不容錯(cuò)過的一區(qū)文章的架構(gòu)模式--阿爾茨海默病的神經(jīng)病理

       Amyloid-b（Ab）在阿爾茲海默癥（AD）中發(fā)揮著重要的作用，但一些促進(jìn)Ab生成和Ab寡聚物（Abo）神經(jīng)毒性的因素尚不清楚。作者發(fā)現(xiàn)，在AD患者和淀粉樣前體蛋白（APP）/早衰蛋白-l（PS1）小鼠中，Ras同源GTP酶激活蛋白ArhGAP11A基因的水平顯著升高。降低神經(jīng)元ArhGAP11A基因水平，不僅通過RhoA/ROCK/Erk信號(hào)通路降低APP、PS1、b-分泌酶（BACE1）的表達(dá)，抑制Ab生成，而且通過降低凋亡相關(guān)p53靶基因的表達(dá)，減輕Abo的神經(jīng)毒性。在APP/PS1小鼠中，特異性降低神經(jīng)元中的ArhGAP11A基因水平顯著減少Ab產(chǎn)生和斑塊沉積，改善神經(jīng)元損傷、神經(jīng)炎癥和認(rèn)知缺陷。此外，Abos通過激活E2F1增強(qiáng)ArhGAP11A基因在神經(jīng)元中的表達(dá)，進(jìn)而形成一個(gè)有害的循環(huán)。作者的研究結(jié)果表明ArhGAP11A基因可能參與AD的發(fā)病機(jī)制，降低ArhGAP11A基因的表達(dá)可能是一種很有前途的AD治療策略。本研究于2023年6月發(fā)表于期刊《Cell Reports》，IF：8.8。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1、ArhGAP11A水平在AD患者和APP/PS1小鼠中顯著升高
       為探討AD發(fā)展過程中可能存在的危險(xiǎn)因素，作者通過AD患者和健康老年人海馬的數(shù)據(jù)集（GEO數(shù)據(jù)庫）分析ArhGAP11A表達(dá)的變化。與健康年長患者相比，AD患者海馬體中ArhGAP11A mRNA水平顯著上升（圖1A）。為進(jìn)一步證實(shí)AD患者中ArhGAP11A表達(dá)的變化，作者測量了輕度認(rèn)知障礙（MCI）患者、AD患者和健康老年人血漿中的ArhGAP11A蛋白水平，健康組作為對照。MCI患者血漿中ArhGAP11A水平顯著高于對照組，并隨著AD的發(fā)展而顯著升高（圖1B）。與之一致的是，5月齡APP/PS1小鼠小鼠腦內(nèi)ArhGAP11A基因水平也顯著升高，早于小鼠的認(rèn)知缺陷，隨后ArhGAP11A基因水平隨著年齡的增長而顯著升高，而野生型（wild-type, WT）小鼠ArhGAP11A基因水平在測試周期內(nèi)無明顯變化（圖1C-D）。免疫組織化學(xué)（IHC）結(jié)果進(jìn)一步顯示，APP/PS1小鼠皮層神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中ArhGAP11A基因水平持續(xù)高于5月齡WT小鼠，并隨著年齡持續(xù)升高（圖1E-F），而小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中ArhGAP11A基因水平過低，無法通過IHC檢測。

