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠AS的主動(dòng)脈斑塊中，骨髓細(xì)胞上的觸發(fā)受體2（TREM2）（一種免疫球蛋白家族的跨膜受體）的表達(dá)增加。然而，TREM2是否在AS中起作用仍未知。本研究利用ApoE knockout (ApoE^?/?) 小鼠模型，原代血管平滑肌細(xì)胞（SMCs）和骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDMs）探究得知TREM2通過CD36表達(dá)促進(jìn)SMC和巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞形成加速AS進(jìn)展。本研究于2023年5月發(fā)表在《Cell and Molecular Life Sciences》IF:8期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、TREM3的表達(dá)在AS斑塊中增加
       此前研究表明TREM2參與脂質(zhì)代謝，并且在AS中TREM表達(dá)增加。作者分析了GSE43292數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)TREM2的表達(dá)相比于正常組織，在硬化斑塊中增加（Fig. 1a）。鑒于該結(jié)果，作者檢測了小鼠斑塊進(jìn)展時(shí)TREM2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在ApoE^?/?小鼠主動(dòng)脈中的表達(dá)隨著時(shí)間增加（Fig. 1b）。此外，作者使用硬化因子oxLDL (50 μg/mL)處理RAW264.7細(xì)胞和mSMCs細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TREM2的表達(dá)也隨著時(shí)間增加（Fig. 1c）。共聚焦熒光建偉就證實(shí)了TREM2的表達(dá)在Trem2+/+/ApoE?/?小鼠斑塊中的表達(dá)趨勢（Fig. 1d, e）。以上結(jié)果表明TREM3的表達(dá)在AS斑塊中增加。

圖1 TREM3的表達(dá)在AS斑塊中增加

2、敲低TREM2緩解斑塊形成和脂質(zhì)沉積
       為確定TREM2在AS中因果關(guān)系，作者在ApoE?/?小鼠中敲低TREM2構(gòu)建了Trem2?/?/ApoE?/?小鼠，高脂飲食喂養(yǎng)12周誘導(dǎo)AS發(fā)生。ORO染色顯示，相比對(duì)照組，Trem2?/?/ApoE?/?小鼠的整個(gè)主動(dòng)脈病變區(qū)域減少（Fig. 2a）。此外，主動(dòng)脈弓病變面積減小，主動(dòng)脈組織壞死核減小，纖維帽厚度增加（Fig. 2a–c）。類似的，脂質(zhì)染色也在Trem2?/?/ApoE?/?小鼠主動(dòng)脈竇水平下降（Fig. 2b, c）。這些結(jié)果表明敲低TREM2降低斑塊進(jìn)展和脂質(zhì)沉積。

圖2 敲低TREM2緩解斑塊形成和脂質(zhì)沉積

3、TREM2在斑塊中的巨噬細(xì)胞和SMCs衍生的泡沫細(xì)胞中表達(dá)
       脂質(zhì)沉積是AS的標(biāo)志，有助于斑塊的進(jìn)展和不穩(wěn)定。作者研究了TREM2是否直接參與AS的脂質(zhì)代謝功能障礙。將TREM2特異性抗體與斑塊中的BODIPY共免疫染色。結(jié)果顯示，BODIPY陽性細(xì)胞與TREM2在斑塊中共定位（圖3）。隨著AS的進(jìn)展，BODIPY/TREM2陽性細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加（Fig. 3a, d）。這些結(jié)果與前面在體內(nèi)的觀察結(jié)果一致，即TREM2缺乏會(huì)降低主動(dòng)脈根部的脂質(zhì)負(fù)擔(dān)。
       由于泡沫細(xì)胞的主要來源是SMCs和巨噬細(xì)胞，所以作者研究了TREM2在這兩種細(xì)胞的泡沫過程中的作用。用細(xì)胞SMC標(biāo)記物(α-SMA)和巨噬細(xì)胞標(biāo)記物(CD68)對(duì)不同時(shí)期飼喂HFD小鼠主動(dòng)脈竇的TREM2抗體進(jìn)行免疫熒光共染色。結(jié)果表明，TREM2在斑塊中與α-SMA和CD68共定位，并且TREM2/α- SMA陽性和TREM2/ CD68陽性細(xì)胞的數(shù)量隨著動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展而增加（Fig. 3b, c, e, f），表明TREM2在動(dòng)脈粥樣硬化病變中上調(diào)，并在SMCs和巨噬細(xì)胞中富集，即TREM2參與動(dòng)脈粥樣硬化過程中SMCs和巨噬細(xì)胞的泡化。

圖3TREM2在斑塊中的巨噬細(xì)胞和SMCs衍生的泡沫細(xì)胞中表達(dá)

4、TREM2通過CD36受體促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成
       為探究TREM2是否促進(jìn)巨噬細(xì)胞和SMCs細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，作者利用慢病毒在Raw264.7和mSMCs細(xì)胞中過表達(dá)TREM2。ORO染色顯示，用50 μg/mL oxLDL處理24小時(shí)后，TREM2過表達(dá)組的ORO陽性細(xì)胞顯著增多（Fig. 4a, b）。此前研究表明TREM2促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)攝取。為闡明TREM2促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制，作者進(jìn)一步檢測了動(dòng)脈粥樣硬化中參與脂質(zhì)代謝的主要脂質(zhì)攝取受體(CD36, MSR1和OLR1)和外排受體(ABCG1和ABCA1)的蛋白水平變化。結(jié)果表明，TREM2對(duì)脂質(zhì)攝取受體MSR1和OLR1的表達(dá)無顯著影響，同樣，脂質(zhì)外排受體ABCG1和ABCA1的表達(dá)也不受TREM2表達(dá)的影響，然而，與LV-GFP組相比，LV-TREM2組Raw264.7細(xì)胞和mSMCs中CD36蛋白水平顯著升高（Fig. 4c, d）。此外，TREM2增加了CD36的mRNA水平，但沒有增加其他受體的轉(zhuǎn)錄（Fig. 4e, f）。在原代BMDMs和mSMC中，敲除TREM2導(dǎo)致CD36的表達(dá)降低（Fig. 4g）。

