m5C甲基化lncRNA NR_033928促進(jìn)谷氨酰胺代謝重編程從而促進(jìn)胃癌增殖
5-甲基胞嘧啶（m5C）異常甲基化已被證實與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。失調(diào)的長鏈非編碼RNAs （lncRNAs）參與癌癥的多種生物學(xué)過程。然而，迄今為止，m5C甲基化的lncRNAs在胃癌（GC）中的研究很少。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)RNA胞嘧啶- C（5）-甲基轉(zhuǎn)移酶（NSUN2） 在胃癌中上調(diào)，并且NSUN2的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。lncRNA NR_033928發(fā)生NSUN2甲基化且在胃癌中表達(dá)上調(diào)。機(jī)制上，NR_033928作為IGF2BP3/HUR復(fù)合物的支架，提高谷氨酰胺酶（GLS）mRNA的穩(wěn)定性，從而增加其表達(dá)。谷氨酰胺代謝物α-KG的積累促進(jìn)NR_033928啟動子5-羥甲基胞嘧啶（hm5C）去甲基化，從而上調(diào)NR_033928的表達(dá)，形成正反饋環(huán)路。該研究于2023年8月發(fā)表在《Cell Death & Disease》，IF：9.0。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. m5C調(diào)節(jié)因子上調(diào)NSUN2與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)
從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中檢測m5C在胃腺癌（STAD）項目中的表達(dá)。結(jié)果表明，與正常組織相比，m5C的writers（NOP2，NSUN2，NSUN3，NSUN4，NSUN5和NSUN6）和readers（ALYREF和YBX1）在胃癌樣本中上調(diào)。核心m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2在GC中表達(dá)最高（圖1A）。Pearson相關(guān)分析表明，NSUN2的表達(dá)與大多數(shù)其他m5C調(diào)節(jié)因子的表達(dá)呈正相關(guān)（圖1B）。分析NSUN2在24對配對的胃癌和癌旁正常組織微陣列中的表達(dá)。結(jié)果顯示NSUN2在GC中顯著升高（圖1C）。在48對胃癌和匹配的正常胃組織中進(jìn)行的qPCR分析驗證NSUN2在胃癌中的表達(dá)顯著較高（圖1D）。Western blot分析顯示NSUN2蛋白在胃癌組織中表達(dá)明顯升高（圖1E）。Kaplan-Meier Plotter結(jié)果顯示，NSUN2表達(dá)與胃癌患者的不良總生存期呈正相關(guān)（圖1F）?？傊?，這些結(jié)果表明NSUN2在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并且與胃癌患者的不良診斷相關(guān)。
圖1. 在胃癌中NSUN2表達(dá)上調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)
2. NR_033928在GC中上調(diào)，且被鑒定為發(fā)生NSUN2甲基化的lncRNA
為繪制GC中l(wèi)ncRNA的m5C表觀遺傳修飾圖，作者對3對胃癌組織及其癌旁正常組織進(jìn)行基于m5C抗體的RNA甲基化測序和二代測序。結(jié)果顯示，有254個表達(dá)失調(diào)和11107個不同程度甲基化的lncRNAs （圖2A，B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有10個上調(diào)且高甲基化的lncRNAs，1個上調(diào)且低甲基化的lncRNA，3個下調(diào)且高甲基化的lncRNAs，1個表達(dá)下調(diào)且低甲基化的lncRNA（圖2C）。在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NSUN2 siRNA，qPCR檢測NSUN2修飾的lncRNAs。結(jié)果顯示，在NSUN2沉默的細(xì)胞中，NR_033928的表達(dá)下調(diào)最明顯（圖2D）。qRT-PCR證實NR_033928在48例GC患者的GC組織中表達(dá)高于配對的正常組織（圖2E）。RNA熒光原位雜交（FISH）分析表明，與鄰近正常黏膜組織相比，GC組織具有顯著的NR_033928豐度（圖2G）。通過分析患者的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)NR_033928的表達(dá)水平與胃癌腫瘤大小和TNM分期呈正相關(guān)（表1）。檢測 NR_033928 在 GC 細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果顯示與正常人胃細(xì)胞系GES-1相比，NR_033928在所有檢測的胃癌細(xì)胞系（HGC-27, MKN28, MKN45, AGS和SNU1）中的表達(dá)均較高（圖2F）。根據(jù)上調(diào)的表達(dá)水平，選擇MKN45和AGS進(jìn)行進(jìn)一步研究。FISH顯示NR_033928主要定位于AGS和MKN45的細(xì)胞質(zhì)中（圖2H）。CPC2和CPAT預(yù)測NR_033928的編碼概率極低（圖2I）。綜上所述，NR_033928被確定為胃癌中潛在的NSUN2修飾的致癌lncRNA。
