靶向巨噬細胞免疫檢查點Siglec-9——提高膠質母細胞瘤免疫治療療效

       新輔助免疫檢查點阻斷療法只能使一小部分多形性膠質母細胞瘤（GBM）患者受益。因此，靶向髓系細胞上的其他免疫調節(jié)劑是一種有吸引力的治療選擇。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)具有功能可塑性的單核細胞源腫瘤相關巨噬細胞亞群，它們高度表達免疫抑制SIGLEC9基因，并優(yōu)先在抗PD-1治療無反應者中積累。在小鼠模型中，敲除Siglece（小鼠同源基因）可顯著抑制腫瘤發(fā)展并延長存活時間。機制上，靶向Siglece可通過抗原呈遞、分泌趨化因子和共刺激因子相互作用直接激活CD4⁺T細胞和 CD8⁺T細胞。此外，Siglece缺失與抗PD-1/PD-L1治療協(xié)同提高抗腫瘤療效。該研究于2023年7月17日發(fā)表在《Nature Cancer》，IF：22.7。
技術路線

主要研究結果
1. 新輔助免疫療法重塑GBM微環(huán)境  
       將24名GBM患者分為三組：7名新診斷患者（ND）、5名復發(fā)患者（Rec）和12名接受帕博利珠單抗和安羅替尼新輔助聯(lián)合療法（Neo）的患者。Neo組又分為5例非應答者和7例應答者（圖1a,b）。與非應答者相比，應答者的PFS和總生存期(OS)更長（圖1b）。對腫瘤進行scRNA-seq分析，獲得  149048個高質量細胞（圖1c）。比較結果顯示，Neo/Rec樣本和ND樣本中的T細胞、小膠質細胞和巨噬細胞存在顯著差異。巨噬細胞占細胞總數(shù)的 37.5%，并且在不同疾病階段的代表性逐漸降低，這表明巨噬細胞在GBM進展和治療過程中發(fā)揮重要作用（圖1d）。對24名患者中18名患者的34個組織切片進行ST分析，使用非負矩陣分解（cNMF）尋找共有的表達模塊（圖1e）。與瘤旁區(qū)相比，腫瘤核心區(qū)的缺氧、血管生成和炎癥反應基因特征更為明顯（圖1f）。腫瘤核心區(qū)基因表達的增加與細胞外基質組織、血管生成、IL-4/IL-13 信號轉導和炎癥反應有關（圖1g）。這些發(fā)現(xiàn)強調了不同GBM腫瘤區(qū)域的動態(tài)空間景觀。

