可變剪接介導(dǎo)新circRNA生物發(fā)生揭示KRAS突變介導(dǎo)的胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移

       在約90%的胰腺導(dǎo)管癌癌（PDAC）患者中鑒定出KRAS突變，并且KRASG12D是PDAC中最常見的等位基因。靶向KRAS^G12D突變的基因療法在轉(zhuǎn)移性PDAC中實現(xiàn)了70%的消退，表明靶向KRAS^G12D在轉(zhuǎn)移性PDAC中的治療潛力。本文找到了一個新的circRNA，其在KRAS^G12DPDAC中上調(diào)，并且與KRAS^G12D PDAC淋巴結(jié)（LN）轉(zhuǎn)移正相關(guān)。在機(jī)制上，KRAS^G12D ?PDAC中的circARFGEF生物發(fā)生被選擇性剪接因子QKI-5顯著激活，促進(jìn)了circARFGEF生物發(fā)生。并探討了circARFGEF海綿化miR-1205并促進(jìn)JAK 2的活化，JAK2將STAT3磷酸化觸發(fā)KRAS^G12D PDAC淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移。本文于2023年6月，發(fā)表于《Cancer Research》上，IF=11.2。?

1.circARFGEF在LN轉(zhuǎn)移的KRAS^G12DPDAC中高表達(dá)

       為了研究circRNA是否參與KRAS^G12D驅(qū)動的LN轉(zhuǎn)移，在3個配對的PDAC組織和9個正常的鄰近組織（NAT）（GSE234760）中進(jìn)行了二代測序，發(fā)現(xiàn)了circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC組織中最顯著上調(diào)，與具有其他KRAS亞型的PDAC組織相比（KRAS^G12C、KRAS^G12V、KRAS^WT）（圖1A和B）。此外，circARFGEF2 在LN陽性KRAS^G12D PDAC 患者或具有高度病理性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）階段的患者中過表達(dá)，并且與原發(fā)性腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性LN具有更高的circARFGEF2 表達(dá)（圖1C和D）。原位雜交（ISH）和免疫熒光分析顯示，circARFGEF2過表達(dá)伴隨著KRAS^G12DPDAC組織中的微淋巴管密度（MLD）增加（圖1 E和F）。此外，熒光原位雜交（FISH）揭示了在LN陽性KRAS^G12D PDAC組織中的circARFGEF2富集，與LN陰性相比（圖1G和H），表明circARFGEF 2與KRAS^G12D PDAC的LN轉(zhuǎn)移正相關(guān)。Kaplan-Meier存活分析表明，在患有KRAS^G12D PDAC的患者中，circARFGEF2過表達(dá)與總存活（OS）和無病存活（DFS）呈負(fù)相關(guān)（圖1 I和J）。此外，在使用互補(bǔ)DNA（cDNA）而不是基因組DNA（gDNA）作為模板的PCR產(chǎn)物中檢測到circARFGEF 2（圖1 K）。與ARFGEF2 mRNA相比，circARFGEF2表現(xiàn)出對RNaseR的更強(qiáng)抗性，而Actinomycin D測定表明circARFGEF2具有比ARFGEF2 mRNA更長的半衰期（圖1 M和N）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC患者中高表達(dá)且具有高度穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

