T細(xì)胞耗竭經(jīng)久不衰的熱點(diǎn)：Runx3?DNA甲基化的作用

       以PD-1或PD-L1抗體治療為代表的檢查點(diǎn)阻斷免疫療法在臨床實(shí)踐中取得了巨大的成功。然而，低的臨床反應(yīng)率和缺乏預(yù)測(cè)免疫反應(yīng)的生物標(biāo)志物限制了抗PD-1免疫療法的臨床應(yīng)用。作者此前發(fā)現(xiàn)低劑量DAC和PD-1-ab的聯(lián)合治療可以顯著提高cHL患者的完全反應(yīng)（CR）率，從32%提高到71%，這表明表觀遺傳調(diào)控和免疫治療的臨床反應(yīng)之間存在著明顯的相關(guān)性。本文證明Runx3的DNA甲基化在DAC刺激的PD-1-ab免疫治療過程中對(duì)CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)和分化起著關(guān)鍵作用，這為外調(diào)在免疫治療中的重要作用提供了一個(gè)支持機(jī)制。本文于2023年5月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF:37.3雜志上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、臨床樣本組學(xué)分析揭示抗PD-1/DAC免疫治療引發(fā)CD8+ T細(xì)胞的大規(guī)模甲基化重編程
       作者招募了兩組患者，分別接受抗PD -1和抗PD -1/DAC (DP)治療。按照工作流程進(jìn)行DNA甲基化EPIC和RNA-seq（Fig. 1a）。為探索患者CD8+ T細(xì)胞的DNA甲基化重編程譜，獲得了抗PD -1治療患者和預(yù)處理DAC患者的CD8+ T細(xì)胞的DNA甲基化譜（Fig. 1a）。與抗PD -1治療患者比較，在DAC刺激的抗PD-1治療的患者中檢測(cè)到大規(guī)模的去甲基化，并評(píng)估了與治療相關(guān)的臨床反應(yīng)（Fig. 1a-c）。此外，確定了295個(gè)低甲基化的差異DNA甲基化位點(diǎn)（DMSs），而高甲基化的DMSs數(shù)量為951，發(fā)現(xiàn)在DP聯(lián)合治療組中，低甲基化位點(diǎn)的數(shù)量明顯增加（Fig. 1d）。
       為了進(jìn)一步探索DNA甲基化重編程的動(dòng)態(tài)特征及其與臨床結(jié)果的相關(guān)性，比較了C1D6（DAC治療后5天）階段與C1D0（治療前基線）階段以及C2D0（抗PD-1治療一個(gè)周期后）階段與C1D6（DAC治療后5天）階段的DMSs。結(jié)果顯示，DAC治療后發(fā)生了大規(guī)模的去甲基化，相反，在PD-1阻斷單藥治療組沒有觀察到動(dòng)態(tài)的DNA甲基化重編程。此外，為確認(rèn)個(gè)別患者的DNA甲基化重編程，定量分析了每個(gè)患者的全基因組甲基化水平和差異性甲基化水平（Fig. 1e）。結(jié)果顯示，DP組所有患者的所有CD8+T細(xì)胞在C2D0期間（抗PD-1治療一個(gè)周期后）都有明顯的去甲基化特征，這意味著DAC引起的去甲基化沒有表現(xiàn)出個(gè)體差異。此外，用統(tǒng)計(jì)分析法分析甲基化水平，在用抗PD-1與抗PD-1/DAC治療時(shí)，觀察到明顯的差異（Fig. 1f）。對(duì)DNA甲基化分布的分析顯示，在進(jìn)行抗PD-1/DAC治療時(shí)，高甲基化位點(diǎn)發(fā)生了明顯的DNA去甲基化（Fig.1g）。
       然后對(duì)DMSs進(jìn)行了Ingenuity Pathway分析，結(jié)果顯示DMSs主要富集在T細(xì)胞衰竭和T細(xì)胞激活相關(guān)的通路中，包括T細(xì)胞衰竭信號(hào)通路、Th1和Th2激活通路，以及NFAT在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用（Fig.1h）。此外，還分析了DP組CD8+T細(xì)胞的C2D0（抗PD-1治療一個(gè)周期后）與C1D0（治療前基線）的狀態(tài)。DMSs也主要富集在T細(xì)胞衰竭信號(hào)通路、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的CTLA4信號(hào)、干擾素信號(hào)和干擾素信號(hào)中（Fig.1h）。上述結(jié)果表明，DAC治療可能導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭的逆轉(zhuǎn)，增強(qiáng)T細(xì)胞的激活和浸潤(rùn)。