圖2. NR_033928的鑒定與表征
3. NR_033928在體內(nèi)和體外均有致癌作用
在GC細(xì)胞中進(jìn)行功能增益和功能喪失試驗。將NR_033928 siRNA 和過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染到MKN45和AGS細(xì)胞中。菌落形成實驗表明，敲除NR_033928 會減少MKN45細(xì)胞中的菌落數(shù)量，而過表達(dá)NR_033928則會促進(jìn)AGS細(xì)胞中的菌落形成（圖3A，B）。同樣，EDU試驗表明，減少NR_033928的表達(dá)會削弱MKN45細(xì)胞的增殖能力，而增加NR_033928的表達(dá)則會增強(qiáng)AGS細(xì)胞的增殖能力（圖3C，D）。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染NR_033928 siRNA的MKN45細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例增加（圖3E）。而轉(zhuǎn)染NR_033928過表達(dá)載體的AGS細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量減少（圖3F）。將轉(zhuǎn)染有NR_033928 shRNA和過表達(dá)載體的GC細(xì)胞皮下注射到5周大的Balb/c小鼠體內(nèi)。異種移植腫瘤模型顯示，注射MKN45-sh-NR_033928小鼠的腫瘤重量和體積明顯小于對照組（圖 3G）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)NR_033928慢病毒的AGS細(xì)胞促進(jìn)異種移植瘤的生長（圖 3H）?？傊?，NR_033928在體外和體內(nèi)都促進(jìn)GC的增殖，抑制細(xì)胞凋亡。
圖3. NR_033928促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。
4. NSUN2通過維持NR_033928在GC中的穩(wěn)定性而上調(diào)其表達(dá)
m5C RIP分析顯示，在GC細(xì)胞中同步轉(zhuǎn)染NSUN2 siRNA或過表達(dá)載體后，NR_033928的m5C修飾水平降低或升高（圖4A-D）。Sanger測序驗證特定的m5C甲基化位點C154（圖4E）。在敲低NSUN2后，這種甲基化被完全消除，堿基C被轉(zhuǎn)化為堿基T。通過Dactinomycin實驗評估NSUN2是否通過調(diào)節(jié)NR_033928的RNA穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)其表達(dá)。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染NSUN2 siRNA或過表達(dá)載體的細(xì)胞中，NR_033928的半衰期縮短或延長（圖4F-I）。綜上所述，結(jié)果表明NSUN2催化NR_033928的m5C修飾，并通過增強(qiáng)RNA穩(wěn)定性來上調(diào)其表達(dá)。
圖4. NSUN2介導(dǎo)NR_033928 m5C甲基化并調(diào)控其表達(dá)。
5. NR_033928通過GLS介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝調(diào)控胃癌的增殖和凋亡
在NR_033928缺陷和野生型細(xì)胞中進(jìn)行RNA-seq（圖5A）。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)NR_033928的表達(dá)與谷氨酰胺代謝通路呈正相關(guān)，而谷氨酰胺代謝通路與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)（圖5B）。EDU實驗表明NR_033928過表達(dá)細(xì)胞在正常培養(yǎng)基和谷氨酰胺剝奪培養(yǎng)基中增殖能力增強(qiáng)或減弱（圖5C）。細(xì)胞凋亡實驗顯示，正常培養(yǎng)基中NR_033928過表達(dá)的細(xì)胞凋亡比例降低，而在去除谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，凋亡細(xì)胞的比例恢復(fù)（圖5E）。在所有差異表達(dá)基因中，GLS是參與谷氨酰胺分解的關(guān)鍵基因。在GC細(xì)胞中，過表達(dá)NR_033928上調(diào)谷氨酸和α-KG的含量，而共轉(zhuǎn)染sh-GLS則下調(diào)它們的含量（圖5D, F）。