圖1：circARFGEF2在LN轉(zhuǎn)移的KRAS^G12D PDAC患者

2.QKI-5與circARFGEF2結(jié)合加速在circARFGEF2在LN轉(zhuǎn)移的KRAS^G12DPDAC中的生物合成
       用circRNA構(gòu)建了6個雙色熒光報告子給予IRES介導(dǎo)的GFP翻譯，并將線性mRNA用mCherry標(biāo)記以同時定量ARFGER2前體mRNA的線性和circRNA 剪接（圖2A）。在PANC-1細(xì)胞中應(yīng)用KRAS^G12D抑制劑MRTX1133或KRAS^G12D siRNA后，由HA-mCherry表達(dá)指示的線性ARFGEF2增加，并且由FLAG-GFP表達(dá)指示的circARFGEF2形成以及GFP-mCherry比率顯著減少。而在Mia PaCa-2（KRAS^G12C）和BxPC-3（KRAS^WT）細(xì)胞中應(yīng)用MRTX1133后未觀察到明顯變化（圖2B-D）。已經(jīng)證明了QKI在circRNA生物發(fā)生中的關(guān)鍵作用。因此，在3對KRAS^G12D PDAC組織和NAT中進(jìn)行二代測序以評估QKI是否調(diào)節(jié)KRAS^{G 12D} PDAC中的circARFGEF2生物發(fā)生，并確定QKI在KRAS^G12D PDAC組織中上調(diào)（GSE 234927）（圖2E）。雙色熒光報告基因測定顯示，下調(diào)QKI表達(dá)的顯著降低了GFP-mCherry比率（圖 2F和G），表明QKI是circARFGEF2生物發(fā)生所需的。雙色熒光報告測定和蛋白質(zhì)印跡測定，并揭示降低QKI-5表達(dá)顯著降低FLAG-GFP表達(dá)，同時增加HA-mCherry表達(dá)（圖2H）。前體mRNA選擇性剪接通常由剪接體催化，剪接體的組裝與相關(guān)的蛋白輔因子相伴逐步發(fā)生。免疫共沉淀（Co-IP）測定，隨后質(zhì)譜（MS）和蛋白質(zhì)印跡鑒定出QKI-5與U2輔助因11（U2AF35）相互作用，直接觸發(fā)剪接體組裝以刺激剪接的U2AF亞基（圖2 I和J）。此外，降低U2AF35表達(dá)顯著阻礙QKI-5誘導(dǎo)的circARFGEF2生物發(fā)生（圖2K和L）。上述結(jié)果表明QKI-5募集U2AF35來調(diào)節(jié)ARFGEF2前體mRNA剪接，并促進(jìn)circARFGEF2生物合成。為了證實ARFGEF2前mRNA上的精確QKI-5結(jié)合位點，我們用內(nèi)含子3和6的截短序列進(jìn)行了下拉測定，其揭示了QKI-5特別富集內(nèi)含子3^{1000-1200 nt}和內(nèi)含子6^{7600-7800 nt}（圖2 M和N）。內(nèi)含子3^{1128-1180 nt}和內(nèi)含子 6^{7672-7740 nt}的突變損害QKI-5和ARFGEF前mRNA結(jié)合，表明QKI-5 直接結(jié)合這兩個ARFGEF2前mRNA區(qū)域（圖2 O和P）。此外，我們評估了QKI-5和ARFGEF2前mRNA之間的相互作用是否影響PDAC中的circARFGE 2產(chǎn)生。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ARFGEF2前mRNA中內(nèi)含子3^{1128-1180 nt}和內(nèi)含子6^{7672-7740 nt}的敲除顯著降低了QKI-5介導(dǎo)的circARFGEF2過表達(dá)（圖2Q）?？傊?，我們的結(jié)果證明QKI-5募集U2AF35并結(jié)合內(nèi)含子3^{1128-1180 nt}和6^{7672-7740 nt}的轉(zhuǎn)錄水平，以促進(jìn)circARFGEF 2剪接（圖2R）。

圖2：QKI亞群結(jié)合至circARFGEF2剪接外顯子的側(cè)翼內(nèi)含子，并加速KRAS^G12D PDAC中的circARFGEF2生物合成

3.增加circARFGEF2生物合成促進(jìn)KRAS^G12D PDACLN轉(zhuǎn)移
       circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC細(xì)胞中下調(diào)抑制HLEC管形成和迀移能力，而circARFGEF2過表達(dá)促進(jìn)KRAS^G12D PDAC細(xì)胞誘導(dǎo)的HLEC管形成和迀移（圖3A和B）。進(jìn)一步評估QKI-5是否調(diào)節(jié)KRAS^G12D PDAC中的circARFGEF 2誘導(dǎo)的管形成和迀移，并且證明QKI-5過表達(dá)增強(qiáng)HLEC管形成和迀移能力，而下調(diào)circARFGEF2表達(dá)抑制QKI-5誘導(dǎo)的HLEC的淋巴管生成（圖3C）。QKI-5過表達(dá)顯著促進(jìn)了KRAS^G12D PDAC細(xì)胞的LN轉(zhuǎn)移，而下調(diào)circARFGEF2的明顯逆轉(zhuǎn)了這種作用（圖3D）。原發(fā)性腫瘤的免疫組織化學(xué)（IHC）分析表明，降低circARFGEF2表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由QKI-5上調(diào)誘導(dǎo)的MLD的增加（圖3E）。使用正電子發(fā)射斷層掃描-計算機(jī)斷層掃描18（PET-CT）掃描來評估裸鼠的原位致瘤性，發(fā)現(xiàn)QKI-5促進(jìn)KRAS^G12D PDAC細(xì)胞的原位致瘤性，而當(dāng)circARFGEF2下調(diào)時，這種作用受到阻礙（圖3F）。IHC結(jié)果顯示，QKI-5可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞向胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增加胰腺移植瘤模型中轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)量，同時降低circARFGEF 2的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)（圖3G）。綜上所述，上述結(jié)果表明QKI-5介導(dǎo)的circARFGEF2促進(jìn)體外KRAS^G12D PDAC淋巴管生成以及體內(nèi)KRAS^G12D PDAC LN轉(zhuǎn)移。

