TMEM11通過METTL1介導(dǎo)的ATF5 mRNA的m7G甲基化調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖和心臟修復(fù)

       線粒體跨膜(TMEM)蛋白家族具有幾種重要的生理功能。然而，其在心肌細(xì)胞增殖和心臟再生中的作用尚不清楚。在這里，我們檢測(cè)到TMEM11在體外抑制心肌細(xì)胞增殖和心臟再生。TMEM11缺失可增強(qiáng)心肌細(xì)胞增殖，恢復(fù)心肌損傷后的心功能。相反，TMEM11過表達(dá)抑制小鼠心臟新生心肌細(xì)胞增殖和再生。TMEM11直接與METTL1相互作用，增強(qiáng)Atf5 mRNA的m7G甲基化，從而增加ATF5的表達(dá)。ATF5上TMEM11依賴性的增加促進(jìn)了Inca1的轉(zhuǎn)錄，Inca1是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制劑，與細(xì)胞周期蛋白A1相互作用，抑制心肌細(xì)胞增殖。因此，我們的研究結(jié)果表明，TMEM11介導(dǎo)的m7G甲基化參與心肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，靶向TMEM11-METTL1-ATF5-INCA1軸可能是促進(jìn)心臟修復(fù)和再生的一種新的治療策略。本文于2023年6月發(fā)表于Cell Death & Differentiation（IF=12.4）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）抑制TMEM11可促進(jìn)體外心肌細(xì)胞增殖
       為了研究線粒體蛋白在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖中的潛在作用，我們回顧了文獻(xiàn)中報(bào)道的線粒體蛋白，并分析了它們?cè)谛呐K中的位置和表達(dá)。有趣的是，我們觀察到線粒體內(nèi)膜蛋白TMEM11分布在心肌細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中(圖1a)。TMEM11蛋白在小鼠出生后心臟中的表達(dá)模式顯示，TMEM11蛋白水平在出生時(shí)相對(duì)較低，在成年期增加(圖1b)，表明TMEM11表達(dá)可能與成年小鼠心臟再生能力的喪失有關(guān)。此外，TMEM11的表達(dá)增加主要在細(xì)胞核中觀察到，而在成年小鼠心臟的細(xì)胞質(zhì)或線粒體中未檢測(cè)到顯著增加(圖1c)。因此，我們推測(cè)TMEM11在心肌細(xì)胞增殖和心臟再生中具有潛在的調(diào)節(jié)作用。為了驗(yàn)證TMEM11在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖中的作用，我們構(gòu)建了含有TMEM11靶向shRNA (TMEM11-shRNA)的重組腺病毒載體，以沉默新生小鼠心肌細(xì)胞中TMEM11的表達(dá)(圖1d)。TMEM11的沉默增加了心肌細(xì)胞中增殖標(biāo)志物的表達(dá)，如ki67陽性細(xì)胞(圖1e)，有絲分裂標(biāo)志物磷酸組蛋白H3 (pH3)陽性細(xì)胞(圖1f)，和細(xì)胞分裂標(biāo)志物Aurora B陽性細(xì)胞(圖1g, h)的增加。接下來，我們?cè)谛募〖?xì)胞中過表達(dá)TMEM11(圖1i)，外源性TMEM11表達(dá)顯著降低了增殖標(biāo)志物的表達(dá)(圖1j)。這些數(shù)據(jù)表明，TMEM11的消融促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，而其過表達(dá)抑制細(xì)胞周期進(jìn)展。

2）體內(nèi)TMEM11缺乏可重新激活心肌細(xì)胞增殖
       為了研究TMEM11敲除對(duì)體內(nèi)心肌細(xì)胞增殖的影響，我們產(chǎn)生了TMEM11敲除(TMEM11 KO)小鼠，通過western blot分析證實(shí)了小鼠心臟中TMEM11的缺失(圖2a)。在生理?xiàng)l件下，WT和TMEM11 KO小鼠的心臟組織形態(tài)、心體重量比和心功能沒有顯著差異(圖2b-d)。與WT小鼠相比，敲除TMEM11增加了ki67陽性細(xì)胞的數(shù)量(圖2e)。同樣，在TMEM11缺失的成年小鼠心臟中，pH3陽性(圖2f, g)和Aurora B陽性細(xì)胞(圖2h)的數(shù)量明顯高于WT小鼠。綜上所述，這些結(jié)果表明TMEM11的缺失增強(qiáng)了體內(nèi)心肌細(xì)胞的增殖。

