焦亡是一種細(xì)胞程序性死亡,其特征是炎癥caspase的激活和Gasdermin蛋白的裂解。焦亡可以抑制腫瘤發(fā)展,誘導(dǎo)抗腫瘤免疫,激活焦亡是一種潛在的治療癌癥的策略。本研究中,作者通過CRISPR-Cas9篩選,發(fā)現(xiàn)USP48(一種去泛素化酶)的缺失顯著抑制了細(xì)胞焦亡。USP48通過Gasdermin E (GSDME)促進(jìn)焦亡。該研究于2023年4月發(fā)表在《Cancer Research》,IF:11.2。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. USP48參與焦亡的調(diào)控
顯微鏡下觀察人宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)raptinal處理后的形態(tài)學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞中出現(xiàn)焦亡的球囊細(xì)胞膜,證實raptinal可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞焦亡(圖lA)。在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行CRISPR-Cas9基因篩選,以raptinal處理后LDH的分泌量為讀取值,并通過單siRNA篩選技術(shù)進(jìn)一步篩選和驗證獲得的基因(圖1B)。根據(jù)轉(zhuǎn)染sgRNA后LDH分泌的倍數(shù)變化,選擇36個基因作為主要基因。其中,17個候選基因的沉默使LDH的分泌增加2倍以上,而其他19個基因的沉默則抑制了LDH的分泌(圖1C-D)。干擾USP48對細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放有明顯的抑制作用(圖1E)。用raptinal處理細(xì)胞,檢測USP48沉默對HeLa細(xì)胞LDH、IL-1β和IL-18的影響(圖1F-H)。結(jié)果表明,USP48沉默可顯著抑制HeLa細(xì)胞中LDH、IL-1β和IL-18的釋放。通過延時顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染USP48特異性siRNA (si-USP48)的HeLa細(xì)胞,結(jié)果顯示USP48沉默顯著抑制raptinal誘導(dǎo)的焦亡和SYTOX Green吸收(圖1I-J)。USP48沉默抑制raptinal誘導(dǎo)的HMGB1釋放(圖1K)。綜上所述,初步確認(rèn)USP48可能參與焦亡調(diào)控。
圖1. USP48參與焦亡的調(diào)控
2. USP48調(diào)控GSDM的表達(dá)
檢測6種不同人源性細(xì)胞系中USP48的表達(dá),發(fā)現(xiàn)USP48在293T細(xì)胞中低表達(dá),在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)(圖2A)。在293T細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達(dá)USP48,在HeLa細(xì)胞系中穩(wěn)定敲低USP48(圖2B)。將質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果結(jié)合分析,獲得8個相關(guān)蛋白(圖2D和E)。檢測過表達(dá)USP48和敲低USP48后這8種蛋白的表達(dá)水平變化,發(fā)現(xiàn)GSDME相比其他幾種蛋白的變化更為顯著和穩(wěn)定(圖2F和G)。圖2H進(jìn)一步證實GSDME的表達(dá)與USP48的表達(dá)呈正相關(guān),但GSDMD和USP48的表達(dá)狀態(tài)不存在顯著相關(guān)。催化失活突變體USP48 (USP48/C98A)的過表達(dá)不會影響GSDME的表達(dá)(圖2I)。通過CO-IP進(jìn)一步證實USP48與GSDME之間的相互作用(圖2J-K)。此外,作者還發(fā)現(xiàn)USP48不影響GSDME的裂解(圖2L)。綜上,USP48可以調(diào)節(jié)GSDME的表達(dá)(但不影響其裂解),并且與GSDME有直接的相互作用。
圖2. GSDME是USP48的下游靶蛋白
3. USP48通過調(diào)控GSDM的表達(dá)影響焦亡
