腸道菌群紊亂遍及早期帕金森病、REM睡眠行為障礙及其一級(jí)親屬

       微生物-腸-腦軸被認(rèn)為在帕金森病（Parkinson ' s disease，PD）中發(fā)揮重要作用。在本研究中，作者對(duì)早期PD、REM睡眠行為障礙（RBD）、RBD一級(jí)親屬（RBD-FDR）和健康對(duì)照人群進(jìn)行了腸道菌群的橫斷面研究，以反映PD的腸-腦分期模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和RBD-FDR相比，早期PD和RBD的腸道菌群組成發(fā)生了顯著變化。在控制了抗抑郁藥、滲透性瀉藥和排便頻率等潛在的混雜因素后，RBD和RBD-FDR中已經(jīng)出現(xiàn)了產(chǎn)CH3(CH2)2COOH鹽細(xì)菌的耗竭和促炎柯林斯氏菌的富集。隨機(jī)森林模型確定了12個(gè)有效區(qū)分RBD和對(duì)照的微生物標(biāo)記。這些發(fā)現(xiàn)表明，PD樣腸道菌群失調(diào)發(fā)生在RBD發(fā)生時(shí)的PD前驅(qū)期，并在較年輕的RBD-FDR受試者中開(kāi)始出現(xiàn)。該研究將具有病因?qū)W和診斷意義。本研究于2023年5月發(fā)表于期刊《Nature Communications》上，IF：16.6。
技術(shù)路線

主要研究?jī)?nèi)容
1、社會(huì)人口學(xué)和臨床特征
       本研究包括來(lái)自香港地區(qū)v-PSG診斷的RBD及RBD家系隊(duì)列的452例受試者的糞便樣本。在剔除11個(gè)低read count的樣本后，共有441個(gè)樣本留作進(jìn)一步分析（圖1）。所有早期PD患者均為臨床確診的PD，運(yùn)動(dòng)癥狀起病時(shí)間小于5年?？刂疲╪ = 108，年齡67.3 ± 7.0歲，男性占63.9%）與RBD（n = 170，年齡68.6 ± 7.6歲，男性占73.5%）及早期PD組（n = 36，67.8 ± 5.6歲，男性占86.1%）進(jìn)行年齡、性別匹配。與RBD-FDR（n=127，q值< 0.05）組相比，三組患者年齡均較大，男性均較多。RBDQ-HK問(wèn)卷所捕獲的RBD特征的嚴(yán)重程度從對(duì)照、RBD-FDR到RBD和PD早期（RBDQ-HK總分，6.3 ± 7.0 vs 9.2 ± 8.4 vs 39.2 ± 17.7 vs 32.8 ± 16.1，P值< 0.001）均顯著增加。127例RBD-FDR中，11例（8.7%）經(jīng)結(jié)構(gòu)化臨床訪談確診為疑似RBD。前驅(qū)期PD的總似然比（LR）是用于識(shí)別有前驅(qū)期PD風(fēng)險(xiǎn)的受試者的研究標(biāo)準(zhǔn)。
       胃腸道癥狀采用成人羅馬Ⅳ診斷問(wèn)卷和帕金森病自主神經(jīng)量表進(jìn)行評(píng)估。從對(duì)照、RBD-FDR、RBD到早期PD患者（8.3 vs 9.4 vs 45.3 vs 69.4%，P值< 0.001），功能性便秘的患病率呈增加趨勢(shì)。排便費(fèi)力是功能性便秘的核心特征，即使在調(diào)整了年齡和性別（8.8 vs 15.8 vs 45.4 vs 68.6%，P值< 0.001）后，四組人群的排便費(fèi)力程度仍呈進(jìn)行性增加。此外，作者使用排便頻率評(píng)分[ BMF，取值范圍為1（大便次數(shù)> 1次/天）~ 6（≤1 /周）]和大便性狀一致性（Bristol糞便性狀量表（Bristol Stool Form Scale，BSFS）反向計(jì)分，分?jǐn)?shù)越高表示糞便越硬）作為結(jié)腸傳輸時(shí)間的代理指標(biāo)，這兩個(gè)指標(biāo)在四組（P值均< 0.001）中均表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。其他胃腸功能紊亂，如腸易激綜合征和功能性腹瀉，各組間無(wú)差異。
       在臨床特征方面，與對(duì)照組和RBD-FDR（所有q值均< 0.05）28相比，RBD患者報(bào)告了更多的終生重性抑郁障礙和焦慮障礙。其他潛在的混雜人類疾病，如糖尿病和血脂異常，在四組人群中分布相似。用藥情況指在大便收集期間服用的任何藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超過(guò)一半的RBD和早期PD患者服用苯二氮卓類藥物，而分別有30.6%和13.9%的早期PD患者和5.3%和25.3%的RBD患者服用滲透性瀉藥和抗抑郁藥。在PD特異性藥物中，47.2%的早期PD患者接受了卡比多巴/左旋多巴，其次為單胺氧化酶B抑制劑（41.7%）、多巴胺激動(dòng)劑（8.3%）、鹽酸苯海索（5.6%）、兒茶酚- O-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（2.8%）。