EDU實驗顯示，在AGS細(xì)胞中，過表達(dá)NR_033928增加EDU陽性細(xì)胞的比例，在NR_033928過表達(dá)載體和sh-GLS共轉(zhuǎn)染后，EDU陽性細(xì)胞的比例下降（圖5G）。細(xì)胞凋亡實驗顯示，在AGS細(xì)胞中過表達(dá)NR_033928降低凋亡細(xì)胞的比例，而在AGS細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染NR_033928過表達(dá)載體和sh-GLS挽救凋亡細(xì)胞的比例（圖5H）。在AGS細(xì)胞中應(yīng)用GLS抑制劑Telaglenastat（CB-839）。EDU分析顯示CB-839降低AGS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NR_033928過表達(dá)載體的細(xì)胞的增殖活性（圖5I）。凋亡分析表明，CB-839促進(jìn)AGS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NR_033928過表達(dá)載體的細(xì)胞的凋亡（圖5J）。這些結(jié)果表明，NR_033928通過GLS介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝在胃癌中發(fā)揮作用。
圖5. NR_033928通過GLS介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝促進(jìn)GC進(jìn)展
6. NR_033928與IGF2BP3/HUR復(fù)合物相互作用并促進(jìn)其形成
在胃癌細(xì)胞中分別進(jìn)行3次RNA pull-down和質(zhì)譜分析。在所有的候選蛋白中，IGF2BP3和HUR存在于質(zhì)譜結(jié)果和預(yù)測的GLS結(jié)合蛋白結(jié)果中 （圖6A-C）。使用IGF2BP3和HUR抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀分析。結(jié)果顯示，與IgG組相比，IGF2BP3或HUR抗體組中NR_033928的表達(dá)顯著較高（圖6D）。RNA pull-down分析證實，生物素標(biāo)記的NR_033928可以沉淀出重組IGF2BP3和HUR（圖6E）。提出假設(shè)NR_033928作為IGF2BP3/ HUR復(fù)合物的支架來促進(jìn)GLS mRNA在胃癌中的穩(wěn)定性。免疫共沉淀實驗表明，IGF2BP3和HUR在GC中相互作用（圖6F, G）。siRNA沉默NR_033928，減少IGF2BP3或HUR抗體沉淀的HUR或IGF2BP3的蛋白量（圖6H, I）。為進(jìn)一步闡明NR_033928如何招募IGF2BP3和HUR，設(shè)計NR_033928缺失突變體。RNA pull-down分析顯示，含有1387-1926nt的NR_033928 #1片段與IGF2BP3相互作用，含有1387-1926nt、50-1014nt、1 - 1374nt的#1、#4、#5片段與HUR相互作用（圖6J）。此外，根據(jù)IGF2BP3和HUR的內(nèi)在蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)建一系列flag標(biāo)記的截短體。RIP實驗表明，IGF2BP3結(jié)構(gòu)域（198-344aa）和HUR結(jié)構(gòu)域（1-99aa）與NR_033928特異性相互作用（圖6K, L）?？傊?，NR_033928與IGF2BP3/HUR復(fù)合體相互作用并促進(jìn)其形成。
圖6. NR_033928直接結(jié)合IGF2BP3/HUR復(fù)合物
7. NR_033928促進(jìn)IGF2BP3/HUR復(fù)合物與GLS mRNA的相互作用
RIP實驗表明HUR和IGF2BP3與GLS結(jié)合（圖7A，E）。Western blot分析證實，構(gòu)建IGF2BP3和HUR的過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA，并在GC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染（圖7B，F(xiàn)）。Dactinomycin實驗表明，過表達(dá)IGF2BP3使GLS的半衰期延長，共轉(zhuǎn)染HUR siRNA使GLS的半衰期縮短（圖7C）。在使用HUR過表達(dá)載體和IGF2BP3 siRNA進(jìn)行的Dactinomycin檢測中，也檢測到類似的結(jié)果（圖7G）。這些結(jié)果表明，IGF2BP3和HUR協(xié)同增強(qiáng)GLS的穩(wěn)定性。RIP實驗顯示，沉默NR_033928或過表達(dá)NR_033928降低或增加IGF2BP3和HUR結(jié)合的GLS的數(shù)量（圖7D，H）。Dactinomycin實驗顯示，si-IGF2BP3或si-HUR縮短GLS的半衰期，與NR_033928過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染延長GLS的半衰期（圖7I，K）。qRT-PCR分析表明，抑制IGF2BP3表達(dá)降低通過過表達(dá)NR_033928增加的GLS表達(dá)（圖7J）。同樣，抑制HUR表達(dá)降低GLS的表達(dá)，而過表達(dá)NR_033928增加GLS的表達(dá)（圖7L）。因此，NR_033928通過作為IGF2BP3/HUR復(fù)合物和GLS的支架調(diào)節(jié)GLS的穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)GLS的表達(dá)。