圖1 DAC可以引發(fā)CD8+ T細(xì)胞的大規(guī)模重編程

2、Runx3是低劑量抗PD-1/DAC免疫治療改善臨床反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)
       為研究DNA甲基化重編程是否與基因表達(dá)相關(guān)，作者進(jìn)行了RNA-Seq并分析了CD8+T細(xì)胞的表達(dá)譜。結(jié)果顯示，兩組CD8+T細(xì)胞中存在大量的差異表達(dá)基因（DEGs）。如火山圖所示，DEGs的表達(dá)倍數(shù)變化在C2D0（抗PD-1治療一個(gè)周期后）時(shí)期明顯增加（Fig. 2a）。通過分析DP組的差異，比較C2D0（抗PD-1治療一個(gè)周期后）與C1D0（治療前的基線），發(fā)現(xiàn)CCR2、TNFSF14和TNFSF4等基因下調(diào)，CCL3、TIGIT IFNG和CD69等基因上調(diào)，CCR3和CCR5等細(xì)胞因子在DAC治療后明顯上調(diào)，而TOX在DAC治療后則下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，耗竭T細(xì)胞可以被DAC逆轉(zhuǎn)，即與浸潤(rùn)相關(guān)的細(xì)胞因子被DAC上調(diào)，而不是被抗PD-1上調(diào)。進(jìn)一步進(jìn)行IPA途徑富集分析（Fig. 2b）來探索這些發(fā)現(xiàn)可能的生物學(xué)意義。結(jié)果顯示，這些差異在T細(xì)胞衰竭途徑、Th1和Th2激活途徑和T細(xì)胞受體途徑中富集，這與DNA甲基化分析中DMSs的富集結(jié)果高度一致。通過tSNE分析，發(fā)現(xiàn)抗PD-1治療后的CD8+T細(xì)胞由兩個(gè)不同的群體組成（Fig. 2c）。
       通過對(duì)DEGs和DMSs的多組學(xué)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)有3729個(gè)基因在DNA甲基化和表達(dá)譜方面有交集（Fig. 2d）。通過通路分析，發(fā)現(xiàn)這些通路主要富集在T細(xì)胞激活的調(diào)控、免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號(hào)、免疫系統(tǒng)發(fā)育和白細(xì)胞細(xì)胞粘附通路的調(diào)控等方面，這表明DP的組合可能在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、激活和對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)中起核心作用。
       由于DMSs和DEGs之間的一致性，作者對(duì)這兩個(gè)omics數(shù)據(jù)集進(jìn)行了聯(lián)合分析。發(fā)現(xiàn)Runx3是受調(diào)控最明顯的基因。用DAC治療后，所有CR患者的Runx3啟動(dòng)子上都保持穩(wěn)定的去甲基化水平和Runx3的高表達(dá)水平（Fig. 2e）。DNA甲基化和表達(dá)的相關(guān)性被證實(shí)（Fig. 2f）。以上數(shù)據(jù)表明在DAC刺激的抗PD-1治療過程中，Runx3啟動(dòng)子的表觀遺傳重編程在調(diào)控Runx3表達(dá)方面起著關(guān)鍵作用。