圖1. ND、Rec和Neo中腫瘤微環(huán)境重編程的單細胞和空間轉錄組學研究

2. GBM中多種SIGLEC9⁺TAM亞群
       對小膠質細胞、腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和單核細胞進行深入分析（圖2a）。發(fā)現(xiàn)一個主要的小膠質細胞集群（C1，表達TMEM119和P2RY12）和一個小的高表達CXCL10的小膠質細胞集群（C8）（圖2a,b）。TAM（CD68⁺、TGFBI⁺ 和 CSF1R⁺）再聚類顯示五個亞群：增殖TAMs（C7，MKI67）、IL1⁺ TAMs（C6，IL1）、一個未定義的亞群（C5）和兩個具有SIGLEC9 表達特征的亞群，分別命名為SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs（C2，SIGLEC9⁺和SEPP1⁺）和SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs（C9，SIGLEC9⁺和MARCO⁺）（圖2a,b）。還發(fā)現(xiàn)兩個單核細胞集群：CD14⁺單核細胞（C3）和CD16⁺單核細胞（C4）（圖2a）。與Rec樣本相比，主要的小膠質細胞集群（C1）在ND樣本中富集（圖2c）。Rec組主要觀察到SIGLEC9⁺ SEPP1⁺ TAMs（C2）和CD14⁺單核細胞（C3）（圖2c）。在Neo組中，與應答者相比，SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs（C9）更多地出現(xiàn)在非應答者中，而SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs（C2）則略有增加（圖2c）。進行基因集變異分析（GSVA）（圖2d），小膠質細胞在抗腫瘤相關途徑略有富集，表明這些組織常駐髓系細胞可能不是抗腫瘤免疫反應的驅動力（圖2d）。IL1⁺TAMs（C6）強烈富集的炎癥反應途徑強調了IL-1在激活巨噬細胞中的關鍵作用（圖2d）。IL1⁺ TAM（C6）在Neo組中的優(yōu)先分布表明，它們可能是由免疫檢查點阻斷療法（ICB）誘發(fā)的（圖2c）。值得注意的是，單核細胞衍生TAMs的兩個異質亞群（SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs，C2；SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs，C9）在活化和抗腫瘤途徑中都有富集（圖2d）。使用基于熵的統(tǒng)計算法ROGUE量化亞群的異質性，發(fā)現(xiàn)SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs（C2）和SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs（C9）在不同疾病階段（圖2e）的ROGUE指數(shù)都很低，CXCL10⁺小膠質細胞集群（C8）也表現(xiàn)出高度異質性（低ROGUE指數(shù)）（圖2e）。
3. SIGLEC9引導兩個表達SEPP1或MARC的TAM亞群
       將單細胞熵應用于TAMs，用統(tǒng)一的流形逼近與投影（UMAP）表示它們的細胞狀態(tài)可能性。與初始狀態(tài)相比，耗竭SIGLEC9⁺TAMs后，整體細胞熵大幅增加，而耗竭MARCO⁺TAMs則沒有出現(xiàn)整體變化（圖2f）。SEPP1⁺TAM的耗竭導致大部分區(qū)域的整體細胞熵更低（圖2f）。因此，維持這兩個TAM亞群的是 SIGLEC9而不是SEPP1或MARCO。值得注意的是，SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs（C2）表達高水平的抗炎和血管生成相關基因，如IL10、VEGFB、SLC40A1、FOLR2 和CSF1R（圖2g）。相反，與 SIGLEC9^-SEPP1^-TAMs相比，SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs中的主要組織相容性復合體（MHC）-II基因（HLA-DQA1和HLA-DRB1）、促炎細胞因子IL18以及抗原遞呈和吞噬相關基因C1QA/C1QB/C1QC也有所升高（圖2g）。SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs的抗炎基因（如MRC1、MARCO和VSIG4）和炎癥基因（如ALOX5、ENO1和FBP1）的表達均上調（圖2h）。這些結果說明SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs和SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs代表高度可塑性的免疫抑制巨噬細胞群。
4. SIGLEC9⁺TAMs源自單核細胞
       RNA速率分析表明，CD14⁺單核細胞（C3）向SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs（C2）和SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs（C9）定向流動（圖2i）。這表明SIGLEC9⁺SEPP1⁺和SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs并不是離散的細胞群，而是連續(xù)的，并且來自單核細胞。值得注意的是，SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs在單核細胞趨化通路中表現(xiàn)出富集（圖2d），進一步支持單核細胞遷移到腫瘤并逐步分化成SIGLEC9⁺TAMs的觀點。測量各細胞群的空間共定位，發(fā)現(xiàn)SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAMs或SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs與CD14⁺單核細胞共定位，進一步表明它們來自 CD14⁺單核細胞（圖2j）。