圖1 ArhGAP11A水平在AD患者和APP/PS1小鼠中顯著升高

2、ArhGAP11A基因影響APP、PS1、BACE1表達(dá)及Ab生成
       為探究ArhGAP11A基因?qū)PP加工和Ab產(chǎn)生的影響，培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元，用攜帶ArhGAP11A基因short hairpin RNA（shRNA；sh-ArhGAP11A基因）或ArhGAP11A基因（LV-ArhGAP11A）的慢病毒感染原代皮層神經(jīng)元（圖2A）。在神經(jīng)元中下調(diào)ArhGAP11A基因的表達(dá)，APP、PS1和BACE1的水平分別顯著降低至48.2%、49.4%和32.7%（圖2A-B），在感染sh-ArhGAP11A基因的原代皮層神經(jīng)元中免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)（圖2C-2G）。與此一致，ArhGAP11A基因敲低使原代皮層神經(jīng)元中Ab42和Ab40的水平分別下降至49.9%和46.3%（圖2H）。
       為確定ArhGAP11A基因下調(diào)引起的Ab減少是由于APP、PS1和BACE1的合成減少還是降解增加，在原代皮層神經(jīng)元中加入CHX抑制蛋白合成，然后分析APP、PS1和BACE1蛋白水平。ArhGAP11A基因敲低不影響APP、PS1和BACE1的降解，但顯著降低原代皮層神經(jīng)元中APP、PS1和BACE1的mRNA水平（圖2I）。這些結(jié)果表明ArhGAP11A基因在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)了APP、PS1和BACE1的表達(dá)，但不影響蛋白的降解。

圖2 ArhGAP11A下調(diào)通過降低神經(jīng)元中APP、PS1和BACE1的表達(dá)來減少Ab的產(chǎn)生

3、ArhGAP11A通過RhoA/ROCK/Erk信號(hào)通路介導(dǎo)APP、PS1和BACE1轉(zhuǎn)錄
       為揭示ArhGAP11A基因介導(dǎo)APP、PS1和BACE1轉(zhuǎn)錄的潛在機(jī)制，作者首先檢測了ArhGAP11A基因?qū)ho-GTP成員RhoA-GTP、Rac1-GTP和Cdc42-GTP水平的影響。pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在N2a細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元中，敲低ArhGAP11A基因顯著誘導(dǎo)RhoA-GTP水平增加1.5-2倍，而不是Rac1-GTP或Cdc42-GTP水平增加1.5-2倍（圖3A-B），表明ArhGAP11A基因是RhoA的特異性GAP。
       然后，作者檢測了ArhGAP11A基因是否改變了APP、PS1和BACE1的轉(zhuǎn)錄因子SP1和c-Fos的水平。SP1是PS1和BACE1的重要轉(zhuǎn)錄因子，c-Fos磷酸化（p-c-Fos）與c-Jun和/或其他伴侶一起是APP的重要轉(zhuǎn)錄因子。ArhGAP11A基因敲低降低了p-c-Fos和SP1的水平，但沒有降低c-Jun磷酸化（p-c-jun）的水平（圖3C-D），而ArhGAP11A基因過表達(dá)顯著增加了p-c-Fos和SP1的水平，表明ArhGAP11A基因通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子p-c-Fos和SP1改變了APP、PS1和BACE1的表達(dá)。此外，RhoA的下游信號(hào)蛋白R(shí)ho激酶（ROCK）可以抑制ERK1/2磷酸化（p-Erk1/2）的激活，而p-Erk1/2正性調(diào)節(jié)p-c-Fos和SP1的水平。本研究觀察到，感染sh-ArhGAP11A基因的原代皮層神經(jīng)元中ROCK1和ROCK2水平顯著升高，而感染sh-ArhGAP11A基因的原代皮層神經(jīng)元中p-Erk1/2水平顯著降低（圖3C-D），提示ArhGAP11A基因可能通過ROCK/Erk信號(hào)通路調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子p-c-Fos和SP1。在原代皮層神經(jīng)元中，通過ICC實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了ArhGAP11A基因敲低引起的p-c-Fos和SP1的減少（圖3E-3G）。

