“中性粒細(xì)胞胞外陷阱”+“心肌細(xì)胞”助力房顫研究

       心房顫動（房顫）是一種常見的心律失常，與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率有關(guān)。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）是中性粒細(xì)胞釋放的具有胞漿蛋白的DNA片段，參與多種心血管疾病。為了闡明NETs在AF中的作用，作者研究了NETs對AF進(jìn)展的影響以及NETs在AF中的分泌情況。結(jié)果表明：NETs誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的自噬凋亡，NETs還通過促進(jìn)線粒體去極化和ROS產(chǎn)生導(dǎo)致線粒體損傷。持續(xù)的快速起搏導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)喪失，并提供強(qiáng)有力的刺激誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞分泌NETs。同時，AF中增加的AngⅡ通過上調(diào)AKT磷酸化促進(jìn)NETs形成，但由于未誘導(dǎo)自噬，AngⅡ不能直接啟動NETosis。在體內(nèi)實驗中，脫氧核糖核酸酶I被用來抑制NETs的形成，AF相關(guān)的纖維化也得到了預(yù)期的改善。相應(yīng)地，誘發(fā)AF的持續(xù)時間減少。作者的研究闡明了NETs在AF中的形成機(jī)制，并證明了NETs通過誘導(dǎo)線粒體損傷和自噬性細(xì)胞死亡對心肌細(xì)胞的致死作用，這全面描述了NETs和心肌細(xì)胞分泌的刺激組成的正反饋維持AF和AF相關(guān)纖維化的進(jìn)展。本研究于2023年7月發(fā)表于雜志《Signal Transduction and Targeted Therapy》上，IF：39.3。

技術(shù)路線

主要研究內(nèi)容
1、NETs與房顫有關(guān)
       為探討NETs與AF的可能關(guān)系，作者首先收集了AF或竇性心律（SR）患者的外周血。采用抗髓過氧化物酶（MPO）捕獲抗體和抗dsDNA檢測抗體的復(fù)合酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定NETs的相對濃度。如預(yù)期的那樣，AF患者外周血NETs水平顯著高于SR患者（圖1a）。同時比較左心耳組織勻漿中NETs濃度，也觀察到類似的趨勢（圖1b）。在AF患者冠狀靜脈竇口處采集冠狀動脈血液，并與外周血中NETs濃度進(jìn)行比較。有趣的是，血液通過冠狀動脈循環(huán)后NETs水平降低（圖1a）。因此，作者推測NETs可能在冠狀動脈血管中充血，這與心肌梗死（MI）的情況類似。為驗證這一假設(shè)，在左心耳切面進(jìn)行了免疫熒光染色，以識別和定位NETs，表明AF患者左心耳和冠狀動脈血管中NETs的形成（圖1c）。然而，與MI后NETs主要集中在冠狀動脈血管不同，AF中的NETs也分布于冠狀動脈血管外（圖1d）。

圖1 房顫患者NETs增加，對心肌細(xì)胞有細(xì)胞毒性

2、NETs通過促進(jìn)自噬導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡
       作者之前報道，NETs單獨(dú)激活Smad和MAPK信號通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化?？紤]到心臟重塑所必需的心肌細(xì)胞的丟失以及NETs含有豐富的細(xì)胞毒性蛋白酶，作者進(jìn)一步研究了NETs對心肌細(xì)胞是否具有毒性。在Nanolive 3D-全息顯微鏡下，作者連續(xù)監(jiān)測了與NETs孵育的心肌細(xì)胞，在心肌細(xì)胞中觀察到萎縮和核周顆粒增加（圖1e）。由于一些原代心肌細(xì)胞可能無法粘附在板上并發(fā)生凋亡，因此細(xì)胞殘留經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)粘附在正常的細(xì)胞上。而在流式細(xì)胞術(shù)中，附著的殘留物可能導(dǎo)致貼壁細(xì)胞的誤判。為更精確地識別死亡的心肌細(xì)胞，通過Celigo全視野分析代替碘化丙啶（PI）和Hoechst染色的聯(lián)合染色。正如預(yù)期的那樣，在NETs孵育的孔中PI陽性率升高（圖1f，g），WB檢測發(fā)現(xiàn)cleaved caspase3 / caspase 3的類似趨勢，進(jìn)一步得到支持（圖1h，i）。這些結(jié)果表明NETs對心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
       NETs孵育后，心肌細(xì)胞核周顆粒明顯增多。由于在自噬過程中增加的溶酶體也會遷移到核周區(qū)域，作者進(jìn)一步研究了自噬是否可能參與了NETs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。19免疫熒光染色顯示，與NETs孵育后，自噬水平上調(diào)（圖2a）。相應(yīng)地，p62和Beclin-1的蛋白水平也增加了（圖2b , c）。為了進(jìn)一步研究NETs是否誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬性死亡，使用3甲基腺嘌呤（3-MA）阻斷自噬。如預(yù)期的那樣，3-MA部分削弱了增加的cleaved caspase3（圖2d , e）。通過PI染色和Celigo分析（圖2f , g）也驗證了3-MA對NETs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