圖1 課題選擇和招募流程圖

2、腸道菌群組成隨α-突觸核蛋白病的進(jìn)展而改變
       從441份糞便樣品中共鑒定出84個(gè)科，249個(gè)屬。作者觀察到屬水平的alpha多樣性（Chao 1、Gini Simpson和Shannon指數(shù)）在組間具有可比性。使用變調(diào)的多變量方差分析（PERMANOVA，99，999個(gè)置換），調(diào)整年齡和性別，評(píng)估每對(duì)組間微生物組成（即β多樣性）的個(gè)體間差異。與對(duì)照組（R2 = 0.035，q值< 0.001）相比，早期PD組呈現(xiàn)明顯的菌群聚集模式。同樣，RBD的菌群組成與早期PD（R2 = 0.008，q值= 0.066）相似，但與對(duì)照組和RBD-FDR（所有q值< 0.001）差異顯著。微生物組成分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和RBD-FDR之間沒(méi)有顯著差異（圖2b）。盡管如此，早期PD、RBD和對(duì)照組的腸道菌群組成仍將得到組間主成分比較和主坐標(biāo)（PCo A）分析的不同聚類模式的支持，分別如圖2所示。

圖2 在α-突觸核蛋白病的前驅(qū)和早期階段改變了微生物組成

3、腸道微生物在α-突觸核蛋白病的前驅(qū)期和早期階段逐漸發(fā)生改變
       在過(guò)濾掉低豐度（< 10%）和豐度（< 0.05%）的類群后，共剩余36科88屬用于差異豐度分析。屬的Read count表通過(guò)中心對(duì)數(shù)比（CLR）變換被重新框定為組成型數(shù)據(jù)。作者發(fā)現(xiàn)35.2%的屬（n = 31）與α-突觸核蛋白病（Kendall ' s tau-b相關(guān)性，q值< 0.05）的4個(gè)階段顯著相關(guān)。在這些菌屬中，Butyricicoccus和Faecalibacterium與疾病進(jìn)展（Kendall ' s τb =-0.204和- 0.198，q值< 0.001，圖3c）的相關(guān)性最強(qiáng)，而Faecalibacterium也是第一主成分變異的主要貢獻(xiàn)者，如圖3d所示。
       采用克魯斯卡爾- Wallis檢驗(yàn)對(duì)差異類群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)類群（q值< 0.05）之間存在顯著差異的有16科26屬。應(yīng)用微生物組多變量線性模型（MaAsLin 2）進(jìn)一步評(píng)估對(duì)照、RBD-FDR、RBD和早期PD之間的關(guān)聯(lián)。模型包括四個(gè)階段，（參照=對(duì)照）為固定效應(yīng)，家庭id為隨機(jī)效應(yīng)。與對(duì)照（未經(jīng)校正的MaAsLin 2，所有q值< 0.05，圖3a）相比，42個(gè)差異類群中有19個(gè)（45.2%），包括產(chǎn)CH3(CH2)2COOH菌（如羅斯氏菌、毛螺菌科_ND3007_group、毛螺菌屬、[真細(xì)菌]_Ventriosum_group、Butyricicoccus、Faecalibacterium和家族毛螺菌科等）、產(chǎn)H2S菌脫硫弧菌屬、粘蛋白降解菌Akkermansia、柯林斯菌屬、Oscillospiraceae_UCG-002和- 005，在RBD和早期PD中顯著改變。當(dāng)進(jìn)一步將年齡和性別作為固定效應(yīng)納入Ma As Lin 2模型（調(diào)整后的MaAsLin 2）時(shí)，這些關(guān)聯(lián)仍然在q值< 0.1時(shí)顯著。
       有趣的是，在調(diào)整的（β = 0.58，q值= 0.035）和未調(diào)整的（β = 0.49，q值= 0.038）模型中，促炎柯林斯氏菌的富集已經(jīng)出現(xiàn)在α-突觸核蛋白病的早期前驅(qū)階段RBD-FDR中（圖3a、e）。此外，與對(duì)照組（β =-0.54，q值= 0.069）相比，作者觀察到RBD-FDR中產(chǎn)CH3(CH2)2COOH鹽的[真細(xì)菌]_Ventriosum_group邊緣減少。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與不具有可能RBD特征（CLR豐度，-0.36 ± 1.8 vs 0.35 ± 1.7，q值= 0.028，補(bǔ)充圖3）的RBD-FDR相比，具有可能RBD特征（n = 11）的RBD-FDR在[真細(xì)菌]_ventriosum_group中出現(xiàn)了更明顯的下降。

