LINC02159通過ALYREF/YAP1信號通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展

       肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。lncRNAs已成為癌癥發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，并成為癌癥診斷和預(yù)后的有前途的生物標(biāo)志物。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA (LINC02159)，在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的腫瘤組織和血清中表達(dá)上調(diào)。我們證實，在體外實驗中，LINC02159的下調(diào)抑制了NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，但誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，在體內(nèi)則延緩了腫瘤的生長，而過表達(dá)LINC02159則起到相反的作用。我們通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LINC02159與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)通路高度相關(guān)，YAP1是LINC02159的潛在靶基因。機(jī)制上，LINC02159結(jié)合ALYREF，通過m5C修飾增強(qiáng)YAP1 mRNA的穩(wěn)定性，導(dǎo)致YAP1過表達(dá)，激活NSCLC細(xì)胞中Hippo和β-catenin信號通路。拯救實驗顯示，LINC01259以YAP1和ALYREF依賴的方式促進(jìn)NSCLC進(jìn)展。綜上所述，LINC02159通過調(diào)節(jié)ALYREF/YAP1信號通路，在NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮致瘤作用，具有作為NSCLC診斷標(biāo)志物和治療靶點的潛力。本文于2023年8月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）LINC02159在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，與不良預(yù)后相關(guān)
       為了鑒定NSCLC中失調(diào)的lncRNA，我們對來自NSCLC患者的匹配腫瘤組織和鄰近非腫瘤組織進(jìn)行了RNA測序。RNA測序結(jié)果顯示，與鄰近非腫瘤組織相比，腫瘤組織中有84個lncRNA上調(diào)，89個lncRNA下調(diào)(圖1A和1B)。圖1C列出了腫瘤組織中上調(diào)最多的10個lncRNA。其中，我們選擇LINC02159進(jìn)行進(jìn)一步研究，因為到目前為止還沒有在癌癥中進(jìn)行研究。我們驗證了與HBE細(xì)胞相比，LINC02159在人NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299和PC9)中的表達(dá)上調(diào)(圖1D)。然后，我們通過核/細(xì)胞質(zhì)分離和FISH實驗檢測了LINC02159在NSCLC細(xì)胞中的分布，發(fā)現(xiàn)LINC02159主要定位于NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖1E和F)。接下來，我們檢測了LINC02159在NSCLC患者配對腫瘤組織和鄰近非腫瘤組織中的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，LINC02159在72%的腫瘤組織中的表達(dá)水平高于鄰近的非腫瘤組織(圖1G)。同時，我們觀察到，與肺炎患者和健康人相比，LINC02159在NSCLC患者血清中的表達(dá)明顯上調(diào)(圖1H)。NSCLC患者與健康個體的受試者工作特征曲線下面積(AUC)為0.879，敏感性為76.6%，特異性為91.49%，而區(qū)分NSCLC患者與肺炎患者的AUC為0.907，敏感性為78.72%，特異性為90.91%(圖1I)。我們進(jìn)一步利用TCGA數(shù)據(jù)分析了LINC02159的表達(dá)，結(jié)果也顯示了LINC02159在NSCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)(圖1I)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LINC02159可作為非小細(xì)胞肺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

2）LINC02159在NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮致癌作用
       為揭示LINC02159在非小細(xì)胞肺癌中的生物學(xué)功能，我們利用特異性siRNA對LINC02159進(jìn)行了功能缺失研究，并通過qRT-PCR驗證了LINC02159在NSCLC細(xì)胞中的敲低效率(圖2A)。CCK-8和細(xì)胞集落形成實驗的結(jié)果顯示，LINC02159敲低顯著抑制了NSCLC細(xì)胞的增殖(圖2B和C)。流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果進(jìn)一步證明，LINC02159敲低在NSCLC細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞數(shù)量增加和細(xì)胞周期阻滯(圖2D和E)。此外，western blot結(jié)果顯示，LINC02159敲低可上調(diào)NSCLC細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)(圖2F)。LINC02159的敲低還抑制了NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖2G和H)。LINC02159的敲低增加了E-cadherin的表達(dá)，降低了N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，以及Slug和Snail等上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)因子的表達(dá)(圖2I)。為了進(jìn)一步驗證LINC02159在NSCLC進(jìn)展中的作用，我們使用對照和LINC02159敲低的NSCLC細(xì)胞建立了小鼠皮下移植瘤模型。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LINC02159敲低組小鼠腫瘤的體積和重量更小(圖2J)。通過Ki-67免疫組化染色和TUNEL染色證實，LINC02159敲低組小鼠腫瘤組織中增殖腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加(圖2K)。綜上所述，這些結(jié)果表明LINC02159在NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮致癌作用。