圖2 NETs通過上調(diào)心肌細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬死亡和線粒體損傷

3、NETs通過促進(jìn)線粒體去極化和活性氧的產(chǎn)生而導(dǎo)致線粒體損傷
       由于線粒體是心肌細(xì)胞收縮所必需的能量供應(yīng)，而功能失調(diào)的線粒體產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）可以促進(jìn)死亡，因此分析了NETs對心肌細(xì)胞線粒體的影響。心肌細(xì)胞中腫脹的線粒體與NETs孵育后顯著增加（圖2h）。為進(jìn)一步闡明NETs對線粒體的損傷作用，分別使用JC-1和MitoSOX比較線粒體膜電位和線粒體ROS（mtROS）的產(chǎn)生。正如預(yù)期的那樣，NETs導(dǎo)致線粒體膜電位去極化（圖2i，j）。心肌細(xì)胞經(jīng)NETs孵育后，線粒體ROS生成也增加（圖2k，l）。
4、僅Ang II不能直接啟動NETosis
       炎癥可以促進(jìn)AF的進(jìn)展，反過來，AF又可以促進(jìn)炎癥。然而，與MI相比，AF相關(guān)的炎癥反應(yīng)較弱，其中豐富的促炎細(xì)胞因子和氧化劑誘導(dǎo)NETosis。除了炎癥相關(guān)的刺激外，其他分子也普遍存在誘導(dǎo)NETosis的能力。Akt是NOX依賴的NETosis所必需的，在NETosis過程中，Akt的磷酸化水平上調(diào)。既往研究表明，AF中AngⅡ升高可誘導(dǎo)心臟重構(gòu)，而Akt的磷酸化可被AngⅡ1型（AT1）/受體信號通路激活而上調(diào)。與之前的報道類似，作者發(fā)現(xiàn)在AF患者的外周血中Ang II升高（圖3a）。Chrysanthopoulou等報道0.1 nM AngⅡ以ROS /自噬依賴的方式顯著誘導(dǎo)NETosis。然而，作者的結(jié)果表明AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不是NETosis。作者首先通過SYTOX Green染色和Celigo全視野分析比較了中性粒細(xì)胞與Ang II共孵育后NETs的分泌情況，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞與Ang II共孵育后細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）增加（圖3b，c）。然而，在相應(yīng)的Celigo IF圖片中，缺乏典型的NETs結(jié)構(gòu)（圖3b）。
       考慮到死亡細(xì)胞的細(xì)胞核也可以被SYTOX Green染色，作者進(jìn)一步測定了cleaved caspase 3的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Ang II誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性（圖3d，e）。此外，作者發(fā)現(xiàn)AngⅡ也不上調(diào)中性粒細(xì)胞的自噬（圖3f-h）。

