脂肪自噬在糖尿病神經(jīng)性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用

       糖尿病產(chǎn)生慢性炎癥和脂質(zhì)代謝紊亂。小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)損傷是糖尿病相關(guān)認(rèn)知障礙（DACI）的突出特征。在本研究中，作者揭示了高糖（HG）抑制脂肪自噬促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)脂滴（LDs）和骨髓細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體1（TREM1）積累，積累的LDs與TREM1共定位反過來加劇HG誘導(dǎo)的脂肪自噬損傷，隨后通過NLRP3炎癥小體促進(jìn)HG介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。而LP17對TREM1的藥理學(xué)阻斷抑制LD和TREM1積累，減少海馬神經(jīng)元的炎癥損傷。該研究于2023年5月發(fā)表在《Autophagy》，IF：13.3。
技術(shù)路線

1. db/db小鼠和HFD/STZ小鼠海馬體小膠質(zhì)細(xì)胞中LDs積累和脂肪自噬受損
       作者首先觀察到LDs在大腦皮層和海馬體中的積累顯著增加（圖1A）。用小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物AIF1/IBA1、成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、神經(jīng)元標(biāo)記物RBFOX3/NeuN和PLIN2或BODIPY對冠狀腦切片進(jìn)行免疫染色。作者觀察到LDs主要積累在小膠質(zhì)細(xì)胞中，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中很少出現(xiàn)（圖1A，1B）。作者之后的分析主要集中在海馬體，因?yàn)樗窃u估認(rèn)知功能的關(guān)鍵區(qū)域。瘦素受體缺陷（db/db）小鼠海馬體中增加的PLIN2⁺ LDs與AIF1⁺小膠質(zhì)細(xì)胞主要集中在CA3區(qū)域（圖1A）。LDs免疫染色進(jìn)一步證實(shí)增加的LDs主要分布在海馬體CA3區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞中（圖1C）。
       透射電鏡結(jié)果顯示，db/db小鼠海馬體中LDs增加，脂肪自噬體減少（圖1D）。免疫染色結(jié)果顯示，在AIF1⁺海馬體小膠質(zhì)細(xì)胞中，MAP1LC3B/LC3點(diǎn)顯著減少，而SQSTM1/p62點(diǎn)顯著富集（圖1E）。

圖1：低密度脂蛋白在db/db小鼠海馬體小膠質(zhì)細(xì)胞中積累和脂肪自噬受損

2. HG抑制脂肪自噬促進(jìn)LDs在體外小膠質(zhì)細(xì)胞中積累
       作者用db/m和db/db小鼠收集的血漿處理BV2細(xì)胞。在db/db小鼠高血糖血漿處理的BV2細(xì)胞中，BODIPY陽性和PLIN2陽性的LDs顯著增加（圖2A）。接下來，作者使用含有不同濃度葡萄糖（5.5、25和50 mM）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BV2細(xì)胞，并通過不同的培養(yǎng)時間點(diǎn)（24、48和72 h）來探索高糖是否在LDs積累中起關(guān)鍵作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25和50 mM葡萄糖處理的BV細(xì)胞中觀察到LDs呈時間依賴性積累，并在培養(yǎng)72 h后達(dá)到積累峰值（圖2B）。因此，在接下來的體外實(shí)驗(yàn)中，作者均采用25 mM葡萄糖培養(yǎng)72 h。作者發(fā)現(xiàn)db/db小鼠血漿（圖2C）和25 mM葡萄糖（圖2D）處理的BV2細(xì)胞中LC3B點(diǎn)減少和SQSTM1點(diǎn)增加，這暗示脂肪自噬的減少。透射電鏡結(jié)果也證實(shí)HG刺激BV2細(xì)胞中LDs積累和脂肪自噬損傷（圖2E）。
       然后，作者利用自噬抑制劑巴霉素A1（Baf）和活化劑雷帕霉素（RAPA）誘導(dǎo)BV2細(xì)胞。Baf顯著誘導(dǎo)LC3B-II和SQSTM1表達(dá)水平，表明HG抑制脂肪自噬的開始，而不是自噬-溶酶體融合階段（圖2F）。RAPA則恢復(fù)HG受損的脂肪自噬（LC3B-II增加和SQSTM1減少）和LDs積累（PLIN2減少）（圖2G），表明HG抑制脂肪自噬是LDs在BV2細(xì)胞中積累的原因。