圖3 ArhGAP11A通過RhoA/ROCK/Erk信號(hào)通路介導(dǎo)APP、PS1和BACE1轉(zhuǎn)錄

4、下調(diào)ArhGAP11A基因通過抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑減輕Abo的神經(jīng)毒性
       Abos是最具神經(jīng)毒性的聚集體，通過引起功能性神經(jīng)元死亡、認(rèn)知損傷和癡呆，在AD的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。為探究ArhGAP11A基因?qū)bos神經(jīng)毒性的影響，作者在感染sh-ArhGAP11A基因或sh-negative control（NC）的原代皮層神經(jīng)元中加入Abos。結(jié)果顯示，2 mM的Abos使細(xì)胞存活率降低了50.3%，而ArhGAP11A基因敲低顯著降低Abos的神經(jīng)毒性，使細(xì)胞存活率升高至78.3 % 圖4A）。相反，用LV-ArhGAP11A基因過表達(dá)ArhGAP11A基因，Abos的神經(jīng)毒性顯著增加，從41.4%增加到65.1%。此外，鈣黃綠素-乙酰氧基甲基酯-碘化丙啶（AM-PI）染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，ArhGAP11A基因敲低有效逆轉(zhuǎn)了Abos的神經(jīng)毒性，而ArhGAP11A基因過表達(dá)顯著增強(qiáng)Abos的神經(jīng)毒性（圖4B-C）。
       有文獻(xiàn)報(bào)道p53參與Abos下游信號(hào)通路，引發(fā)神經(jīng)元凋亡。此外，ArhGAP11A基因可與p53相互作用，增強(qiáng)p53的轉(zhuǎn)錄功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，ArhGAP11A基因在神經(jīng)元中與p53結(jié)合，且在感染sh-ArhGAP11A基因的原代皮層神經(jīng)元中，ArhGAP11A基因與p53的結(jié)合顯著降低（圖4D）。作者隨后分析p53在神經(jīng)元中的分布，發(fā)現(xiàn)Abos誘導(dǎo)ArhGAP11A基因和p53水平的顯著增加，而ArhGAP11A基因敲低顯著降低ArhGAP11A基因和p53的水平，特別是在細(xì)胞核部分，而在細(xì)胞質(zhì)部分p53的水平?jīng)]有顯著變化（圖4E）。這些結(jié)果表明，敲低ArhGAP11A基因通過減少ArhGAP11A基因與p53的結(jié)合，降低細(xì)胞核中p53的水平，從而抵抗Abo的神經(jīng)毒性。
       P53作為轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。作者進(jìn)一步檢測了p53下游信號(hào)通路中凋亡相關(guān)蛋白的水平。qPCR結(jié)果顯示，Abo處理增加Bax、Puma和Noxa的mRNA水平，而ArhGAP11A基因敲低顯著逆轉(zhuǎn)了這些變化（圖4F），表明ArhGAP11A基因敲低通過減少p53向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，阻止凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)，從而減少Abos的神經(jīng)毒性和神經(jīng)元凋亡。

圖4 ARHGAP11A基因下調(diào)通過阻斷p53轉(zhuǎn)錄活性降低Abos的神經(jīng)毒性

5、Aβos通過激活E2F1增強(qiáng)ArhGAP11A基因的表達(dá)
       為確定在AD和APP/PS1小鼠患者中ArhGAP11A基因的表達(dá)與Abos的相關(guān)性，作者用Abos處理原代皮層神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)Abos顯著提高ArhGAP11A基因的蛋白水平（圖S7A-B）。為確定Abo誘導(dǎo)的ArhGAP11A基因增加是由于降解受損還是合成增強(qiáng)，對原代皮層神經(jīng)元進(jìn)行CHX實(shí)驗(yàn)以抑制蛋白質(zhì)合成，并通過western blotting分析在不同時(shí)間點(diǎn)檢測ArhGAP11A基因蛋白水平。結(jié)果顯示，Abo處理不干擾ArhGAP11A基因降解（圖S7C-D），但顯著提高ArhGAP11A基因的mRNA水平（圖S7E），表明Abos在轉(zhuǎn)錄水平上提高ArhGAP11A基因的生成。有報(bào)道顯示，E2F1作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控ArhGAP11A基因的表達(dá)，這種調(diào)控作用被Rb蛋白所阻斷，并由Rb磷酸化介導(dǎo)。為研究Abo介導(dǎo)的ArhGAP11A基因表達(dá)增加是否由E2F1誘導(dǎo)，用Abos處理原代皮層神經(jīng)元，檢測Rb（p-Rb）、Rb和E2F1的磷酸化水平。Abo處理顯著增加E2F1和p-Rb的水平，而不是Rb （圖S7A和S7B），證明Abos通過激活轉(zhuǎn)錄因子E2F1增強(qiáng)ArhGAP11A基因的表達(dá)。