圖3 α-突觸核蛋白病前驅(qū)和早期腸道微生物的差異

4、腸道微生物群作為RBD的潛在診斷生物標(biāo)志物
       基于RBD患者體內(nèi)的微生物變化，作者進(jìn)一步研究了利用微生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)RBD狀態(tài)。在訓(xùn)練集（占整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的80%）中用隨機(jī)森林算法搭建機(jī)器學(xué)習(xí)模型，在剩余數(shù)據(jù)（即測(cè)試集）中測(cè)試訓(xùn)練好的模型的性能。特征矩陣由88個(gè)篩選屬的CLR豐度組成，特征選擇基于10折交叉驗(yàn)證的25次重復(fù)的遞歸特征消除（RFE）算法。在訓(xùn)練集中，微生物標(biāo)記物可以區(qū)分RBD和對(duì)照，其受試者工作特征曲線下的平均面積（AUC）為0.79（[ 95% CI ] = [ 0.78，0.80 ]，見(jiàn)圖4b）。對(duì)于獨(dú)立測(cè)試集，預(yù)測(cè)模型的平均準(zhǔn)確率為0.68（[ 95% CI ] = [ 0.66，0.70 ]），AUC為0.75（[ 95% CI ] = [ 0.73，0.78 ]，見(jiàn)圖4c）。特征選擇顯示，88個(gè)屬中有12個(gè)至少出現(xiàn)在訓(xùn)練好的模型最終特征集中的60%（15/25）。
       基于腸道菌群的分類器在區(qū)分RBD和RBD-FDR方面也表現(xiàn)出良好的性能，在測(cè)試集中的平均準(zhǔn)確率為0.67（[ 95% CI ] = [ 0.66，0.69 ]），AUC為0.72（[ 95% CI ] = [ 0.69，0.74 ]，圖4d）。

圖4 隨機(jī)森林模型預(yù)測(cè)RBD狀態(tài)

5、宿主因素對(duì)α-突觸核蛋白病前驅(qū)和早期的微生物群有影響
       進(jìn)一步，作者檢測(cè)了宿主因素對(duì)α-突觸核蛋白病不同階段微生物變化的影響。評(píng)估社會(huì)人口學(xué)（年齡和性別）、BMF評(píng)分和對(duì)微生物群具有混雜效應(yīng)的藥物（包括抗抑郁藥和苯二氮卓類藥物）。精神疾病與抗抑郁藥物使用（卡方檢驗(yàn)，P值= 5.3 × 10-22）高度相關(guān)，不作為協(xié)變量納入。建立包括每對(duì)分組和所有協(xié)變量的多元統(tǒng)計(jì)模型（PERMANOVA，99，999個(gè)置換），而PD特異性藥物（卡比多巴/左旋多巴、MAO-B抑制劑和多巴胺激動(dòng)劑）僅在涉及早期PD組的比較中進(jìn)行評(píng)估。在目前的模型中，作者仍然觀察到與對(duì)照（所有q值均< 0.001）相比，RBD和早期PD中的微生物組成發(fā)生了顯著的變化。除分組因素外，BMF評(píng)分、性別、滲透性瀉劑和質(zhì)子泵抑制劑（PPIs）使用等協(xié)變量與微生物組成的相關(guān)性較強(qiáng)，而年齡、他汀類藥物、抗抑郁藥、苯二氮卓類藥物和PD特異性藥物對(duì)組成變化的影響較小（圖5b）。
       應(yīng)用Ma As Lin 2檢驗(yàn)分類單元豐度與協(xié)變量的相關(guān)性。模型包括四個(gè)階段（參照=對(duì)照）和所有協(xié)變量作為固定效應(yīng)，家庭id作為隨機(jī)效應(yīng)。此外，對(duì)早期PD組的分類群豐度進(jìn)行單獨(dú)建模，以評(píng)估單個(gè)分類群對(duì)PD特異性藥物的反應(yīng)。將Ma As Lin 2檢驗(yàn)得到的顯著關(guān)聯(lián)（q值< 0.25）繪制在圖5a中。作者發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CH3(CH2)2COOH菌（如毛螺菌屬、[真細(xì)菌]_Ventriosum_group、Butyricicoccus等）的耗竭在RBD和早期PD中仍然顯著。同樣，與對(duì)照相比，RBDFDR中柯林斯菌屬增加，[真細(xì)菌]_Ventriosum_group顯著減少。在協(xié)變量方面，BMF得分與分類單元豐度之間的關(guān)聯(lián)是廣泛的，類似于疾病進(jìn)展。特別是BMF（較慢的結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)）得分較高與Butyricicoccus（β=-0.34，q值= 0.009）和Oscillospiraceae_UCG-005（β = 0.32，q值= 0.003）豐度較低和較高分別與強(qiáng)相關(guān)（圖5a-c）。特別地，作者觀察到在作者的數(shù)據(jù)中抗抑郁藥的使用和RBD /早期PD富集的屬（例如Akkermansia和UBA1819）有很強(qiáng)的共現(xiàn)性（圖5c）。

