USP13去泛素化并穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白D1，促進(jìn)胃癌細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖
蛋白質(zhì)泛素化和去泛素化的可逆翻譯后修飾在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。去泛素化酶（DUBs）負(fù)責(zé)從蛋白質(zhì)底物中去除泛素。DUBs的失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在本研究中，我們通過對(duì)TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的胃癌（gastric cancer，GC）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶USP13在GC樣本中顯著上調(diào)。USP13的高表達(dá)與GC患者更差的預(yù)后和更短的總生存期（OS）相關(guān)。在GC細(xì)胞中過表達(dá)USP13以酶促依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖。相反，抑制USP13導(dǎo)致GC細(xì)胞周期阻滯在G1期，細(xì)胞增殖受到抑制。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，在GC細(xì)胞中敲除USP13可以顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。在機(jī)制上，USP13與cyclin D1的N端結(jié)構(gòu)域物理結(jié)合，并去除其K48 -而不是K63 -連接的多聚泛素化鏈，從而穩(wěn)定和增加cyclin D1。此外，cyclin D1的重新表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了USP13缺失引起的GC細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞增殖抑制。此外，在人GC組織中，USP13蛋白豐度與cyclin D1蛋白水平呈正相關(guān)。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明USP13去泛素化并穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白D1，從而促進(jìn)GC細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖。這些發(fā)現(xiàn)表明USP13可能是治療GC的一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)。本研究于2023年6月發(fā)表在期刊《ONCOGENE》上，IF：8。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1、USP13在GC組織中高表達(dá)
首先，我們利用癌癥基因組學(xué)圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)查了USP13在不同腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)USP13在包括GC在內(nèi)的大多數(shù)消化系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)上調(diào)（圖1A）。GEO數(shù)據(jù)集（GSE27342）也顯示USP13在GC組織中表達(dá)上調(diào)（圖1B）。然后我們分析了USP13在不同GC分級(jí)和亞型中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，USP13的表達(dá)與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)（圖1C）。與正常相比，USP13在四種不同GC亞型中的表達(dá)均顯著升高，其中在EBV（epstein-barr virus）亞型中平均表達(dá)值最高，在GS（genomeally stable）亞型中表達(dá)最低（圖1D）。我們進(jìn)一步用western blot檢測(cè)了32對(duì)GC及癌旁組織中USP13的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)65.6%（21/32）的GC組織中USP13的蛋白水平升高（圖1E）。使用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，USP13的蛋白水平在GC組織（p < 0.01）中顯著升高（圖1F）。此外，我們利用Kaplan-Meier繪圖機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)分析USP13表達(dá)與GC患者總生存期（overall survival，OS）的相關(guān)性。由于Kaplan-Meier繪圖機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)集GSE62254包含了與其他所有數(shù)據(jù)集明顯不同的特征，因此我們將GSE62254從混合分析中剔除，單獨(dú)對(duì)GSE62254進(jìn)行分析。3個(gè)不同的Affymetrix探針（205356_at、227788_at、226902_at）的結(jié)果也顯示了類似的趨勢(shì)，即在不包括GSE62254的合并分析中（圖1G）和在單獨(dú)分析GSE62254（附圖S1）中，USP13在GC組織中的高表達(dá)導(dǎo)致GC患者的總生存期（overall survival，OS）縮短。
圖1 USP13在GC組織中的表達(dá)水平升高，且USP13的高表達(dá)與GC患者總生存期（OS）縮短相關(guān)