圖2 CD8 + T細(xì)胞的表達(dá)譜和多組學(xué)分析確定了DAC對(duì)CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的重要信號(hào)通路

3、在小鼠體內(nèi)DAC治療促進(jìn)T細(xì)胞的浸潤(rùn)，并下調(diào)T細(xì)胞的衰竭程度
       為進(jìn)一步研究DAC免疫療法 "表觀遺傳致敏 "作用的內(nèi)在機(jī)制，作者旨在在小鼠身上重現(xiàn)臨床觀察。為建立體內(nèi)小鼠模型，將MC38細(xì)胞植入C57BL/6小鼠，在指定時(shí)間用DAC、抗PD-1或抗PD-1/DAC治療，模擬患者的臨床情況（Fig. 3a）。如Fig. b-c所示，在MC38腫瘤移植小鼠中，發(fā)現(xiàn)DAC聯(lián)合抗PD-1明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)TILs的浸潤(rùn)。在MC38模型中，抗PD-1治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用不明顯，但DAC和抗PD-1的聯(lián)合治療明顯抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀分析CD8+T細(xì)胞的功能。如Fig. 3c所示，增殖型T細(xì)胞的比例明顯增加（ki67+CD8+T）。殺傷性（GranB+CD8+T，proferin+CD8+T）和分泌性細(xì)胞（IFN-γ+CD8+T）細(xì)胞的比例也明顯提高。
       結(jié)果還顯示，Runx3的DNA甲基化狀態(tài)在DAC-和DAC/抗PD-1處理的小鼠CD8+T細(xì)胞中明顯下降，但在WT和抗PD-1處理的小鼠CD8+T細(xì)胞中沒有下降（Fig. 3d）。為探索外周免疫系統(tǒng)和腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)，檢查了淋巴結(jié)、脾臟、外周血和腫瘤中T細(xì)胞的數(shù)量和功能。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的血液、脾臟和淋巴腺中的CD3+T細(xì)胞數(shù)量減少。聯(lián)合治療中，CD8+T細(xì)胞在脾臟和血液中的數(shù)量減少，在淋巴腺中的數(shù)量增加。這表明腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的增殖、殺傷和分泌干擾素的能力都明顯增強(qiáng)，表明腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞功能的整體恢復(fù)（Fig. 3c）。流式細(xì)胞儀顯示，當(dāng)細(xì)胞用DAC處理時(shí)，Runx3+CD8+T細(xì)胞的比例比用抗PD-1處理時(shí)增加得更多，當(dāng)細(xì)胞同時(shí)用DAC和抗PD-1處理時(shí)達(dá)到峰值（Fig. 3D）。

圖3 DAC通過去甲基化Runx3和促進(jìn)Runx3表達(dá)，下調(diào)T細(xì)胞衰竭和上調(diào)T細(xì)胞浸潤(rùn)