3）敲除TMEM11可促進(jìn)缺血損傷后心肌細(xì)胞增殖和心臟再生
       為了進(jìn)一步驗(yàn)證TMEM11沉默對(duì)成年心臟再生的影響，我們將TMEM11 KO和WT小鼠進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌梗死。與WT心臟相比，TMEM11 KO顯著減少了疤痕大小(圖3a)，心肌梗死后TMEM11 KO小鼠的左心室功能得到改善(圖3b)，表明TMEM11沉默介導(dǎo)了心肌細(xì)胞損傷后的修復(fù)潛力。同時(shí)，心肌損傷后TMEM11 KO心臟中Ki67陽性、pH3陽性和Aurora B陽性細(xì)胞數(shù)量較高(圖3c-f)，說明TMEM11的缺失通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖改善心肌損傷后心肌修復(fù)和心臟功能?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)證實(shí)，抑制TMEM11促進(jìn)了小鼠缺血損傷后的心臟再生。

4）TMEM11過表達(dá)抑制新生心臟心肌細(xì)胞增殖和心臟再生
       接下來，我們探討了TMEM11過表達(dá)是否抑制了新生心臟的心肌細(xì)胞增殖和心臟再生。我們培育了心臟特異性TMEM11轉(zhuǎn)基因(TMEM11 Tg)小鼠。在生理?xiàng)l件下，成年小鼠心臟形態(tài)、心體重比和心功能在Tg和WT小鼠之間均無差異(圖4a-c)。然而，與WT小鼠相比，Tg小鼠心臟的心肌細(xì)胞大小增加(圖4d)。此外，與WT小鼠相比，7日齡Tg小鼠心臟中Ki67陽性(圖4e)或pH3陽性細(xì)胞(圖4f)的數(shù)量顯著減少，表明TMEM11過表達(dá)抑制小鼠心肌細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步研究TMEM11過表達(dá)對(duì)新生心臟再生能力的影響，我們對(duì)1日齡TMEM11 Tg小鼠進(jìn)行心肌梗死，并在第7天進(jìn)行分析(P7)。與WT小鼠相比，TMEM11 Tg小鼠的Ki67陽性和pH3陽性細(xì)胞數(shù)量(圖4g)減少，纖維化面積增加(圖4h)。MI損傷后，與WT對(duì)照組相比，TMEM11 Tg小鼠的心功能受損 (圖4i)?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明TMEM11過表達(dá)通過抑制出生后心臟心肌細(xì)胞增殖來阻礙心臟再生。

5）TMEM11與METTL1相互作用并調(diào)節(jié)其RNA m7G甲基化活性
       我們的首要任務(wù)是研究與TMEM11相互作用的蛋白質(zhì)，以更好地了解TMEM11如何調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖。在富含抗TMEM11抗體的蛋白質(zhì)中，我們鑒定出了METTL1，一種RNA甲基轉(zhuǎn)移酶?？紤]到m7G mRNA甲基化在心肌細(xì)胞增殖和心臟再生中的功能尚不清楚，我們進(jìn)一步研究了METTL1。我們先進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行western blotting，并在體內(nèi)證實(shí)了TMEM11和METTL1的直接相互作用(圖5a, b)。為了確定TMEM11是否調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中METTL1依賴的m7G-甲基化，我們進(jìn)行了MeRIP-seq測(cè)序(圖5c)。在所有檢測(cè)到的m7G mRNA轉(zhuǎn)錄物中，超過一半(65.44%)含有一個(gè)m7G峰，4.67%含有四個(gè)或更多m7G峰(圖5d)。序列基序分析顯示，在METTL1的兩個(gè)保守一致基序序列中，m7G峰高度富集(圖5e)。在WT和TMEM11 Tg小鼠中，m7G峰主要分布在編碼序列(CDSs)上，特別是在起始和停止密碼子附近。然而，與WT小鼠相比，TMEM11 Tg小鼠的CDS和3 ' UTR之間區(qū)域的m7G峰密度相對(duì)較低(圖5f)。接下來，我們?cè)赥MEM11 Tg和WT小鼠心臟中進(jìn)行了RNA-seq分析，以探索m7G修飾與基因表達(dá)之間的關(guān)系(圖5g)，并將m7G peak數(shù)據(jù)與RNA-seq基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了對(duì)比，以將基因表達(dá)水平與m7G甲基化水平聯(lián)系起來(圖5h)。我們將上調(diào)的峰稱為高甲基化的m7G峰。我們將下調(diào)的峰稱為低甲基化的m7G峰。