建立一個同時表達(dá)USP48和靶向GSDME的shRNA的293T細(xì)胞系(圖3A)。GSDME的下調(diào)大大挽救了raptinal處理后293T細(xì)胞中USP48過表達(dá)對LDH(圖3B)、IL-1B(圖3C)和IL-18(圖3D)的促進(jìn)作用。相反,在同時表達(dá)shUSP48和GSDME的HeLa細(xì)胞系中(圖3E),也證實了過表達(dá)GSDME可以恢復(fù)USP48敲低對293T細(xì)胞經(jīng)raptinal處理后產(chǎn)生LDH(圖3F)、IL-1β(圖3G)和IL-18(圖3H)的抑制作用。用延時顯微鏡觀察表達(dá)USP48和shRNA靶向GSDME的293T細(xì)胞系經(jīng)raptinal處理后SYTOX Green的形態(tài)和吸收情況,得到了一致的結(jié)果(圖3I-J)。綜上所述,證實USP48可能以不依賴于caspase-3的方式促進(jìn)GSDME的表達(dá),從而促進(jìn)GSDME的表達(dá)發(fā)生焦亡。
圖3. USP48通過GSDME調(diào)控焦亡
4. USP48通過去泛素化防止GSDME降解
為進(jìn)一步確認(rèn)USP48是否會影響GSDME的穩(wěn)定性,作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體特異性抑制劑MG132可以有效逆轉(zhuǎn)USP48敲低對GSDME的影響(圖4A),通過環(huán)已酰亞胺(CHX)追蹤分析評價USP48調(diào)節(jié)GSDME蛋白腫瘤速率的潛力,結(jié)果表明USP48水平的降低與GSDME半衰期的縮短明顯相關(guān)(圖4B)。用Dox誘導(dǎo)的野生型USP48 (USP48/WT)和催化失活突變型USP4S (USP48/C98A)建立293T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)只有野生型USP48以Dox劑量依賴的方式逐漸增加GSDME水平(圖4C),而表達(dá)USP48/C98A的細(xì)胞中未檢測到GSDME蛋白水平的顯著變化(圖4D)。進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)野生型USP48顯著降低GSDME的泛素化水平,而表達(dá)USP48/C98A的293T細(xì)胞對GSDME的泛素化沒有影響(圖4E)。相反,敲低USP48會導(dǎo)致泛素化GSDME的積累(圖4F)。作者還發(fā)現(xiàn)USP48影響GSDME中K48連接的泛素,但對K63連接的泛素化沒有影響(圖4G)。體外泛素化實驗表明,泛素K48在K30、K120和K189位點使GSDME泛素化 (圖4H和I)。接下來,為鑒定USP48修飾的GSDME的靶殘基,在GSDME的K30、K120和K189位點構(gòu)建相應(yīng)的點突變體(圖4J),結(jié)果顯示,USP48在K120處抑制GSDME的K48連鎖泛素化(圖4K)。綜上所述,USP48通過抑制GSDME K120位點的K48連鎖泛素化來阻止GSDME的降解。
圖4. USP48通過去泛素化抑制GSDME的降解
5. USP48通過調(diào)節(jié)GSDME的表達(dá)影響抗腫瘤免疫
為了進(jìn)一步證明USP48的功能,建立USP48缺陷小鼠自發(fā)性胰腺腫瘤發(fā)生(KUC)模型。免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示USP48的表達(dá)水平與GSDME的表達(dá)呈正相關(guān)(圖5A-F)。此外,小鼠組織中USP48的缺失對GSDMD的表達(dá)也沒有影響(圖5G和H)。免疫熒光結(jié)果顯示,KUC小鼠腫瘤浸潤性CD8+和CD4+T細(xì)胞明顯減少(圖5I-J)。自然殺傷細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T殺傷細(xì)胞的比例明顯降低,而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例則顯著增加(圖5K)。綜上所述, USP48可以通過調(diào)節(jié)GSDME的表達(dá)來影響細(xì)胞的抗腫瘤免疫。
圖5. USP48參與抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)
6. 單細(xì)胞測序?qū)嶒炾U明USP48對抗腫瘤免疫的調(diào)控作用