4、條件敲除Runx3證明Runx3對(duì)于DAC發(fā)揮抗PD-1耐藥的“表觀遺傳增敏劑”作用是必不可少的
       為排除Runx3在腫瘤細(xì)胞中的抗腫瘤作用，構(gòu)建了條件敲除小鼠，以證明Runx3在T細(xì)胞和免疫治療中的特異性功能。Runx3 flox小鼠是通過基于CRISPR/Cas9的方法產(chǎn)生的。用CRISPR設(shè)計(jì)工具（http://www.sanger.ac.uk/）設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNAs，針對(duì)小鼠Runx3的NM_019732.2轉(zhuǎn)錄本第4外顯子的上游或下游區(qū)域。通過隨后與Lck-cre小鼠的雜交和基因型鑒定，最終構(gòu)建了Runx3^{fl/fl;Lck-Cre}小鼠。Runx3^fl/fl小鼠在體重和發(fā)育方面沒有表現(xiàn)出差異。沒有觀察到自身免疫性疾病。然后，Runx3^fl/fl和Runx3^{fl/fl;Lck-Cre}小鼠都被分為三組：對(duì)照組、抗PD-1治療組和抗PD-1/DAC治療組（Fig. 4a）。
Runx3^{fl/fl;Lck-Cre}小鼠的抗腫瘤免疫力下降（Fig. 4a，b）。在對(duì)照組Runx3^fl/fl小鼠中，抗PD-1組和DAC/抗PD-1組之間有顯著差異（Fig. 4c，d）。此外，在Runx3^{fl/fl;Lck-Cre}小鼠中，DAC刺激的抗PD-1組和抗PD-1組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線沒有顯著差異。腫瘤體積和質(zhì)量沒有明顯差異，這表明條件性敲除Runx3基因后，DAC的影響被消除了。
       為進(jìn)一步研究Runx3在CD8+T細(xì)胞中的作用，作者應(yīng)用單細(xì)胞流式質(zhì)譜分析（CyTOF），發(fā)現(xiàn)CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）的比例，發(fā)生了明顯變化。綜合分析表明，Runx3增加了T^eff和T^RM細(xì)胞的比例，干擾了免疫細(xì)胞亞型的平衡（Fig. 4c, d）。

圖4 免疫治療的表觀遺傳增敏作用在Runx3 ^{fl/fl;Lck-Cre}小鼠中被消除

5、Runx3在T細(xì)胞浸潤(rùn)和效應(yīng)和記憶T細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并具有削弱T細(xì)胞衰竭的功能
       腫瘤免疫治療由T細(xì)胞功能反應(yīng)的多個(gè)步驟組成。首先，T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞，然后是記憶T細(xì)胞，以發(fā)揮抗腫瘤功能。其次，T細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤中以殺死腫瘤細(xì)胞是至關(guān)重要的。腫瘤微環(huán)境中缺乏免疫細(xì)胞是反應(yīng)低下的一個(gè)重要原因。第三，T細(xì)胞經(jīng)常處于衰竭或功能障礙狀態(tài)，T細(xì)胞的衰竭也會(huì)影響PD-1抗體反應(yīng)率。為闡明Runx3的具體作用，進(jìn)行CyTOF來比較條件性敲除小鼠和對(duì)照小鼠的T細(xì)胞功能。采用42種標(biāo)記物，涵蓋了細(xì)胞因子、T細(xì)胞衰竭標(biāo)記物、T細(xì)胞增殖和T細(xì)胞殺傷能力。由于觀察到DAC治療后CCR明顯增加，而且發(fā)現(xiàn)DAC促進(jìn)T細(xì)胞在小鼠模型中的浸潤(rùn)，因此在這42個(gè)標(biāo)志物中包括了幾個(gè)CCR。
       首先，觀察到Runx3缺乏的小鼠外周血、脾臟、腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的明顯下調(diào)（Fig. 5a, b）。此外， Runx3的缺失明顯下調(diào)CCR3和CCR5，從而影響了T細(xì)胞的浸潤(rùn)（Fig. 5c）。Runx3的缺乏也通過影響T細(xì)胞分化和T細(xì)胞衰竭而損害T細(xì)胞功能（Fig. 5d）。觀察到Lag3、Tim3和CTAL4的水平增加，但I(xiàn)FNγ、TNFα和IL-2的水平下降。有趣的是，沒有發(fā)現(xiàn)Runx3缺陷的小鼠中PD-1的水平增加。以前的工作表明，PD-1只在T細(xì)胞被激活后表達(dá)，而Runx3缺陷明顯下調(diào)效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，這反過來可能平衡PD-1的表達(dá)水平以增加耗竭的T細(xì)胞。
       在對(duì)照組Runx3^fl/fl小鼠中，發(fā)現(xiàn)DAC聯(lián)合PD-1抗體促進(jìn)了T細(xì)胞的浸潤(rùn)和TILs的分泌能力（IFN，TNF-α）。增殖能力（Ki67）和殺傷能力（GranB、Perforin等）明顯增加，這種促進(jìn)作用在使用DAC后明顯增強(qiáng)。對(duì)于Runx3基因敲除的小鼠，T細(xì)胞的分泌、增殖和殺傷能力受到抑制，表明Runx3可能是DAC表觀遺傳致敏功能的關(guān)鍵媒介（Fig. 5c, e）。