圖2. 源自單核細胞的SIGLEC9⁺巨噬細胞具有抗腫瘤和免疫抑制的雙重功能

5. SIGLEC9⁺TAMs在新輔助治療后積聚
       與其他疾病階段相比，SIGLEC9在非應答者樣本中表達明顯較高（圖3a）。此外，在應答者中SIGLEC9⁺SEPP1⁺和SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs中SIGLEC9表達明顯減少，這表明其具有抑制功能（圖3b）。差異基因表達（DGE）分析顯示，與ICB治療應答者相比，非應答者的SIGLEC9⁺SEPP1⁺和SIGLEC9⁺MARCO⁺TAMs表達更高的C1QA、C1QB、CD14和SPP1（圖3c,d）。在應答者中，炎癥因子如APOE、IL1B、STAT1，T細胞趨化因子CCL3、CCL4和與IFN-γ相關的ISG15均上調（圖3c，d）。值得注意的是，SIGLEC9⁺TAMs 在應答者中顯示出更好的T細胞趨化性，這表明它們可以增強ICB治療的陽性反應（圖3e）。SIGLEC9⁺TAMs顯示出與新輔助抗PD-1治療的GBM數(shù)據(jù)集中髓樣細胞-C6亞群的相似性，均表達免疫抑制基因，如GPNMB、CSTB和MRC1(圖3f-h)。在人類復發(fā)性GBM數(shù)據(jù)集中，SIGLEC9⁺SEPP1⁺TAM與表達吞噬/脂質和抗炎基因的TAM亞群一致，而SIGLEC9⁺MARCO⁺TAM與缺氧性TAM相似（圖3i）。SIGLEC9⁺TAMs與其他數(shù)據(jù)集的相似性表明這些細胞類型的免疫抑制功能。

圖3. 新輔助抗PD-1治療后SIGLEC9⁺巨噬細胞持續(xù)存在

6. SIGLEC9⁺TAMs與不良臨床結局相關
       評估大型臨床隊列中的SIGLEC9基因表達，發(fā)現(xiàn)癌癥基因組圖譜（TCGA）GBM隊列中，SIGLEC9 的表達與OS呈負相關（圖 4a）。以scRNA-seq為參照，對TCGA數(shù)據(jù)進行CIBERSORTx反卷積分析，發(fā)現(xiàn)在同一隊列中，SIGLEC9⁺TAM 的比例與OS呈負相關（圖4b）。通過免疫組化（IHC）方法評估Siglec-9，該方法使用的組織芯片來自一個大型 GBM 隊列，在該隊列中，高水平的 Siglec-9 與OS呈負相關（圖4c）。
7. Siglece基因缺失增強小鼠的抗腫瘤活性
       Siglece是人類 SIGLEC9的小鼠功能同源物，使用野生型（WT）和 Siglece 基因敲除（Siglece^-/-）小鼠進行反向翻譯研究。首先在蛋白質水平上評估C57/BL6 小鼠的 Siglec-E（圖4d）。在脾臟和淋巴結中，WT小鼠的巨噬細胞、中性粒細胞和單核細胞中高表達Siglec-E，樹突狀細胞（DC）中表達較少，T細胞、B細胞或自然殺傷（NK）細胞上幾乎沒有表達，而Siglece^-/-小鼠在所有這些免疫細胞上都沒有表達Siglec-E（圖4e,f）。Siglec-E在腫瘤浸潤白細胞中的表達與接種CT2A膠質瘤細胞的小鼠同系腫瘤中的脾和淋巴結中的表達相似（圖4g）。Siglece的缺失明顯阻礙了內臟腫瘤的生長（圖4h），從而延長小鼠的存活時間（圖4i）。鑒于Siglec-E在其他髓系細胞上也有表達（圖 4d-g），使用CSF1R單克隆抗體阻斷導致巨噬細胞的大量消減和 TAM在腫瘤中的浸潤，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的耗竭完全消除Siglece基因缺陷小鼠的腫瘤生長抑制（圖4j）。將骨髓衍生巨噬細胞（BMDMs）轉移到腫瘤小鼠體內，評估腫瘤生長和小鼠存活率。發(fā)現(xiàn)移植的Siglece^-/- BMDMs阻礙WT 腫瘤小鼠的腫瘤生長，并延長小鼠的存活時間，復制Siglece^-/-小鼠腫瘤生長受阻和存活時間延長的現(xiàn)象（圖4k、l）。相反，與WT BMDCs相比，被轉移的Siglece^-/-骨髓源性DCs（BMDCs）對腫瘤生長沒有不同的影響（圖4m,n）。這些結果表明，在小鼠GBM模型中，表達Siglece的巨噬細胞是介導腫瘤根除的主要細胞群。