圖S7 Abos通過激活E2F1增強(qiáng)ArhGAP11A基因的表達(dá)

6、神經(jīng)元ArhGAP11A下調(diào)可減輕APP/PS1小鼠的認(rèn)知缺陷
       作者通過Morris水迷宮（MWM）實(shí)驗(yàn)檢測ArhGAP11A基因敲低對APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。在訓(xùn)練階段，注射shArhGAP11A基因的APP/PS1小鼠表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)能力顯著改善，比shNC處理的APP/PS1小鼠潛伏期更短，而它們的運(yùn)動(dòng)功能在不同小鼠組之間沒有顯著差異（圖5A）。隨后，進(jìn)行移除平臺(tái)的探測實(shí)驗(yàn)以評估記憶回憶。與之一致的是，注射shArhGAP11A基因的APP/PS1小鼠的保持記憶顯著提高，在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和穿越平臺(tái)位置的次數(shù)比注射shNC的APP/PS1小鼠更多（圖5B-D）。
       隨后，作者進(jìn)行了Y迷宮和新奇物體識(shí)別（NOR）測試來進(jìn)一步評估小鼠海馬依賴的空間工作記憶和長短期識(shí)別記憶。結(jié)果表明，注射shArhGAP11A基因的APP/PS1小鼠在Y迷宮的新異臂中花費(fèi)了更多的時(shí)間，進(jìn)入新異臂的次數(shù)更多（圖5E-F），在NOR測試中表現(xiàn)出了新異物體的探索次數(shù)和辨別指數(shù)的顯著增加（圖5G-H）。這些結(jié)果表明，神經(jīng)元ArhGAP11A基因敲低顯著減輕APP/PS1小鼠的認(rèn)知和記憶損傷。

圖5 神經(jīng)元ArhGAP11A下調(diào)可減輕APP/PS1小鼠的記憶缺陷和神經(jīng)病理

7、神經(jīng)元ArhGAP11A下調(diào)可改善突觸喪失和神經(jīng)元損傷
       為評估神經(jīng)元ArhGAP11A基因?qū)ν挥|數(shù)量的影響，作者檢測不同組小鼠腦內(nèi)突觸后致密物-95（PSD95）和突觸素（SYN）的水平。結(jié)果顯示，與shNC處理的APP/PS1小鼠相比，ArhGAP11A基因敲低小鼠的PSD95和SYN水平以及完整突觸（PSD95與SYN共定位）的數(shù)量顯著增強(qiáng)（圖5I和圖5J）。此外，作者進(jìn)行高爾基染色以驗(yàn)證ArhGAP11A基因敲低對突觸的改善作用。結(jié)果顯示，shArhGAP11A基因處理的APP/PS1小鼠的平均樹突棘密度顯著增加，而shNC處理的小鼠的平均樹突棘密度無顯著變化（圖5K-L）。
       作者接下來進(jìn)行Nissl染色評估神經(jīng)元損傷和凋亡的變化，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元ArhGAP11A基因下調(diào)顯著增加了注射shArhGAP11A基因的APP/PS1小鼠海馬和皮層神經(jīng)元中尼氏小體的數(shù)量，表明ArhGAP11A基因敲低顯著改善神經(jīng)元損傷（圖6A-C）。研究進(jìn)一步通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，APP/PS1小鼠的海馬和皮層中存在大量的TUNEL ⁺細(xì)胞，而shArhGAP11A基因處理顯著降低TUNEL ⁺細(xì)胞的數(shù)量（圖6D-F）。這些結(jié)果表明，敲低ArhGAP11A基因顯著減少APP/PS1小鼠的突觸丟失和神經(jīng)元損傷。此外，作者還通過IHC實(shí)驗(yàn)測定了小鼠神經(jīng)元中p53的水平和分布，發(fā)現(xiàn)APP/PS1小鼠的神經(jīng)元中p53的水平明顯升高，尤其是在細(xì)胞核中，促進(jìn)了p53的轉(zhuǎn)錄活性，引起了p53依賴的神經(jīng)元凋亡，而shArhGAP11A基因處理顯著降低了p53的水平，特別是在細(xì)胞核中，這可能解釋為什么ArhGAP11A基因敲低明顯減輕的神經(jīng)元損傷（圖6G-H）。

