聯(lián)合scRNA-seq、MeRIP-Eseq、RNA-seq和Ribo-Eseq，7張圖為你揭示M6A閱讀器YTHDF1在抗結(jié)直腸癌免疫中的作用
N6-α-甲基腺苷（m6 A）是最豐富的RNA修飾之一，每個mRNA分子上估計有3-5個m6 A位點。M6A的甲基化修飾是甲基化轉(zhuǎn)移酶，去甲基化，甲基化閱讀蛋白共同參與。YTHDF1在m6A修飾中是作為甲基化閱讀器，已經(jīng)在許多研究中被證明YTHDF 1的上調(diào)與各種癌癥類型中的不良預后相關(guān)。本研究中，作者首先發(fā)現(xiàn)了YTHDF1表達與IFN-γ的表達和CD8+T細胞浸潤呈負相關(guān)，暗示了YTHDF1在結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中的作用。通過在腫瘤模型上驗證和scRNA-seq、MeRIP-Eseq、RNA-Eseq和Ribo-Eseq，證明了通過m6A-p65-CXCL 1/CXCR2軸抑制抗腫瘤免疫以促進結(jié)腸癌進展。該研究于2023年1月發(fā)表在《Gut》上，IF：24.5。
主要研究結(jié)果
1.YTHDF1與結(jié)腸癌預后不良相關(guān)以及單細胞測序揭示YTHDF1介導的免疫抑制
在80%以上的結(jié)腸癌（CRC）中，YTHDF1都表現(xiàn)為明顯的升高，暗示YTHDF1在促進CRC中起作用。為了建立抗腫瘤免疫與m6 A調(diào)節(jié)子之間的聯(lián)系，分析m6A調(diào)節(jié)子與IFN-γ應(yīng)答基因和CD8+T細胞浸潤之間的相關(guān)性，通過TCGA數(shù)據(jù)庫以及組織芯片染色分析，發(fā)現(xiàn)YTHDF 1與IFN-γ應(yīng)答途徑和CD8+T細胞浸潤呈顯著負相關(guān)（圖A、B和C）。為了研究YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用，研究者使用CRISPR-cas9系統(tǒng)敲除MC38鼠MSI-casH CRC細胞中的YTHDF1（YTHDF1-cas9 KO），并將細胞注射到同基因C57BL6小鼠中（圖1D）。與對照相比，通過敲除YTHDF1l降低了腫瘤體積和重量（圖1E）。從腫瘤中分離CD45+免疫細胞并進行單細胞RNA-seq（scRNA-seq）。與NC組相比，具有YTHDF1-KO的腫瘤表現(xiàn)出粒細胞髓系-衍生的抑制細胞（G-MDSC，簇3）和嗜中性粒細胞的顯著減少（圖1F）。進一步將T細胞和NK細胞重新聚類為CD4+T、CD8+T、NKT和NK細胞亞群，與對照相比，它們在YTHDF11-KO腫瘤中同時增加（圖1F）。檢查了MDSC的功能標志物Illb、Arg2、Cxcr2和Ccr2，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在MDSC簇（簇3和簇4）中，特別是來自YTHDF1未敲除的腫瘤（圖1G）。通過流式細胞術(shù)測定MC38同基因小鼠中腫瘤浸潤免疫細胞的組成。我們證實YTHDF1敲除顯著抑制腫瘤重量和體積（圖1C），并且流式細胞術(shù)揭示YTHDF1敲除減少MDSC，但增加腫瘤中的CD8+T和CD4+T細胞（圖1H，I）。在MDSC中，G-MDSC是主要的亞群，并且YTHDF1的敲除導致G-MDSC的顯著減少（圖1 I）。這些結(jié)果證明了YTHDF1在CRC中的免疫抑制功能。
圖1：YTHDF1與CRC患者中的免疫微環(huán)境相關(guān)
2.YTHDF1敲除減少了MDSCs細胞并增加了細胞毒性T的浸潤
接下來在CT26（MSS-CRC小鼠模型）中用YTHDF1-KO進行實驗以驗證YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用。如所預期的，YTHDF1-KO導致CT 26同基因小鼠中腫瘤體積和重量減少（圖2A和B），以及功能性T細胞減少和MDSC積累減少（圖2C和D）。免疫熒光染色證實了在YTHDF1敲除后MC38和CT26同源腫瘤中MDSC（CD11b +Gr-b1+）的浸潤減少（圖2 E）?？偟膩碚f，CRC細胞中的YTHDF1耗竭減少MDSC并增加功能性T細胞浸潤。這些發(fā)現(xiàn)與臨床數(shù)據(jù)一致，表明YTHDF1與CD8+T細胞和IFN-γ相關(guān)特征呈反相關(guān)。YTHDF1-KO中減弱的腫瘤形成是否依賴于CD8+ T細胞抗腫瘤免疫。為了解決這一點，又在MC38同基因模型中用抗CD8抗體耗盡CD8+T細胞。與上面的假設(shè)一致，CD8+T細胞的消耗恢復了YTHDF1-KO腫瘤的生長（圖2F和G），表明YTHDF1-KO的腫瘤抑制功能至少部分依賴于CD8+T細胞。這CT26同基因小鼠中得到證實，顯示抗CD8抗體治療挽救了YTHDF1-KO組中停滯的腫瘤生長（圖2 H，I）?？傊琘THDF1敲除通過誘導CD8+T細胞依賴性抗腫瘤免疫抑制CRC生長。