6）TMEM11促進(jìn)METTL1依賴的Atf5 mRNA的m7G修飾，并增強(qiáng)其表達(dá)
       根據(jù)圖5h所示的結(jié)果，我們進(jìn)一步研究了TMEM11 Tg心臟心肌細(xì)胞增殖過程中METTL1的潛在下游靶點(diǎn)。我們對(duì)與增殖相關(guān)的差異甲基化基因進(jìn)行了MeRIP-qPCR檢測(cè)。我們的研究結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，TMEM11 Tg小鼠中Atf5 mRNA的m7G修飾增加最為顯著(圖6a)。此外，ATF5在TMEM11 Tg心臟中的表達(dá)顯著增加(圖6b)。Atf5 mRNA的整合基因組分析顯示，在TMEM11 Tg心臟中，m7G峰值顯著增加，同時(shí)Atf5 mRNA的表達(dá)也增加(圖6c)。相比之下，在TMEM11 KO心臟中，Atf5 mRNA的m7G修飾減少(圖6d)，同時(shí)Atf5 mRNA和蛋白的表達(dá)減少(圖6e)。這些結(jié)果促使我們選擇ATF5作為TMEM11-METTL1軸調(diào)控心肌細(xì)胞增殖的潛在靶點(diǎn)。接下來，我們研究了ATF5是否通過調(diào)節(jié)新生心肌細(xì)胞的增殖作為TMEM11的下游靶點(diǎn)。TMEM11過表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染siRNA-ATF5可挽救心肌細(xì)胞增殖(和圖6f)。此外，在成年小鼠心臟中使用AAV9系統(tǒng)(sh-ATF5)敲低ATF5(補(bǔ)充圖7c)可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖 (圖6g)，表明ATF5參與心肌細(xì)胞增殖和心臟再生的調(diào)節(jié)。我們研究了TMEM11調(diào)控ATF5表達(dá)的機(jī)制。與WT小鼠心臟相比，TMEM11 KO心臟中METTL1與Atf5 mRNA的結(jié)合明顯減少(補(bǔ)充圖，未展示)。此外，METTL1過表達(dá)增加了Atf5 mRNA的m7G修飾和增加Atf5表達(dá)，并且這些作用通過伴隨的TMEM11過表達(dá)而增強(qiáng)(補(bǔ)充圖，未展示)。此外，METTL1敲低降低了體內(nèi)和體外TMEM11過表達(dá)時(shí)Atf5 mRNA的m7G修飾及其表達(dá)(補(bǔ)充圖，未展示)。綜上所述，這些結(jié)果表明TMEM11通過METTL1介導(dǎo)Atf5 mRNA的m7G修飾，這種甲基化增強(qiáng)了mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力。

7）TMEM11在心肌細(xì)胞增殖過程中調(diào)控INCA1的表達(dá)
       為了探索ATF5的下游靶點(diǎn)，我們對(duì)過表達(dá)ATF5的心肌細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq分析(圖7a)。我們?cè)赗NA-seq數(shù)據(jù)集中篩選與增殖調(diào)控相關(guān)的差異表達(dá)基因。我們用qPCR驗(yàn)證了它們的表達(dá)。其中，與對(duì)照細(xì)胞相比，過表達(dá)ATF5的心肌細(xì)胞中只有Inca1、Myog和Fap的表達(dá)水平顯著升高(圖7b)。與WT相比，只有Inca1在TMEM11 KO小鼠的心臟中表達(dá)降低(補(bǔ)充圖，未展示)。因此，我們選擇INCA1進(jìn)行進(jìn)一步的研究。接下來，我們證明了ATF5敲低降低了Inca1 mRNA和蛋白的表達(dá)(圖7c)，表明ATF5轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)了Inca1的表達(dá)。我們還在Inca1基因的啟動(dòng)子區(qū)域觀察到ATF5結(jié)合的共同基序(圖7d)，并使用ChIP-qPCR驗(yàn)證了ATF5與該序列的結(jié)合(圖7e)。此外，ATF5過表達(dá)后觀察到Inca1啟動(dòng)子區(qū)域顯著富集(圖7e)。與這些體外研究結(jié)果一致，與WT心臟相比，TMEM11 KO小鼠心臟中的Inca1 mRNA和蛋白表達(dá)降低(圖7f)，而TMEM11 Tg小鼠心臟中的Inca1表達(dá)水平顯著升高(圖7g)。在心肌細(xì)胞中，TMEM11增加了Inca1的表達(dá)水平，而這些作用通過敲除ATF5而減弱(圖7h)。綜上所述，這些結(jié)果表明INCA1作為TMEM11/ATF5通路的下游靶點(diǎn)，抑制出生后心肌細(xì)胞的增殖和再生。

結(jié)論
       我們的研究揭示了TMEM11依賴性m7G修飾調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖的新機(jī)制。靶向TMEM11-METTL1-ATF5軸可能是促進(jìn)心臟損傷后心臟再生的有效策略。

實(shí)驗(yàn)方法
MeRIP-qPCR，免疫熒光，MeRIP測(cè)序，TTC染色，HE染色，Masson染色，免疫沉淀，RIP，線粒體膜電位測(cè)定，質(zhì)譜，WB，RT-qPCR，ChIP，mRNA-seq。
參考文獻(xiàn)
Chen XZ, Li XM, Xu SJ, Hu S, Wang T, Li RF, Liu CY, Xue JQ, Zhou LY, Wang YH, Li PF, Wang K. TMEM11 regulates cardiomyocyte proliferation and cardiac repair via METTL1-mediated m7G methylation of ATF5 mRNA. Cell Death Differ. 2023 Jul;30(7):1786-1798. doi: 10.1038/s41418-023-01179-0.