圖3 AngⅡ不能啟動NETosis

5、Ang II促進(jìn)PMA誘導(dǎo)NETosis
       醋酸豆蔻酸鹽二萜醇（PMA），一種常見的佛波酯，強(qiáng)烈誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化。由于AngⅡ不能直接啟動NETosis，作者接下來研究了AngⅡ?qū)MA誘導(dǎo)的NETosis的影響。與Ang II立即誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡不同，在PMA和Ang II（濃度小于10 μM）孵育的大鼠中性粒細(xì)胞中沒有觀察到cleaved caspase 3的增加（圖4a、b）。當(dāng)PMA和AngⅡ共同孵育時，Akt的磷酸化進(jìn)一步上調(diào)，但與單獨(dú)AngⅡ孵育相比，磷酸化Akt的增加并不顯著。在自噬方面，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)中性粒細(xì)胞與10 nM PMA和10 μM Ang II共孵育時，LC3BII/I比值上調(diào)，然而，較高的Ang II濃度（100 μM）似乎可以逆轉(zhuǎn)PMA和Ang II單獨(dú)孵育的促自噬作用，并以劑量依賴的方式降低LC3BII/I比值。此外，共孵育導(dǎo)致中性粒細(xì)胞中更高的ROS產(chǎn)生（圖4c）。似乎當(dāng)PMA等強(qiáng)刺激超過其抗自噬作用時，AngⅡ可能發(fā)揮促NETosis作用。因此，作者推測AngⅡ可能通過間接協(xié)同刺激如PMA來促進(jìn)NETosis，而不是直接啟動這種特殊的細(xì)胞死亡。
       分離供者外周血中性粒細(xì)胞，分別與PMA或PMA +AngⅡ孵育。由于10 μM的AngⅡ沒有誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡，因此在后續(xù)的實驗中大多采用這一濃度。PMA與AngⅡ共孵育顯著增加SYTOX Green陽性率，比AngⅡ或PMA單獨(dú)作用產(chǎn)生的SYTOX Green陽性率增加更顯著（圖4d，e）。通過IF染色進(jìn)一步研究NETs分泌情況。用PMA刺激中性粒細(xì)胞30 min后，細(xì)胞核的去濃縮過程正在進(jìn)行，這在有或沒有Ang II存在的中性粒細(xì)胞中都沒有觀察到。同樣，當(dāng)血管緊張素濃度達(dá)到100 μM時，NETs結(jié)構(gòu)也消失，大量分葉狀細(xì)胞核（仍為濃縮狀）被染色。此外，單獨(dú)加入PMA和單獨(dú)加入10 μM Ang II的SYTOX Green計數(shù)的平均值遠(yuǎn)低于共孵育的SYTOX Green計數(shù)，說明Ang II具有促進(jìn)因子的作用（圖4f，g）。在組蛋白3瓜氨酸化中也觀察到類似的趨勢（圖4h，I）?？傮w而言，AngⅡ可以促進(jìn)NETosis，而不是直接啟動NETosis。