圖6 神經(jīng)元ArhGAP11A下調(diào)可改善APP/PS1小鼠的神經(jīng)元損傷和凋亡

8、神經(jīng)元ArhGAP11A下調(diào)可降低Ab負(fù)荷
       接下來，作者進(jìn)行IHC實(shí)驗(yàn)來評估ArhGAP11A基因?qū)PP/PS1小鼠海馬神經(jīng)元中p-c-Fos、SP1、APP、PS1和BACE1水平的影響。結(jié)果顯示，與注射sh NC的小鼠相比，在APP/PS1小鼠和WT小鼠中，ArhGAP11A基因敲低顯著降低了p-c-Fos、SP1、APP、PS1和BACE1的水平（圖7A-F）。此外，APP/PS1小鼠的可溶性和不可溶性海馬組分中Ab42和Ab40的水平顯著降低了（圖7G和7H）。與此一致的是，在注射shArhGAP11A基因（圖7I-7K）的APP/PS1小鼠小鼠的海馬和皮層中，斑塊數(shù)量明顯減少?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明神經(jīng)元ArhGAP11A基因敲低有效地抑制了小鼠APP、PS1和BACE1的表達(dá)和Ab的生成。

圖7 ArhGAP11A下調(diào)可降低小鼠大腦中APP、BACE1、PS1和Aβ的水平

9、神經(jīng)元ArhGAP11A下調(diào)可減輕神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)炎癥
       作者進(jìn)一步評估了神經(jīng)元ArhGAP11A基因敲低對APP/PS1小鼠中神經(jīng)膠質(zhì)增生和神經(jīng)炎癥的影響。IHC結(jié)果顯示，與注射shNC的小鼠相比，sh ArhGAP11A基因處理顯著降低APP/PS1小鼠海馬和皮層中的小膠質(zhì)細(xì)胞增生和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生（圖S11A-S11F），并通過Western blotting分析進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖S11G和S11H）。此外，qPCR實(shí)驗(yàn)還檢測了活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)。與膠質(zhì)細(xì)胞增生的結(jié)果一致，shArhGAP11A基因顯著降低APP/PS1小鼠腦中腫瘤壞死因子a（TNF-a）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和IL-1b的水平，而shNC則無此作用（圖S11I-K）。這些結(jié)果表明神經(jīng)元ArhGAP11A基因敲低有效地減弱APP/PS1小鼠腦中的神經(jīng)炎癥。

圖S11 神經(jīng)元ArhGAP11A下調(diào)可減輕神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)炎癥

結(jié)論
       綜上所述，ArhGAP11A基因通過增加Ab生成和增強(qiáng)Abo神經(jīng)毒性參與AD的神經(jīng)病理發(fā)展。同時(shí)，Abos進(jìn)一步增加神經(jīng)元ArhGAP11A基因的表達(dá)，導(dǎo)致AD的病理惡化。因此，ArhGAP11A基因可能是緩解AD病理特征和治療AD的潛在靶點(diǎn)。

機(jī)制示意圖

實(shí)驗(yàn)方法
APP/PS1小鼠（6月齡），N2a細(xì)胞培養(yǎng)，293T細(xì)胞培養(yǎng)，GEO數(shù)據(jù)庫分析，MTT檢測，Pull-down實(shí)驗(yàn)，CoIP，蛋白提取，Western blotting，行為測試，免疫組織化學(xué)（IHC），免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC），Golgi染色，qRT-PCR
參考文獻(xiàn)
Huang YR, Xie XX, Yang J, Sun XY, Niu XY, Yang CG, Li LJ, Zhang L, Wang D, Liu CY, Hou SJ, Jiang CY, Xu YM, Liu RT. ArhGAP11A mediates amyloid-β generation and neuropathology in an Alzheimer's disease-like mouse model. Cell Rep. 2023 Jun 9;42（6）:112624. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112624. Epub ahead of print. PMID: 37302068.