圖4. SIGLEC9⁺巨噬細胞與不良臨床結局有關，Siglece基因缺失阻礙小鼠GBM模型腫瘤的生長 

8. Siglece基因缺失激活巨噬細胞和T細胞
       利用scRNA-seq分析評估Siglece^-/-小鼠的顱內腫瘤微環(huán)境（圖5a）。觀察到 Siglece^-/-小鼠腫瘤中的免疫細胞，包括巨噬細胞、T細胞、NK細胞和DCs大量增加（圖5b）。巨噬細胞增加參與抗腫瘤反應的基因的表達，包括趨化因子，如 Ccl3、Ccl4、Ccl5、Ccl7、Ccl8、Ccl9、Cxcl9和Cxcl10，它們能招募和激活細胞溶解性T細胞，以及IFN-γ刺激基因，如Isg15（圖5c,d）。與WT腫瘤相比，體內Siglece^-/-腫瘤中T細胞表達更高水平的Il2、Il17a和Ifng（圖5d）。流式細胞熒光分選技術（FACS）分析顯示，與 WT 相比，Siglece 基因缺失后，CD45⁺細胞、骨髓細胞（CD11b⁺、F4/80⁺、Ly6C⁺和DCs）和淋巴細胞（CD4⁺T、CD8⁺T 和NK細胞）的浸潤明顯增加（圖5e），這與scRNA-seq分析結果一致。皮下腫瘤的實時PCR分析也驗證了這些結果（圖5f）。接下來，分析了瘤內巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)Siglece^-/-巨噬細胞中CD80和MHC-II等活化標記物的表達增加（圖5g）。與WT BMDMs相比，將Siglece^-/- BMDMs與CT2A細胞共培養(yǎng)顯著增加趨化因子的表達，包括Ccl4、Ccl8和Cxcl9（圖5h）。當與CT2A細胞共培養(yǎng)時，BMDMs中Siglece的缺失顯著增加Il4和Il10的表達（圖5i）。雖然Siglece缺失增加Pd-l1的表達，但與WT BMDMs共培養(yǎng)后，Pd-l1的表達仍與WT BMDMs 相似（圖5i）。Siglece^-/- BMDMs分別顯著增加來OT-II或OT-I轉基因小鼠的CD4⁺和CD8⁺T細胞的增殖比例（圖5j,k）。來自Siglece基因缺失小鼠的腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）也顯示出CD107a、IFN-γ和Ki67等活化標志物的表達增加（圖 5l）。此外，在WT小鼠皮下腫瘤生長過程中，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞上Siglec-E的表達增加，而DC上的表達卻沒有增加（圖5m）。這一結果進一步支持了負反饋環(huán)的存在，在負反饋環(huán)中，Siglece可防止免疫系統(tǒng)的過度反應，并作為巨噬細胞的免疫檢查點。