圖4 Ang Ⅱ促進(jìn)PMA誘導(dǎo)的NETosis和NETs分泌

6、速搏新生大鼠心肌細(xì)胞上清液可誘導(dǎo)NETosis，其表現(xiàn)為線粒體DNA增加和高流動性組盒1分泌增多
       由于單獨(dú)升高的AngⅡ并不能誘導(dǎo)NETosis的發(fā)生，因此AF中必須存在其他可能的刺激源才能誘導(dǎo)NETosis的發(fā)生。Mallavia等報道NETs形成可由線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）觸發(fā)，Wiersma等證明心肌細(xì)胞在快速起搏后發(fā)生線粒體功能障礙。因此，作者推測快節(jié)奏的心肌細(xì)胞可能通過釋放mtDNA來誘導(dǎo)NETosis。為證明這一假設(shè)，作者在乳鼠心肌細(xì)胞上進(jìn)行了如前所述的快速起搏（6 Hz，40 V，10 ms脈沖）作為實驗性AF或正常起搏作為陰性對照（1HZ，40 V，10 ms脈沖），并收集上清。在顯微鏡下連續(xù)監(jiān)測起搏過程，作者發(fā)現(xiàn)在電刺激1 h后觀察到結(jié)構(gòu)損傷，心肌細(xì)胞沒有從持續(xù)的快速起搏中存活（圖5a）。作者首先比較了兩組細(xì)胞的cfDNA和mtDNA水平，發(fā)現(xiàn)在快速起搏3 h后，細(xì)胞上清中的cfDNA和mtDNA水平均升高（圖5b，c）。此外，作為cfDNA一部分的mtDNA比cfDNA增加的幅度更大。除了升高的mtDNA外，作者發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)也可以被快節(jié)奏誘導(dǎo)，這可能是誘發(fā)NETosis的潛在能力（圖5d）。
       接下來，將分離的大鼠中性粒細(xì)胞與佛波酯（PMA）、正常起搏心肌細(xì)胞上清液、快節(jié)奏心肌細(xì)胞上清液、快節(jié)奏心肌細(xì)胞上清液+ AngⅡ共孵育。大鼠中性粒細(xì)胞易分泌云霧狀而非尖刺狀的NETs，且交聯(lián)較弱，形成較大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，難以通過IF顯微鏡進(jìn)行識別和定量。因此，本研究采用Celigo全視野分析法，通過SYTOX Green染色胞外DNA來分析NETs分泌情況。如預(yù)期的那樣，與快節(jié)奏的心肌細(xì)胞上清液孵育后，SYTOX Green計數(shù)增加，并且在額外給予Ang II的情況下，SYTOX Green計數(shù)增加更顯著，這與PMA相似（圖5e，f）。值得注意的是，正常節(jié)律的心肌細(xì)胞上清降低了NETosis，這表明正常心肌細(xì)胞可能分泌某種細(xì)胞因子來保護(hù)中性粒細(xì)胞免受NETosis。

圖5 心動過速心肌細(xì)胞上清液可誘導(dǎo)NETosis

7、靜脈注射DNase I可下調(diào)NETs形成，改善房顫相關(guān)纖維化，縮短房顫持續(xù)時間
       NETs是以dsDNA為骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可被脫氧核糖核酸酶I降解，因此作者研究脫氧核糖核酸酶I是否具有保護(hù)作用，是否可以減少AF相關(guān)的纖維化和AF持續(xù)時間。通過靜脈注射氯化鈣和乙酰膽堿的混合溶液誘導(dǎo)大鼠AF，并記錄心電圖（ECG）以確保誘導(dǎo)成功。每隔一天注射一次，連續(xù)注射兩周，同時額外注射脫氧核糖核酸酶I溶液或相同體積的生理鹽水。Western blot檢測大鼠左心房（LA）中的瓜氨酸化組蛋白3（cit-H3），比較大鼠NETs的形成（圖6a、b）。Masson三色染色顯示誘導(dǎo)的AF導(dǎo)致LA中膠原沉積增加，而額外給予脫氧核糖核酸酶I可以緩解這種情況（圖6c，d）。在膠原蛋白I（Col I）、磷酸化Smad2（p-smad2）和磷酸化p38（pp38）的蛋白水平也觀察到類似的趨勢（圖6e，f）。此外，脫氧核糖核酸酶I有效地改善了誘發(fā)AF的成功率和持續(xù)時間（圖6g）。

圖6 脫氧核糖核酸酶I靜脈注射可減輕AF誘導(dǎo)的心房纖維化

實驗方法
Specific-pathogen-free（SPF）Sprague-Dawley（SD）大鼠，心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，大鼠骨髓中性粒細(xì)胞的分離，大鼠NETs獲取，人中性粒細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和處理，活細(xì)胞三維全息顯微鏡，Celigo血細(xì)胞計數(shù)，透射電鏡，線粒體膜電位測定，Western-blot，乙酰-CaCl₂致AF大鼠模型
參考文獻(xiàn)
He L, Liu R, Yue H, Zhang X, Pan X, Sun Y, Shi J, Zhu G, Qin C, Guo Y. Interaction between neutrophil extracellular traps and cardiomyocytes contributes to atrial fibrillation progression. Signal Transduct Target Ther. 2023 Jul 26;8(1):279. doi: 10.1038/s41392-023-01497-2. PMID: 37491321; PMCID: PMC10368710.??