圖5 α-突觸核蛋白病前驅(qū)和早期宿主-微生物組相互作用

6、便秘（排便頻率）介導(dǎo)菌群對(duì)α-突觸核蛋白病的影響
       既往研究提示腸道菌群失調(diào)與便秘之間存在雙向因果關(guān)系30。考慮到即使在調(diào)整了排便頻率后，RBD和RBD-FDR中不同的微生物變化仍然存在，作者進(jìn)一步假設(shè)便秘可能并不完全是一個(gè)混雜因素，而是連接腸道微生物群和α-突觸核蛋白病的潛在因果通路中的一個(gè)中介因素。因此，作者在控制、RBD-FDR和RBD患者（n = 405）中進(jìn)行了中介分析。以前驅(qū)期PD（排除RBD、便秘等條目）的總似然比為結(jié)局，第一主成分（由PCo A分析得）的值和BMF score分別為暴露和中介建立模型。作者發(fā)現(xiàn)大約30%的腸道菌群對(duì)前驅(qū)期PD的總效應(yīng)通過(guò)中介物（即BMF評(píng)分），表明了從腸道菌群失調(diào)、便秘到α-突觸核蛋白病的潛在因果關(guān)系方向（圖6）。

圖6 排便頻率的中介作用

7、前驅(qū)期和早期α-突觸核蛋白病的微生物代謝變化
       最后，作者使用PICRUSt2（通過(guò)重建未觀測(cè)狀態(tài)對(duì)群落進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究）分析來(lái)識(shí)別在α-突觸核蛋白病前驅(qū)期和早期階段存在差異的MetaCyc通路?？唆斔箍? Wallis檢驗(yàn)顯示四組（q值< 0.05）之間有18條代謝通路存在顯著差異。與之前在PD患者中的研究結(jié)果一致，作者觀察到在前驅(qū)期和早期α-突觸核蛋白?。碦BD或早期PD）（MaAsLin2，q值< 0.05）中，短鏈脂肪酸代謝（發(fā)酵產(chǎn)乳酸、乙醇和乙酸）和碳水化合物生物合成途徑富集，而輔因子和維生素生物合成（B1、B2、B12）減少。
       進(jìn)一步的多變量關(guān)聯(lián)分析顯示，前驅(qū)期和早期α-突觸核蛋白病中碳水化合物生物合成的富集似乎受到BMF評(píng)分、年齡和他汀類藥物使用的顯著影響。類似地，B族維生素合成途徑的耗竭與性別、苯二氮卓類藥物和滲透性瀉劑使用密切相關(guān)。然而，在RBD-FDR、RBD和早期PD中，改變的微生物脂肪酸代謝（SCFA轉(zhuǎn)化為乳酸和乙醇）和pre Q0生物合成（7-去氮嘌呤生物合成），即使在調(diào)整了所有潛在的協(xié)變量后，仍然相對(duì)于對(duì)照顯著。此外，與RBD-FDR組相比，對(duì)照組中維生素B12生物合成的補(bǔ)救途徑和從頭合成途徑顯著富集。

圖7 前驅(qū)期和早期α-突觸核蛋白病的微生物代謝變化

實(shí)驗(yàn)方法
16S V3-V4 rRNA數(shù)據(jù)處理，差異豐度分析，Random forest classification，宿主-微生物相互作用分析，Mediation analysis，16S標(biāo)記序列的功能預(yù)測(cè)
參考文獻(xiàn)
Huang B, Chau SWH, Liu Y, Chan JWY, Wang J, Ma SL, Zhang J, Chan PKS, Yeoh YK, Chen Z, Zhou L, Wong SH, Mok VCT, To KF, Lai HM, Ng S, Trenkwalder C, Chan FKL, Wing YK (2023) Gut microbiome dysbiosis across early Parkinson's disease, REM sleep behavior disorder and their first-degree relatives. Nat Commun.;14(1):2501. doi: 10.1038/s41467-023-38248-4.