圖2：YTHDF1敲除增加了MDSC和功能性T細胞來誘導抗腫瘤免疫
3.腸特異性YTHDF1基因敲入促進小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫
利用腸特異性YTHDF1敲入小鼠（YTHDF1loxp/loxp CDX2-cre），并通過AOM/DSS處理在這些小鼠中引發(fā)CRC（圖3A）。發(fā)現(xiàn)YTHDF1的過表達導致AOM/DSS模型中結(jié)腸腫瘤數(shù)量和大小增加（圖3C）。流式細胞術(shù)顯示與野生型小鼠相比，YTHDF1敲入小鼠的結(jié)腸腫瘤中MDSC浸潤增加以及NK、CD4+T和CD8+T細胞減少（圖3D）。此外，還發(fā)現(xiàn)YTHDF1敲入降低了功能性T細胞的比例，如通過顆粒酶B、INF-γ和TNF-α表達所鑒定的（圖3E）。為了驗證ApcMin/+驅(qū)動的自發(fā)性CRC中的上述結(jié)果，又構(gòu)建了ApcMin/+ YTHDF1loxp/loxpCDX2-cre小鼠模型，同樣的，發(fā)現(xiàn)YTHDF1敲入的ApcMin/+小鼠中結(jié)腸腫瘤數(shù)量和大小增加（圖3B）。腫瘤浸潤性免疫細胞顯示在具有ApcMin/+的腫瘤中NK、CD4+T和CD8+T細胞的浸潤顯著降低，同時敲入YTHDF1，并誘導MDSC（圖3F）。此外，YTHDF1敲入減少ApcMin/+小鼠中的顆粒酶B+、INF-γ+或TNF-α+ T細胞（圖3G）?？偟膩碚f，這些結(jié)果支持YTHDF 1促進促進自發(fā)性CRC的免疫抑制微環(huán)境。
圖3：YTHDF 1敲入促進小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫
4.通過VNP-siYTHDF 1靶向YTHDF1增強CD34+人源化小鼠的抗腫瘤免疫
構(gòu)建CD34+人源化小鼠模型（圖4A）。為了在體內(nèi)靶向YTHDF1，開發(fā)了攜帶針對YTHDF 1的siRNA的VNPs 。在腫瘤達到50-100 mm3后，用VNP-siNC或-siYTHDF 1處理攜帶人CRC HCT116異種移植物的人源化NSG小鼠（圖4 B）。與VNP-siNC相比，VNP-siYTHDF 1顯著抑制腫瘤體積和重量（圖4 B、C）。還進行流式細胞術(shù)以分析腫瘤微環(huán)境（圖4D）。VNP-siYTHDF1減少MDSC浸潤，但增加CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞積累（圖4 E）。此外，在接受VNP-siYTHDF1的腫瘤中鑒定出更多的IFN-γ+、TNF-α+和顆粒酶B+ 、CD 8+T細胞（圖4 E）。因此，使用VNP-siYTHDF1靶向YTHDF 1是增強人源化小鼠中抗腫瘤免疫力的有效的手段。
圖4：VNP-siYTHDF1增強CD34+人源化小鼠中的抗腫瘤免疫
5.YTHDF 1促進p65翻譯激活TNF/NF-κB信號轉(zhuǎn)導
在敲除或未敲除YTHDF1的CRC細胞中進行了RNA-seq和Ribo-seq。通過RNA-seq分析，NC和YTHDF1-KO的MC38和CT26細胞之間差異表達的基因在TNF和NF-κB信號傳導途徑中富集。此外，Ribo-seq數(shù)據(jù)揭示YTHDF1的缺失與TNF信號傳導的失活顯著相關(guān)（圖5A）。由于YTHDF1作為m6A閱讀器起作用，接下來進行m6A免疫沉淀測序（MeRIP-seq）以精確定位m6A-seq修飾的轉(zhuǎn)錄物。通過篩選參與TNF信號傳導的mRNA中的m6A峰，鑒定了兩個接近p65 mRNA終止密碼子的m6A位點（圖5 B），并通過MeRIP-qPCR驗證（圖5C）。通過RIP-seq和使用抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR鑒定了YTHDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5D）。敲除YTHDF1可減弱CT26和MC38細胞中p65蛋白表達，尤其是核p65表達，而不影響NF-κB通路的其他調(diào)節(jié)因子如IKKα和IκBα的表達（圖5E）。在人CRC細胞中，顯示野生型YTHDF 1的過表達，升高p65蛋白表達，相反地，YTHDF1敲低減弱人CRC細胞中的p65蛋白（圖5 F）。使用抗YTHDF1抗體的RIP-α qPCR也證實了人CRC細胞中YTHDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5G）。驗證YTHDF1和p65在體內(nèi)的關(guān)聯(lián)，將YTHDF1敲入小鼠中，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腫瘤中p65和磷酸化p65蛋白均增加（圖5 H）?？傊?，上述的實驗證明了YTHDF1促進p65蛋白的表達，以激活TNF和NF-κB信號傳導。