圖4 在體外TREM2促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成

       CD36是動(dòng)脈粥樣硬化中影響脂質(zhì)攝取的主要受體，因此使用DiI-oxLDL來評(píng)估脂質(zhì)攝取水平。免疫熒光分析和流式細(xì)胞術(shù)顯示，TREM2促進(jìn)了Raw264.7細(xì)胞和mSMCs對(duì)DiI-oxLDL的攝?。▓D5a, b），這與先前在小膠質(zhì)細(xì)胞中的研究一致。為進(jìn)一步評(píng)估TREM2對(duì)CD36表達(dá)的影響，在過表達(dá)TREM2的細(xì)胞中使用siRNA抑制CD36的表達(dá)。結(jié)果顯示CD36沉默抑制TREM2誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞和mSMCs中脂質(zhì)積累和攝取的增加（Fig. 5c–f）。
       以上數(shù)據(jù)表明TREM2通過CD36促進(jìn)脂質(zhì)攝取進(jìn)而促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。

圖5 TREM2通過調(diào)節(jié)CD36刺激膽固醇攝取

5、TREM2通過調(diào)節(jié)MAPK-p38和PPARγ的磷酸化調(diào)控CD36的表達(dá)
       轉(zhuǎn)錄因子PPARγ是調(diào)控CD36轉(zhuǎn)錄的最重要因子。WB結(jié)果顯示TREM2不改變oxLDL刺激下的PPARγ的蛋白表達(dá)，但顯著抑制PPARγ的磷酸化活性（Fig. 6a–d）。這些結(jié)果表明，TREM2通過調(diào)控PPARγ的磷酸化水平調(diào)控CD36的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化過程中脂質(zhì)積累和泡沫細(xì)胞的形成。
       MAPK信號(hào)通路調(diào)控AS和肥胖期間的多種轉(zhuǎn)錄印制的激活，其參與TREM2和PPARγ信號(hào)通路，因此，作者檢測了TREM2過表達(dá)后的MAPK信號(hào)通路，包括p38，JNK1/2，ERK1/2。結(jié)果顯示，過表達(dá)TREM2顯著降低兩株細(xì)胞中p36的磷酸化，而不影響JNK1/2，ERK1/2的磷酸化和表達(dá)（Fig. 6a–d）。這些結(jié)果表明p38參與了PPARγ的磷酸化。接下來，利用p38磷酸化激動(dòng)劑Deh探究p38的作用。發(fā)現(xiàn)Deh刺激后，TREM2誘導(dǎo)的脂質(zhì)攝取和積累增加受到抑制（Fig. 6e, f）。WB結(jié)果也顯示p38磷酸化激動(dòng)劑處理后PPARγ活性降低，CD36表達(dá)降低（Fig. 6g, h）。這些數(shù)據(jù)表明，TREM2通過抑制p-p38的磷酸化水平來調(diào)節(jié)PPARγ的活性，從而促進(jìn)CD36的表達(dá)和脂質(zhì)攝取。

圖6 TREM2調(diào)節(jié)MAPK-p38和PPARγ的磷酸化

       作者檢測了上述蛋白在小鼠體內(nèi)的表達(dá)變化。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，TREM2通過p38/PPARγ信號(hào)傳導(dǎo)和下調(diào)CD36的表達(dá)來影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展（圖7a，b）。此外，與Trem2+/+/ApoE-/-小鼠相比，Trem2-/-/ApoE-/-小鼠的CD36有所下降。通過CD68-BODIPY和α-SMA-BODIPY雙染色，主動(dòng)脈竇內(nèi)的脂質(zhì)負(fù)荷和泡沫細(xì)胞也明顯減少（圖7c-e）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，TREM2的缺失通過調(diào)節(jié)CD36的表達(dá)來抑制動(dòng)脈粥樣硬化中泡沫細(xì)胞的形成。

圖7 在體內(nèi)TREM2缺失降低泡沫細(xì)胞的形成

       總之，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TREM2在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中增加，而且TREM2的缺失會(huì)減弱ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。在體外，TREM2的過度表達(dá)通過調(diào)節(jié)CD36的表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)吸收，加劇巨噬細(xì)胞和mSMCs中泡沫細(xì)胞的形成。因此，TREM2是治療動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)潛在目標(biāo)。

圖形摘要

實(shí)驗(yàn)方法
GEO芯片數(shù)據(jù)分析，TREM2-knockout mice (Trem2^?/?)構(gòu)建，AS斑塊分析，免疫熒光（IF）染色，細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)，DiI-oxLDL攝取實(shí)驗(yàn)，ORO染色，BODIPY染色，WB實(shí)驗(yàn)，qRT-PCR
參考文獻(xiàn)
Guo X, Li B, Wen C, Zhang F, Xiang X, Nie L, Chen J, Mao L. TREM2 promotes cholesterol uptake and foam cell formation in atherosclerosis. Cell Mol Life Sci. 2023 May 3;80(5):137. doi: 10.1007/s00018-023-04786-9. PMID: 37133566.