圖5. Siglece基因缺失導致免疫細胞浸潤、巨噬細胞和T細胞活化增強。

9. Siglece^-/-與T細胞合作抑制腫瘤生長
       使用抗體特異性地清除WT小鼠和Siglece^-/-小鼠皮下腫瘤中的CD4⁺或CD8⁺T細胞。Siglece^-/-小鼠中消耗CD4⁺T細胞明顯降低腫瘤生長抑制作用，導致腫瘤生長率與WT小鼠相似（圖6a）。在Siglece^-/-或WT小鼠中消耗CD8⁺T細胞導致Siglece缺失型小鼠無法抑制腫瘤生長，而與WT小鼠相比加速腫瘤生長，這表明Siglec-E可能以CD8⁺T細胞細胞毒性依賴的方式介導腫瘤排斥反應（圖6b）。這些結果表明，靶向Siglece減輕Siglece⁺TAMs的免疫抑制屬性，而這種屬性是由CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞介導的。
10. SIGLEC9⁺TAMs直接與GBM中的T細胞相互作用
       將WT或Siglece^-/-BMDMs共同培養(yǎng)并評估T細胞遷移（圖6c）。與WT BMDMs相比，Siglece^-/- BMDMs顯著增強CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞的遷移（圖6d）。這些結果表明，SIGLEC9⁺/Siglece⁺巨噬細胞直接招募T細胞。對ST 數(shù)據(jù)中CD68⁺SIGLEC9⁺細胞與T細胞特征的共定位分析表明，應答者樣本中的 T_H1和共刺激特征有所增加（圖6e、f）。多重IHC顯示，與非應答者樣本相比，應答者樣本中CD68⁺Siglec-9⁺細胞與CD8⁺PD-1⁺T細胞的空間距離更近（圖6g,h）。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，SIGLEC9⁺TAMs通過各種基因對與T細胞廣泛相互作用，如CCL4-CCR5、CCL3-CCR5、SPP1-CD44、SPP1-CC8、CD40-CD40LG和4-1BBL-4-1BB（圖6j）。在小鼠GBM中也發(fā)現(xiàn)了這些相互作用，而且Siglece 缺失會增強這些相互作用，支持它們是Siglec-9/Siglec-E依賴性相互作用的觀點（圖6k）。

圖6. 靶向Siglece⁺巨噬細胞與T細胞合作抑制腫瘤生長，且Siglece⁺/SIGLEC9⁺巨噬細胞與T細胞在空間上相關

11. Siglece基因缺失提高抗PD-1/PD-L1療法的療效
       WT或Siglece -/-小鼠顱內接種CT2A膠質瘤細胞，用抗PD-1或抗PD-L1抗體治療（圖7a）。與不進行治療、單獨進行Siglece基因缺失和單獨進行PD-1/PD-L1阻斷治療相比，Siglece基因缺失與抗PD-1或抗PD-L1抗體相結合可顯著延長生存期（圖7b,c）。用由Siglec-E細胞外結構域與小鼠IgG2a Fc結構域融合而成的重組蛋白（Siglec-E-Fc）治療顱內腫瘤小鼠，與IgG治療相比，小鼠存活時間延長（圖7d,e）。Siglec-E-Fc可與腫瘤細胞膜上的唾液酸化蛋白或游離的唾液酸化蛋白結合，從而與巨噬細胞上的內源性Siglec-E競爭，阻斷Siglec-E信號傳導（圖7f）。

圖7. Siglece缺失增強ICB療法的療效，Siglece是治療GBM的潛在治療靶點

結論
       綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Siglec-9是一種新穎的巨噬細胞免疫檢查點分子，可以作為靶點提高抗PD-1/PD-L1治療GBM的療效，為GBM的治療提供了新的思路。

實驗方法
小鼠GBM模型構建，ICB處理，治療性Siglec-E-Fc競爭實驗，流式細胞術，胞內細胞因子染色，細胞培養(yǎng)，Transwell，RT-qPCR，人體組織芯片免疫染色和分析，多重免疫熒光，scRNA-seq文庫構建，差異基因表達（DGE）分析，基因本體（GO）分析，單細胞熵值分析，單細胞軌跡構建，細胞互作評估，拷貝數(shù)變異（CNV）檢測，細胞亞群的組織富集，空間轉錄組文庫制備，bulk RNA-seq
參考文獻
Mei Y, Wang X, Zhang J, Liu D, He J, Huang C, Liao J, Wang Y, Feng Y, Li H, Liu X, Chen L, Yi W, Chen X, Bai HM, Wang X, Li Y, Wang L, Liang Z, Ren X, Qiu L, Hui Y, Zhang Q, Leng Q, Chen J, Jia G. Siglec-9 acts as an immune-checkpoint molecule on macrophages in glioblastoma, restricting T-cell priming and immunotherapy response. Nat Cancer. 2023 Jul 17. doi: 10.1038/s43018-023-00598-9. Epub ahead of print. PMID: 37460871.