2、USP63敲低顯著抑制GC中細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖
已發(fā)表的GC隊(duì)列的基因富集分析（GSEA）中展示了USP13與細(xì)胞周期顯著相關(guān)（圖2A）。因此，我們研究了USP13對(duì)GC細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖的影響。我們使用攜帶陰性對(duì)照shRNA或USP13 shRNA的慢病毒感染AGS和MKN-45細(xì)胞。qRT-PCR和western blot結(jié)果證實(shí)，攜帶USP13 shRNA的慢病毒感染GC細(xì)胞后，USP13的表達(dá)水平明顯降低（圖2B、C）。隨后，我們利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)USP13的缺失導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期（圖2D）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，USP13的缺失明顯降低GC細(xì)胞的克隆形成能力（圖2E、F）。為進(jìn)一步驗(yàn)證USP13對(duì)GC細(xì)胞的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩條特異性靶向USP13的小干擾RNA（siRNA）并轉(zhuǎn)染GC細(xì)胞。通過qRT-PCR和western blot驗(yàn)證USP13在轉(zhuǎn)染的GC細(xì)胞中的有效敲低（圖2G、H）。EdU和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果表明，USP13敲低顯著抑制GC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力（圖2I-K）。
圖2 敲低USP13誘導(dǎo)GC細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖和集落形成能力
3、USP13過表達(dá)以DUB酶活性依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖
為進(jìn)一步研究USP13過表達(dá)是否具有相反的作用，我們將USP13過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到GC細(xì)胞（附圖S3A、B）中。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，EdU和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，過表達(dá)USP13導(dǎo)致GC細(xì)胞（附圖S3C）的G1期細(xì)胞數(shù)量減少，GC細(xì)胞（附圖S3D-F）的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。
我們接著詢問USP13的DUB活性是否對(duì)其生物學(xué)功能至關(guān)重要。我們分別將WT-USP13載體和催化失活突變體USP13-C345A轉(zhuǎn)染GC細(xì)胞。驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率（圖3A）。然后測(cè)定細(xì)胞周期分布、細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力。我們的結(jié)果顯示，過表達(dá)WT-USP13載體顯著促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程（圖3B）、細(xì)胞增殖能力（圖3C-E）和克隆形成能力（圖3F-G），而過表達(dá)USP13-C345A幾乎消除了WT-USP13載體轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和克隆形成能力。這些結(jié)果表明USP13的DUB活性對(duì)其功能至關(guān)重要。
附圖3 USP13的過表達(dá)促進(jìn)了GC細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖能力
圖3 在GC細(xì)胞中過表達(dá)野生型USP13，而不表達(dá)USP13突變體C345A，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖能力。
4、USP13增加GC細(xì)胞中cyclin D1的穩(wěn)定性
在明確了USP13在GC中的生物學(xué)作用后，我們進(jìn)一步研究了其潛在的調(diào)控機(jī)制。由于USP13的功能與細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)，我們研究了USP13對(duì)cyclin D1和一系列其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響，包括cyclin D2、cyclin D3、cyclin E、CDK2、CDK4、p21和p27。如Fig 4A、B所示，USP13 siRNAs顯著降低了cyclin D1蛋白水平，而對(duì)其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白無(wú)明顯影響。相反，USP13的增強(qiáng)表達(dá)以劑量依賴的方式增加了cyclin D1的蛋白水平（圖4C），而失去酶活性的突變USP13-C345A對(duì)cyclin D1的表達(dá)無(wú)明顯影響（圖4D）。