對KC和KUC小鼠的胰腺組織進(jìn)行單細(xì)胞測序,所有細(xì)胞CD45基因(PTPRC)均呈陽性(圖6A)。大小聚類算法顯示KC和KUC小鼠胰腺腫瘤組織中的細(xì)胞分布(圖6B)。將細(xì)胞分組,定義捕獲TAM的5個細(xì)胞群,即樹突狀細(xì)胞(dc)、T細(xì)胞、單核細(xì)胞-1細(xì)胞和單核細(xì)胞-2細(xì)胞(圖6C)。比較KC和KUC胰腺癌組織中細(xì)胞亞群的差異,發(fā)現(xiàn)USP48表達(dá)的下調(diào)顯著增加了TAM和單核細(xì)-2的數(shù)量(圖6D)。通過熱圖和點陣圖 (圖6E和F),得到KC和KUC胰腺癌組織中各細(xì)胞亞組的數(shù)量和比例(圖6G)。對KC和KUC胰腺癌組織中的T細(xì)胞進(jìn)行亞群分析(圖7A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), Tex細(xì)胞和Treg細(xì)胞在KUC胰腺癌組織中的比例顯著增加,表明USP48表達(dá)的降低抑制腫瘤免疫的發(fā)生(圖7B)。使用UMAP顯示T細(xì)胞亞群分類標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記基因的表達(dá)以及T細(xì)胞亞群在KC和KUC胰腺癌組織中的比例,進(jìn)一步證實上述結(jié)果(圖7C-D)。使用多色免疫熒光實驗檢測KC和KUC小鼠胰腺癌組織中Tex細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分布,得到的結(jié)果與測序結(jié)果一致(圖7E和F)。敲低USP48顯著增加TAM亞群的比例(圖7G和H)。多色免疫熒光實驗證實USP48的缺失增加TAM在胰腺癌組織中的分布(圖7I)。綜上所述, USP48缺失抑制胰腺癌細(xì)胞的抗腫瘤免疫。
圖6. 胰腺癌中KC和KC;USP48-/-CD45+細(xì)胞的單細(xì)胞分析
圖7. 敲除USP48可增加浸潤胰腺癌的去勢T細(xì)胞、Treg和TAM的比例
7. USP48-GSDME調(diào)節(jié)小鼠對抗PD -1免疫治療的敏感性
將過表達(dá)USP48的Pan02細(xì)胞或空載體皮下植入C57/B6小鼠。在第7天、第11天和第15天用抗aPD-1處理小鼠,連續(xù)觀察小鼠的生長情況,并在第30天處死小鼠(圖8A)。結(jié)果表明,過表達(dá)USP48可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長,而過表達(dá)USP48突變體(USP48/C98A)對小鼠體內(nèi)腫瘤生長無抑制作用。過表達(dá)USP48也顯著提高小鼠對抗PD -1治療的敏感性(圖8B-E)。在過表達(dá)USP48的Pan02細(xì)胞中表達(dá)shGSDME或scramble,并皮下注射到C57/B6小鼠體內(nèi)。與預(yù)期結(jié)果一致,在USP48過表達(dá)的Pan02小鼠中,敲低GSDME的表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)USP48過表達(dá)對腫瘤生長的抑制作用和促進(jìn)抗PD -1治療的敏感性(圖8F-I)。對小鼠腫瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測,結(jié)果與之前的結(jié)果一致 (圖8J-K)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實USP48-GSDME通路在抗腫瘤免疫中的重要作用,并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤免疫治療中的關(guān)鍵調(diào)控作用。
圖8. USP48-GSDME影響小鼠對抗PD-1免疫療法的敏感性
結(jié)論
綜上所述,本研究確定了USP48對焦亡的關(guān)鍵調(diào)控作用,并闡明了其分子機制以及USP48在抗腫瘤免疫和免疫治療中的作用。因此,特異性靶向USP48或USP48-GSDME軸可能是未來潛在的治療策略。
實驗方法
細(xì)胞培養(yǎng),逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染, CRISPR敲除,免疫組化,多重免疫熒光,WB,Co-IP,體外泛素化實驗,qRT-PCR,流式細(xì)胞術(shù),SYTOX green 染色,LDH檢測,IL-18和IL-1β檢測,RNA-seq文庫構(gòu)建,腫瘤異種移植。
參考文獻(xiàn)
Ren Y, Feng M, Hao X, Liu X, Li J, Li P, Gao J, Qi Q, Du L, Wang C, Wang Q, Wang Y. USP48 Stabilizes Gasdermin E to Promote Pyroptosis in Cancer. Cancer Res. 2023 Apr 4;83(7):1074-1093. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-22-1812. PMID: 36607699.