圖7. NR_033928在IGF2BP3/HUR和GLS之間起支架作用
8. α-KG促進(jìn)NR_033928啟動子去甲基化從而增加NR_033928的表達(dá)
NR_033928在谷氨酰胺缺失培養(yǎng)基中表達(dá)顯著降低（圖8A）。沉默GLS降低NR_033928的表達(dá)（圖8B）。qRT-PCR分析表明，添加外源性合成的α-KG （DM-α-KG）而不是谷氨酰胺的其他代謝物增加NR_033928的表達(dá)（圖8C）。α-KG異常積累作為DNA去甲基化酶（TETs）和組蛋白去甲基化酶（JMJDs）的輔因子在基因組表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要作用（圖8D）。通過GSK-J4抑制組蛋白去甲基化酶（JMJDs）并沒有改變NR_033928的表達(dá)（圖8E）。Tet家族（Tet1 Tet2和Tet3）的聯(lián)合沉默顯著降低NR_033928的表達(dá)（圖8F）。hMeDIP實驗表明，添加外源性DM-αKG增加NR_033928啟動子hm5C的水平，在谷氨酰胺去除培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-Tet1-3降低hm5C的水平（圖8G，H）?？傊?，α-KG以TETs依賴的DNA去甲基化方式促進(jìn)NR_033928的表達(dá)。
圖8. α-KG通過促進(jìn)NR_03928啟動子去甲基化上調(diào)NR_033928的表達(dá)
9. NR_033928在GC中的臨床意義
對隨訪數(shù)據(jù)的Kaplan-Meier分析表明，NR_033928的表達(dá)與患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)（圖9A）。此外，在線Kaplan-Meier模型結(jié)果顯示，GLS高表達(dá)的患者總生存期低于GLS低表達(dá)的患者（圖9B）。在異種移植瘤模型中，第4周處死所有小鼠，并將腫瘤用于免疫組織化學(xué)分析（圖9C）。GLS免疫組織化學(xué)染色顯示，敲低NR_033928后，GLS的表達(dá)明顯降低。此外，對增殖標(biāo)志物Ki67和凋亡標(biāo)志物c-caspase3的分析表明，沉默NR_033928降低Ki-67的表達(dá)，增強(qiáng)c-caspase3的表達(dá)。因此，NR_033928可作為胃癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物，沉默NR_033928可抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。
圖9. NR_033928作為胃癌的預(yù)后和治療性生物標(biāo)志物
結(jié)論
綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)一種NSUN2甲基化的lncRNA，NR_033928，在GC細(xì)胞和組織中高表達(dá)。NR_033928通過GLS 介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝促進(jìn)GC的進(jìn)展，可能是一個潛在的預(yù)后和治療靶點。
實驗方法
細(xì)胞培養(yǎng)，m5C MeRIP測序和MeRIP- PCR，lncRNA表達(dá)譜和mRNA二代測序，寡核苷酸、慢病毒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，RNA提取和PCR，F(xiàn)ISH，WB，RNA半衰期檢測，菌落形成實驗，EDU染色，細(xì)胞凋亡檢測，谷氨酸和α-酮戊二酸檢測，羥甲基化DNA免疫沉淀，裸鼠實驗，免疫組化，RIP，Co-IP，RNA pull-down和質(zhì)譜分析，sanger測序
參考文獻(xiàn)
Fang L, Huang H, Lv J, Chen Z, Lu C, Jiang T, Xu P, Li Y, Wang S, Li B, Li Z, Wang W, Xu Z. m5C-methylated lncRNA NR_033928 promotes gastric cancer proliferation by stabilizing GLS mRNA to promote glutamine metabolism reprogramming. Cell Death Dis. 2023 Aug 15;14（8）:520. doi: 10.1038/s41419-023-06049-8. PMID: 37582794; PMCID: PMC10427642.