在GC細(xì)胞（附圖S4A , B）中，USP13敲低或過表達(dá)均不改變cyclin D1 mRNA水平。為進(jìn)一步證實(shí)USP13調(diào)控內(nèi)源性cyclin D1的穩(wěn)定性，我們用USP13 siRNA或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染GC細(xì)胞，然后用蛋白合成抑制劑CHX處理細(xì)胞不同時(shí)間。我們的結(jié)果顯示，在GC細(xì)胞中，敲低USP13降低了cyclin D1的半衰期，促進(jìn)了cyclin D1的降解，而過表達(dá)WT USP13，但不影響USP13 -的表達(dá)（圖4E、F）。C345A突變體延長(zhǎng)了cyclin D1的半衰期，延緩了其降解（圖4G、H）。為進(jìn)一步探究蛋白酶體降解途徑是否參與USP13介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白D1的穩(wěn)定，我們用蛋白酶體抑制劑MG132處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MG132緩解了USP13 siRNA誘導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白D1下調(diào)（圖4I）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明USP13通過抑制其蛋白酶體降解途徑穩(wěn)定cyclin D1。此外，我們測(cè)定了34個(gè)GC樣品中USP13和cyclin D1的蛋白豐度，發(fā)現(xiàn)這些GC組織中USP13與cyclin D1呈正相關(guān)（圖4J、K）。
圖4 USP13增加cyclin D1表達(dá)，維持其蛋白穩(wěn)定性
5、在GC細(xì)胞中，USP13直接與cyclin D1相互作用
為深入了解USP13對(duì)cyclin D1的調(diào)控作用，我們檢測(cè)了USP13是否與cyclin D1存在相互作用。我們將帶有Myc標(biāo)簽的cyclin D1（Myc-cyclin D1）和帶有Flag標(biāo)簽的USP13（Flag-USP13）轉(zhuǎn)染到HEK293T或不同的GC細(xì)胞中，并進(jìn)行外源性Co-IP實(shí)驗(yàn)。如圖5A所示，在轉(zhuǎn)染了Myccyclin D1和Flag-USP13的細(xì)胞中，用抗FLAG抗體免疫沉淀的Flag-USP13中可以檢測(cè)到Myc-cyclin D1。與此一致的是，F(xiàn)lag-USP13可以被帶有抗Myc抗體的Myc-cyclin D1下調(diào)（圖5B）。隨后我們檢測(cè)了內(nèi)源性相互作用，發(fā)現(xiàn)cyclin D1可以被USP13抗體下調(diào)（圖5C），而cyclin D2和cyclin D3不能被USP13抗體下調(diào)，USP13也可以被cyclin D1抗體下調(diào)（圖5D）。為檢測(cè)USP13與cyclin D1的直接相互作用，我們用GST-USP13重組蛋白進(jìn)行GST-pulldown實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，純化的GST-USP13蛋白可以將cyclin D1蛋白拉下來(lái)（圖5E）。此外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，USP13可以與GC細(xì)胞中的cyclin D1共定位（圖5F）。
為確定cyclin D1的哪個(gè)區(qū)域是與USP13相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，我們構(gòu)建了兩個(gè)cyclin D1缺失突變體（圖5G），并進(jìn)行了Co-IP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，cyclin D1的N端可以與USP13相互作用，而C端不能與USP13相互作用（圖5H）。USP13由一個(gè)UBP（泛素特異性加工蛋白酶）型鋅指、一個(gè)USP和兩個(gè)UBA（泛素相關(guān)/翻譯延伸因子EF1B ,氨基端）結(jié)構(gòu)域組成。我們構(gòu)建了5個(gè)USP13截短突變體（圖5G），并將Myc-cyclin D1與不同F(xiàn)lag標(biāo)簽的USP13突變體共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。如圖5I所示，USP13 UBA結(jié)構(gòu)域的缺失破壞了USP13與cyclin D1的相互作用，含有UBA結(jié)構(gòu)域的突變體能夠與Myc-cyclin D1相互作用，但不含USP和UBP結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明UBA結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂ccyclin D1的相互作用至關(guān)重要。出乎意料的是，與全長(zhǎng)USP13相比，UBP結(jié)構(gòu)域的缺失明顯降低了與cyclin D1的相互作用，表明UBP結(jié)構(gòu)域可能在USP13與cyclin D1的相互作用中發(fā)揮了一定的積極作用。
圖5 在GC細(xì)胞中，USP13直接與cyclin D1相互作用
6、USP13去除K48連接的Cyclin多泛素化鏈D1