圖3：QKI-5介導(dǎo)的circARFGEF2促進(jìn)體外KRAS^G12D PDAC淋巴管生成以及體內(nèi)KRAS^G12D PDAC LN轉(zhuǎn)移

4.circARFGEF2海綿化KRAS^G12D PDAC中的miR-1205

       研究circARFGEF2誘導(dǎo)KRAS^G12D PDAC LN轉(zhuǎn)移的機(jī)制。首先確定了circARFGEF2主要位于KRAS^G12D PDAC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖4A和4 B）。
       通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測和驗證發(fā)現(xiàn)這些miRNA中，miR-1205最特異地在KRAS^G12D PDAC細(xì)胞系中過表達(dá)，而不是具有其他KRAS亞型的PDAC細(xì)胞系中過表達(dá)。RNA下拉測定揭示，與Oligo探針相比，在KRAS^G12D PDAC細(xì)胞而不是KRAS^WT PDAC細(xì)胞中，miR-1205被circARFGEF 2探針顯著富集（圖4C）。circARFGEF 2和miR-1205 序列的分析揭示了反向互補(bǔ)序列的存在（圖4D）。雙熒光素酶報告基因測定揭示miR-1205顯著降低circARFGEF2組的熒光素酶活性，而反向互補(bǔ)序列的突變削弱了這種作用（圖4 E），表明circARFGEF 2通過特異性序列海綿化miR-1205。此外，F(xiàn)ISH測定證明circARFGEF2和miR-1205共定位在KRAS^{G 12D} PDAC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖4F），表明 circARFGEF2和miR-1205之間的相互作用。體外實驗表明，過表達(dá)circARFGEF2的觸發(fā)HLEC管形成和迀移，而過表達(dá)miR-1205的明顯逆轉(zhuǎn)了這種作用（圖4G）。綜上所述，結(jié)果表明circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC細(xì)胞中充當(dāng)miR-1205海綿。
       KEGG通路分析揭示JAK-STAT途徑是與circARFGEF2相關(guān)的最顯著富集的通路（圖4H）。JAK代表用于激活JAK-STAT途徑的核心組分，并且由JAK 1、JAK 2、JAK 3和TYK 2組成。隨后，檢測了JAK亞型的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)JAK 2與KRAS^G12D PDAC細(xì)胞中circARFGEF 2的表達(dá)正相關(guān)（圖4I）。此外，miR-1205與KRAS^G12D PDAC細(xì)胞中的JAK2表達(dá)負(fù)相關(guān)（圖4J和K）。雙熒光素酶報告基因測定表明，miR-1205明顯降低JAK2 3′UTR熒光素酶構(gòu)建體中的熒光素酶活性，而不是miR-1205結(jié)合位點中的突變序列（圖4L）。miR-1205過表達(dá)明顯抑制circARFGEF2誘導(dǎo)的JAK2表達(dá)，這表明 circARFGEF2充當(dāng)miR-1205海綿以增加JAK2表達(dá)（圖4 M和N）。WB顯示circARFGEF2過表達(dá)促進(jìn)JAK2表達(dá)和STAT 3磷酸化（圖4O），而circARFGEF2下調(diào)降低JAK2表達(dá)并抑制STAT 3磷酸化（圖4P）。