圖5 Runx3缺失阻礙ccr的表達(dá)和CD8+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)

6、Runx3預(yù)測(cè)抗PD-1免疫療法在一系列腫瘤類型中的反應(yīng)
       作者認(rèn)為研究Runx3水平是否能預(yù)測(cè)抗PD-1的免疫反應(yīng)將是有趣的。免疫療法已經(jīng)改變了各種腫瘤的治療格局，并在一些難治性腫瘤中表現(xiàn)出持久的反應(yīng)率，然而在一些接受治療的患者中卻出現(xiàn)了無反應(yīng)性和嚴(yán)重的免疫相關(guān)副作用。因此，迫切需要生物標(biāo)志物來篩選能從免疫療法中受益的人。從此前的臨床研究中，作者發(fā)現(xiàn)，Runx3的表達(dá)與臨床反應(yīng)之間有很強(qiáng)的相關(guān)性（Fig. 6a）。ROC曲線是評(píng)估生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)性能的一個(gè)有用的圖形工具（Fig.6a），表明生物標(biāo)志物小組可以區(qū)分兩組：反應(yīng)組和非反應(yīng)組。繪制了Runx3與臨床反應(yīng)的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)Runx3水平可以關(guān)鍵性地預(yù)測(cè)臨床反應(yīng)。Fig. 6b顯示，Runx3水平與效應(yīng)T細(xì)胞水平和記憶T水平相關(guān)，而不是整體CD8+T細(xì)胞水平。因此，Runx3通過影響功能分化而不是CD8+T細(xì)胞的整體水平，對(duì)臨床ICB反應(yīng)做出貢獻(xiàn)。上述數(shù)據(jù)表明，功能性T細(xì)胞的數(shù)量，而不是T細(xì)胞的整體水平對(duì)臨床反應(yīng)起著重要作用。
       作者探索了TISIDB數(shù)據(jù)庫，分析了Runx3水平和抗PD-1治療的臨床預(yù)后的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)，Runx3水平與臨床預(yù)后和生存率有很好的相關(guān)性。在結(jié)直腸癌、乳腺癌和淋巴癌患者中，Runx3的高表達(dá)與抗PD-1治療方案的良好預(yù)后有關(guān)（Fig.6c）。這表明Runx3是抗PD-1免疫療法的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因素，也是預(yù)測(cè)預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，Runx3不僅是DAC和CD8+T細(xì)胞功能的關(guān)鍵媒介，也是臨床免疫反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。

圖6 Runx3是臨床免疫治療反應(yīng)的關(guān)鍵分子標(biāo)志物

       本研究證明Runx3的DNA甲基化在DAC刺激的PD-1-ab免疫療法中對(duì)CD8 + T細(xì)胞的浸潤(rùn)和分化起著關(guān)鍵作用，這為外調(diào)在免疫療法中的重要作用提供了一個(gè)支持機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)方法
構(gòu)建小鼠模型，DNA和RNA樣本制備，EPIC BeadChip methylation，RNA測(cè)序，Real-time PCR，MSRE-qPCR，小鼠荷瘤和藥物（Decitabine）處理以及免疫治療實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)（FACS），單細(xì)胞流式質(zhì)譜分析（CyTOF）。
參考文獻(xiàn)
Liu, Z., Li, X., Gao, Y. et al. Epigenetic reprogramming of Runx3 reinforces CD8?+?T-cell function and improves the clinical response to immunotherapy. Mol Cancer 22, 84 (2023). https://doi.org/10.1186/s12943-023-01768-0