為進(jìn)一步確定USP13是否去泛素化cyclin D1，我們將USP13 siRNAs或陰性對(duì)照siRNA與Myc-cyclin D1和HA-Ub共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)。如圖6A所示，在HEK293T細(xì)胞中，用siRNA敲低USP13增加cyclin D1的泛素化水平。相反，過表達(dá)Flag-USP13降低了HEK293T細(xì)胞和GC細(xì)胞中cyclin D1的泛素化水平（圖6B）。為進(jìn)一步研究USP13的去泛素化酶活性是否對(duì)該效應(yīng)至關(guān)重要，我們將WT-USP13或USP13-C345A突變體與Myc-cyclin D1和HA-Ub共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和GC細(xì)胞。Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體USP13-C345A不能降低cyclin D1的泛素化水平（圖6C），表明USP13的DUB活性對(duì)于cyclin D1的去泛素化是必不可少的。為確定USP13對(duì)cyclin D1的去泛素化類型，我們將Myc-cyclin D1與HA-Ub K48或K63突變體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，將除第48或63位賴氨酸外的所有賴氨酸殘基替換為精氨酸，同時(shí)或不與Flag-USP13共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。如圖6D所示，在WT和K48-Ub突變體存在的情況下，USP13降低了cyclin D1的泛素化水平，而在K63-Ub突變體存在的情況下，USP13并沒有降低cyclin D1的泛素化水平，說(shuō)明USP13主要鑒于USP13與cyclin D1的N端結(jié)構(gòu)域存在相互作用。
我們推測(cè)USP13可能去除了cyclin D1 N端結(jié)構(gòu)域中與賴氨酸（K）殘基相連的多聚泛素化鏈。細(xì)胞周期蛋白D1的N端（aa1 ~ 153）有12個(gè)賴氨酸殘基。根據(jù)之前的報(bào)道，在這些賴氨酸殘基中，有5個(gè)不同的賴氨酸（K33、K46、K50、K112、K114）被檢測(cè)為潛在的泛素化位點(diǎn)。我們將這五個(gè)位點(diǎn)的每個(gè)賴氨酸殘基突變?yōu)榫彼幔≧）。我們轉(zhuǎn)染了Myc標(biāo)記的WT-cyclinD1或不同的突變體 HEK293T細(xì)胞及HA-Ub、Flag-USP13。圖6E顯示，突變體K46R和K50R取消了USP13介導(dǎo)的去泛素化，表明USP13主要在K46和K50處去除了cyclin D1的多聚泛素化鏈。去除cyclin D1上K48連接的多聚泛素化鏈。
圖6 USP13去泛素化細(xì)胞周期蛋白D1
7、USP13基因敲低可抑制GC細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤發(fā)生
為研究USP13敲低是否抑制GC細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力，我們將穩(wěn)定敲低USP13的MKN-45GC細(xì)胞（shUSP13）或陰性對(duì)照（shNC）注射到裸鼠皮下。結(jié)果顯示，與shNC組（圖7A-C）相比，shUSP13組的腫瘤體積和腫瘤重量明顯更小、更輕。HE染色證實(shí)所有腫瘤均為實(shí)體腫瘤（圖7D）。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，shUSP13組腫瘤中USP13和cyclin D1蛋白表達(dá)降低（圖7E），而cyclin D1 mRNA水平無(wú)明顯變化（圖7F）。免疫組化（IHC）分析顯示，shUSP13組（圖7G , H）細(xì)胞核相關(guān)抗原（Ki67）表達(dá)顯著降低。
圖7 USP13敲低抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)
8、USP13通過cyclin D1調(diào)控GC細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖
為進(jìn)一步研究cyclin D1是否參與USP13介導(dǎo)的GC細(xì)胞生物學(xué)功能，我們進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。我們將USP13 siRNA和cyclin D1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染GC細(xì)胞（圖8A），以確定USP13 siRNA介導(dǎo)的生物學(xué)作用是否可以被cyclin D1所阻斷。集落形成、CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，cyclin D1可部分逆轉(zhuǎn)USP13 siRNA介導(dǎo)的抑制集落形成能力（圖8B、C）和細(xì)胞增殖能力（圖8D-F）的作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，cyclin D1可部分逆轉(zhuǎn)USP13 siRNA介導(dǎo)的細(xì)胞周期G1期阻滯（圖8G）。
圖8 Cyclin D1參與USP13介導(dǎo)的生物學(xué)功能。
實(shí)驗(yàn)方法
TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，siRNAs及過表達(dá)質(zhì)粒，RNA提取、反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR，Western Blot，免疫共沉淀（Co-IP），GST pull-down實(shí)驗(yàn)，免疫熒光，細(xì)胞周期分析，細(xì)胞增殖，克隆形成，慢病毒感染，BALB/c裸鼠，異種移植瘤實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
Ma C, Wang D, Tian Z, Gao W, Zang Y, Qian L, Xu X, Jia J, Liu Z. USP13 deubiquitinates and stabilizes cyclin D1 to promote gastric cancer cell cycle progression and cell proliferation. Oncogene. 2023 Jul;42（29）:2249-2262. doi: 10.1038/s41388-023-02739-x. Epub 2023 Jun 13. PMID: 37311811; PMCID: PMC10348911.