圖5：YTHDF1通過促進p65mRNA翻譯促進CRC中的TNF/NF-κ B信號傳導
6.YTHDF1通過p65-CXCL 1軸促進MDSC遷移
進行細胞因子多重免疫測定，檢測CRC細胞、腫瘤裂解物和來自攜帶同基因腫瘤的小鼠的血清的條件培養(yǎng)基中的23種不同的小鼠細胞因子。在這些細胞因子中，CXCL1在YTHDF1-KO組中一致地減少（圖6A和B）。進行體外MDSC 迀移測定，發(fā)現(xiàn)來自野生型CRC細胞的條件培養(yǎng)基增強MDSC迀移（圖6C）。通過CXCR2抑制劑阻斷CXCL1/CXCR2相互作用，發(fā)現(xiàn)消除了對照和YTHDF1-KO培養(yǎng)物上清液在介導MDSC迀移方面的差異（圖6C）。另外，YTHDF1敲除顯著抑制鼠的CXCL1 mRNA水平（圖6D）。接下來研究了YTHDF1是否影響MDSC功能。從MC38同基因腫瘤中分離CD11b+Gr- 1+ MDSC，然后與T細胞體外共培養(yǎng)（圖6 E）。從對照腫瘤分離的MDSC抑制T細胞增殖。然而，與來自對照的MDSC相比，來自YTHDF1-KO腫瘤的MDSC對CD8+T細胞和CD4+T細胞的增殖表現(xiàn)出顯著更低的抑制活性（圖6 F和G），支持表達表達YTHDF1的CRC募集功能性MDSC。
圖6：YTHDF1通過調(diào)節(jié)CXCLl分泌介導MDSC的遷移
7.YTHDF1是結(jié)直腸癌免疫治療的潛在治療靶點
在小鼠中對YTHDF1的敲除，發(fā)現(xiàn)增強了抗PDl在MC38微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MS1- H）同基因腫瘤中的功效，并延長了荷瘤小鼠的存活期（圖7A）。當MC38同系腫瘤達到50~100 mm3時，用VNP-siYTHDF1（或VNP-siNC）和抗PD 1處理（或IgG）處理小鼠。與VNP-A siNC相比，VNP-siYTHDF1顯著抑制MC38腫瘤生長（圖7 B和C）。值得注意的是，VNP-siYTHDF1加抗PDl的組合對腫瘤生長發(fā)揮最強的抑制作用（圖7 B和C）?；谕駽T26（MSS-CRC）腫瘤模型，進一步解決了靶向YTHDF1是否可以克服MSS-CRC中的抗PD1抗性。因此，將具有YTHDF1敲除的CT26細胞注射到同基因小鼠中并用抗PDl處理。發(fā)現(xiàn)YTHDF1的敲除顯著增強了CT26同基因腫瘤中的抗PDl治療功效（圖7 D和E）。流式細胞術(shù)分析進一步揭示，在CT26和MC38同基因模型中，YTHDF1沉默和抗PDl的組合顯著增加腫瘤浸潤功能性CD8+T細胞，包括IFN-γ+ CD8+T細胞和顆粒酶B+ CD8+T細胞（圖7 F和G）。此外，組合治療顯著減少MDSC的積累，而誘導CD4+T細胞和CD8+T細胞（圖7 G）。因此，這些結(jié)果表明YTHDF1的靶向不僅增強MSI-H CRC中的ICB治療功效，而且還通過抑制MDSC的募集和改善CD8+T細胞的功能性來克服MSS-CRC中的ICB抗性。
圖7：YTHDF1增強了CRC中的抗PD 1阻斷療法
結(jié)論
綜上所述，CRC中的YTHDF1表達通過激活m6A-p65-pCXCL1軸來募集免疫抑制性MDSC以抑制T細胞，從而促進CRC。靶向YTHDF1加抗PD 1治療顯示出針對CRC的抗腫瘤功效，證實YTHDF1是CRC的潛在治療靶標。
實驗方法
臨床樣本收集和收集細胞，TCGA數(shù)據(jù)分析，組織芯片，單細胞測序，AOM/DSS小鼠模型，Apcmin/+小鼠模型，人源化小鼠模型，RNA-seq，Rio-seq，MeRIP-seq，測序結(jié)果生信分析，多重小鼠細胞因子免疫測定，ELISA，transwell，western blot，RT-qPCR，. VNP-siNC和 VNP-siYTHDF1載體構(gòu)建，細胞轉(zhuǎn)染，流式細胞術(shù)，體內(nèi)成瘤實驗。
參考文獻
Bao Y, Zhai J, Chen H, Wong CC, Liang C, Ding Y, Huang D, Gou H, Chen D, Pan Y, Kang W, To KF, Yu J. Targeting m6A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer. Gut. 2023 Aug;72(8):1497-1509. doi: 10.1136/gutjnl-2022-328845. Epub 2023 Jan 30. PMID: 36717220.