圖2：HG抑制脂肪自噬是LDs在小膠質(zhì)細(xì)胞中積累的原因。

3. T2DM老年患者血漿誘導(dǎo)人小膠質(zhì)細(xì)胞HMC3中LDs積累并抑制脂肪自噬
       接下來，作者使用T2DM（2型糖尿?。├夏昊颊哐獫{和健康對照處理HMC3細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。血清糖化ALB是代表過去2-4周平均血糖水平的血糖監(jiān)測指標(biāo)，T2DM患者的血清糖化ALB水平顯著高于健康對照組（圖3A）。用高血糖血漿處理后，HMC3細(xì)胞中PLIN2⁺ HMC3細(xì)胞百分比顯著增加，以及SQSTM1點(diǎn)增加和LC3B點(diǎn)減少（圖3B和C）。PLIN2⁺ HMC3細(xì)胞數(shù)量與DSST評分呈負(fù)相關(guān)（P=0.029）（圖3D）。
       作者用5.5 mM和25 mM葡萄糖處理HMC3細(xì)胞，觀察到在HG處理的細(xì)胞中，PLIN2⁺ LDs和SQSTM1點(diǎn)數(shù)量顯著增加，而LC3B點(diǎn)數(shù)量減少（圖3E）。此外，HG誘導(dǎo)PLIN2和SQSTM1表達(dá)，并抑制LC3B-II的表達(dá)（圖3F）?？傊芯拷Y(jié)果表明，HG在體外和體內(nèi)均損害小膠質(zhì)細(xì)胞的脂肪自噬并觸發(fā)LDs積累。

圖3： T2DM老年患者血漿誘導(dǎo)LDs在人HMC3細(xì)胞中積累并抑制親脂性

4. HG培養(yǎng)和高血糖血漿培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞以及db/db小鼠和HFD/STZ小鼠的海馬體小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生TREM1積累
       小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM和TREML受體是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵受體。HG刺激后，HMC3（圖4A）和BV2細(xì)胞中TREM1和TREM2 mRNA水平均顯著降低。與mRNA降低水平相反，HG在HMC3細(xì)胞（圖4B）和BV2細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)TREM1蛋白水平。接下來，作者發(fā)現(xiàn)db/db小鼠和db/m小鼠海馬體中TREM1 mRNA表達(dá)沒有顯著差異，但db/db小鼠海馬體中其蛋白表達(dá)明顯提高（圖4C）。免疫染色結(jié)果顯示，在BV2細(xì)胞（圖4D）和高血糖血漿處理的HMC3細(xì)胞（圖4E）中，TREM1⁺細(xì)胞百分比顯著增加。此外，TREM1⁺ HMC3細(xì)胞百分比與DSST評分呈負(fù)相關(guān)（P=0.00008）（圖4E）。作者對T2DM點(diǎn)和對照小鼠腦切片進(jìn)行免疫染色，發(fā)現(xiàn)在db/db和高脂肪飲食與STZ（HFD/STZ）小鼠海馬體中，增加的TREM1與AIF1⁺小膠質(zhì)細(xì)胞共染色（圖4F）。

圖4：高血糖血漿或HG培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和db/db小鼠海馬體小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM1蛋白水平升高

5. 體內(nèi)外小膠質(zhì)細(xì)胞中HG誘導(dǎo)TREM1與LDs共定位
       用T2DM患者血漿或HG培養(yǎng)后，TREM1點(diǎn)主要富集或重疊在HMC3細(xì)胞PLIN2⁺ LDs中（圖5A和B）。在高血糖血漿培養(yǎng)的HMC3細(xì)胞中，TREM1簇和PLIN2⁺ LDs共定位顯示出不同形態(tài)。如圖5C所示，TREM1位于PLIN2⁺ LDs相鄰區(qū)域（頂板），或部分重疊于PLIN2⁺區(qū)域（第二面板），或完全被PLIN2⁺ LDs吞沒（第三面板）。此外，正在進(jìn)行融合的LDs中也觀察到TREM1簇富集。db/db小鼠血漿培養(yǎng)的BV2細(xì)胞中也觀察到這些不同形態(tài)（圖5D）。在db/db和HFD/STZ小鼠海馬體小膠質(zhì)細(xì)胞中，還檢測到TREM1與PLIN2⁺ LDs共定位（圖5E）。
       接下來，作者對HMC3細(xì)胞進(jìn)行co-IP，證實(shí)TREM1和PLIN2在HG環(huán)境中發(fā)生相互作用（圖5F）。在HG處理的細(xì)胞中添加RAPA后，TREM1及其下游蛋白磷酸化脾臟酪氨酸激酶（SYK）表達(dá)顯著下降（圖5C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HG誘導(dǎo)TREM1與積累的LDs共定位可能有助于體內(nèi)外小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM1的積累。