圖4：circARFGEF2海綿化KRAS^G12D PDAC中的miR-1205并激活KRAS^G12D PDAC中的JAK2-STAT3信號通路

5.JAK2-STAT3通路阻斷抑制circARFGEF 2誘導(dǎo)的KPC小鼠LN轉(zhuǎn)移

       circARFGEF2過表達(dá)顯著促進(jìn)HLEC管形成和迀移能力，而JAK2-STAT3通路抑制劑WP1066顯著逆轉(zhuǎn)該作用（圖5A和B）。此外，體內(nèi)實驗證明，與對照裸小鼠相比，circARFGEF2過表達(dá)裸小鼠具有更大的膝彎淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤，并且WP1066顯著阻礙circARFGEF2誘導(dǎo)的LN轉(zhuǎn)移（圖5C和D）。IHC分析顯示，circARFGEF2過表達(dá)促進(jìn)膝彎LN的轉(zhuǎn)移，增加足墊腫瘤中的MLD，而抑制JAK 2-STAT3通路逆轉(zhuǎn)了這些作用（圖5E和F）。這些結(jié)果表明，circARFGEF2 通過JAK2-STAT3通路促進(jìn)KRAS^G12D PDAC中的淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移。為了更好地理解circARFGEF2在體內(nèi)KRAS^G12D PDAC LN轉(zhuǎn)移中的作用，使用工程化的轉(zhuǎn)基因Kras^G12D/+ Trp 53 ^{R172 H/+}Pdx-1-Cre（KPC）小鼠模型。結(jié)果表明circARFGEF2過表達(dá)顯著增加了原發(fā)性PDAC腫瘤體積，并且抑制JAK2-STAT3信號通路則逆轉(zhuǎn)了這種作用（圖6A和B）。此外， circARFGEF2過表達(dá)顯著增加了KPC小鼠中轉(zhuǎn)移性腹部LN的數(shù)量和原發(fā)性PDAC腫瘤中的MLD，而阻斷 JAK 2-STAT 3信號傳導(dǎo)途徑阻礙了這些作用（圖6C和D）。這些結(jié)果表明，阻斷JAK2-STAT3通路對CircARFGEF2誘導(dǎo)的KRAS^G12D PDAC的淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出抑制作用。

圖5：JAK2-STAT3通路阻斷抑制circARFGEF 2誘導(dǎo)的KPC小鼠LN轉(zhuǎn)移

6.KRAS^G12D PDAC患者中QKI-5-circARFGEF 2-JAK 2軸的臨床相關(guān)性

       評估 QKI-5介導(dǎo)的circARFGEF2-miR-1205-JAK2軸在患有KRAS^G12D PDAC的患者中的臨床意義。結(jié)果表明，與NAT相比，miR-1205在KRAS^{G 12D} PDAC組織中下調(diào)，并且circARFGEF2、QKI-5、JAK2在KRAS^G12D PDAC組織中上調(diào)（圖6 E和F）。此外，miR-1205與LN轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)，而circARFGEF 2、QKI-5和JAK2在LN轉(zhuǎn)移性KRAS^G12D PDAC組織中顯著上調(diào)（圖6 G和H）。IHC分析顯示，QKI-5和JAK2與KRAS^G12D PDAC組織中的circARFGEF2表達(dá)正相關(guān)（圖6 I-K）。相關(guān)性分析揭示JAK2與miR-1205表達(dá)負(fù)相關(guān)，而與QKI-5表達(dá)正相關(guān)，并且在circARFGEF2和miR-1205表達(dá)之間觀察到負(fù)相關(guān)（圖6L和M）?？傊?，這些研究結(jié)果表明，來源于QKI-5依賴性剪接的circARFGEF2海綿化miR-1205并激活JAK2-STAT3信號傳導(dǎo)通路以誘導(dǎo)KRAS^G12D PDAC LN轉(zhuǎn)移。

圖6：KRAS^G12D PDAC患者中QKI-5-circARFGEF 2-JAK 2軸的臨床相關(guān)性

結(jié)論
       總之，本文提出了KRAS^G12D突變驅(qū)動的 circARFGEF2生物合成的新機(jī)制，其經(jīng)由QKI-5依賴性剪接介導(dǎo)miR-1205-JAK2-STAT3軸以觸發(fā)PDAC LN轉(zhuǎn)移。抑制circARFGEF2表達(dá)或JAK2-STAT3通路顯著阻礙了KPC模型中的腫瘤生長。這些發(fā)現(xiàn)使得能夠?qū)DAC LN轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)機(jī)制有新的理解，表明circARFGEF2是KRAS^G12D PDAC中的潛在治療靶標(biāo)。

實驗方法
臨床樣本收集，RNA測序和數(shù)據(jù)分析，免疫組化，膝彎淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，體外移植瘤模型， Kras^G12D/+Trp53^R172H/+Pdx-1-Cre (KPC)小鼠注射AVV載體，質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除，熒光原位雜交實驗，瓊脂糖凝膠電泳，RNase R消化和Actinomycin D處理實驗，RNA下拉實驗，Transwell，管形成實驗，5-EDU實驗，雙熒光素酶實驗，WB，RT-qPCR，亞細(xì)胞分離試驗。
參考文獻(xiàn)
Kong, Y., Luo, Y., Zheng, S., Yang, J., Zhang, D., Zhao, Y., Zheng, H., An, M., Lin, Y., Ai, L., Diao, X., Lin, Q., Chen, C., & Chen, R. (2023). Mutant KRAS mediates circARFGEF2 biogenesis to promote lymphatic metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer research, CAN-22-3997. Advance online publication. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-3997