圖5：HG在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM1與LDs共定位。

6. HG刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM1通路抑制挽救脂肪自噬受損和LDs積累
       TREM1在自噬中起關(guān)鍵作用。作者探索了HG誘導(dǎo)TREM1共定位以及隨后TREM1高水平表達(dá)是否會反過來影響小膠質(zhì)細(xì)胞脂肪自噬和LDs積累（圖6A）。BV2細(xì)胞中TREM1經(jīng)shRNA敲除顯著降低磷酸化SYK表達(dá)，如LC3B-II水平增加以及SQSTM1和PLIN2水平降低所示（圖6B），HG誘導(dǎo)的親脂性損傷和LDs積累減少。然后用TREM1特異性抑制肽LP17共同處理HG誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞。如圖6C所示，LP17給藥顯著減少HG誘導(dǎo)的SQSTM1點(diǎn)和PLIN2點(diǎn)聚集，并恢復(fù)HG在BV2細(xì)胞中誘導(dǎo)的磷酸化SYK、LC3B-II、SQSTM1和PLIN3表達(dá)（圖6D）。在HG誘導(dǎo)的HMC3細(xì)胞（圖6E和F）中觀察到LP17類似作用，這表明抑制TREM1可以恢復(fù)HG刺激小膠質(zhì)細(xì)胞中脂肪自噬損傷和LDs積累。

圖6：TREM1抑制恢復(fù)HG刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞中脂肪自噬損傷和LDs積累

7. db/db模型和HFD/STZ模型中TREM1的藥理學(xué)阻斷改善認(rèn)知功能
       接下來，作者驗(yàn)證TREM1在db/db模型和HFD/STZ認(rèn)知障礙模型中的生物學(xué)功能。db/db和HFD/STZ小鼠腹膜內(nèi)注射LP17。LP17給藥2周后，通過Morris Water Maze（MWM）測試評估每只db/db小鼠的認(rèn)知功能。LP17給藥顯著改善db/db小鼠平臺穿越時間和在目標(biāo)象限中花費(fèi)的時間（圖7A）。且注射LP17期間，平均游泳速度沒有顯著差異（圖7B）。作者還評估了海馬體神經(jīng)元凋亡和突觸可塑性。LP17給藥顯著減少db/db小鼠海馬體中TUNEL⁺（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP生物素缺口末端標(biāo)記）凋亡神經(jīng)元數(shù)量。給予LP17顯著恢復(fù)db/db小鼠海馬體中下調(diào)的DLG4（突觸后標(biāo)志物）表達(dá)水平（圖7C）。關(guān)于LP17對神經(jīng)炎癥的影響，在接受LP17的db/db小鼠中，促炎因子（NOS2、TNF、IL6和IL1B）產(chǎn)生顯著降低（圖7D）。最后，作者發(fā)現(xiàn)LP17顯著減少db/db小鼠海馬體CA3區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞中LDs積累，并促進(jìn)細(xì)胞親脂性，這與作者的體外結(jié)果一致（圖7E和F）。

圖7： db/db模型中TREM1經(jīng)藥物阻斷能夠改善認(rèn)知功能，減少海馬體神經(jīng)元變性，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥

結(jié)論
       HG抑制的脂肪自噬是小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)LDs積累的原因。LDs積累與小膠質(zhì)細(xì)TREM1共定位，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞TREM1積累，反過來加劇HG誘導(dǎo)的脂肪自噬損傷，隨后通過NLRP3炎癥小體促進(jìn)HG介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。此外，在db/db小鼠和HFD/STZ小鼠中，LP17可藥理學(xué)阻斷TREM1從而抑制LDs和TREM1的積累，減少海馬體神經(jīng)元炎癥損傷，從而改善認(rèn)知功能。

實(shí)驗(yàn)方法
免疫染色，透射電鏡，MWM測試，TUNEL評估，細(xì)胞體外培養(yǎng)，RT-qPCR，Western blotting ，Co-IP，ELISA，ROS試驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
Li Q, Zhao Y, Guo H, Li Q, Yan C, Li Y, He S, Wang N, Wang Q. Impaired lipophagy induced-microglial lipid droplets accumulation contributes to the buildup of TREM1 in diabetes-associated cognitive impairment. Autophagy. 2023 May 19:1-18. doi: 10.1080/15548627.2023.2213984. Epub ahead of print. PMID: 37204119.