3）LINC02159在NSCLC中與ALYREF蛋白相互作用，并與ALYREF正相關(guān)
       為了了解LINC02159在非小細(xì)胞肺癌中的致癌作用機(jī)制，我們進(jìn)行了TRAP檢測，以鑒定LINC02159相互作用蛋白，因為它已被證明主要定位于細(xì)胞核中(圖3A-D)。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，與MS2組相比，LINC01259-MS2組中有幾種蛋白質(zhì)富集。我們選擇ALYREF作為接下來的研究，因為它有最高的折疊變化。我們通過另一個獨立的TRAP實驗驗證了LINC01259與ALYREF的結(jié)合(圖3E)。RIP實驗結(jié)果證實，在NSCLC細(xì)胞中，LINC02159富集于ALYREF免疫沉淀復(fù)合物中(圖3F)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，LINC02159與ALYREF在NSCLC細(xì)胞核中共定位(圖3G)。LINC02159的敲低抑制和過表達(dá)增強(qiáng)了ALYREF蛋白的表達(dá)，但對其mRNA的影響很小(圖3H和3I)。LINC02159敲低導(dǎo)致ALYREF蛋白從細(xì)胞核重新定位到細(xì)胞質(zhì)(圖3J和3K)。我們隨后分析了ALYREF蛋白在NSCLC患者腫瘤和非腫瘤組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ALYREF蛋白在93%的腫瘤組織中高表達(dá)，同時LINC02159水平升高(圖3L)。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明LINC02159可能通過與ALYREF相互作用在NSCLC中發(fā)揮促瘤作用。

4）ALYREF在NSCLC中上調(diào)并促進(jìn)NSCLC進(jìn)展
       ALYREF作為m5C修飾的讀取器，調(diào)控mRNA加工和核輸出。我們首先研究了ALYREF在NSCLC中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能。TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，與非腫瘤組織相比，ALYREF在NSCLC患者的腫瘤組織中顯著上調(diào)，AUC為0.882(圖4A和B)。生存時間分析結(jié)果顯示，高水平的ALYREF預(yù)示著NSCLC患者的整體預(yù)后更差(圖4C)。功能缺失研究進(jìn)一步表明，ALYREF敲低可降低NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯(圖4D-K)。ALYREF敲低可上調(diào)NSCLC細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)(圖4L)。ALYREF敲低增加了E-cadherin的表達(dá)，降低了N-cadherin和vimentin的表達(dá)，以及Slug和Snail等EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(圖4M)。綜上所述，ALYREF在NSCLC中上調(diào)，并作為致癌基因促進(jìn)NSCLC進(jìn)展。

5）LINC02159通過ALYREF介導(dǎo)的m5C修飾調(diào)控NSCLC中YAP1信號
       接下來，我們想知道LINC02159在NSCLC中調(diào)控的下游基因和信號通路。RNA測序分析LINC02159敲低的NSCLC細(xì)胞中改變的基因。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，LINC02159敲低的NSCLC細(xì)胞中有409個基因上調(diào)，583個基因下調(diào)(圖5A和B)。此外，KEGG富集分析結(jié)果顯示，LINC02159敲低影響了許多與癌癥相關(guān)的通路，如Hippo、JAK-STAT3和MAPK信號通路(圖5C)。我們選擇了9個在LINC02159敲低的NSCLC細(xì)胞中下調(diào)的基因，包括HMGA2、LIN28B和YAP1等。因為這些基因已被證明對癌癥的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要(圖5D)。我們關(guān)注的是YAP1，因為LINC02159敲低降低了其在NSCLC細(xì)胞中的基因表達(dá)(圖5E)，我們證實，ALYREF敲低降低了NSCLC細(xì)胞中YAP1基因的表達(dá)(圖5F)。Western blot結(jié)果顯示，LINC02159和ALYREF敲低降低，而LINC02159過表達(dá)增加了YAP1蛋白的表達(dá)(圖5G-I)。既往研究表明，YAP與TEAD轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活Hippo通路關(guān)鍵靶基因的表達(dá)，包括CTGF、CYR61、AXL、ANKRD1等。因此，我們利用qRT-PCR檢測了LINC02159和ALYREF敲低對這些靶基因的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，LINC02159-、ALYREF-和YAP1敲低組中Hippo通路靶基因的表達(dá)顯著降低，表明LINC02159通過YAP1調(diào)控TEAD活性(圖5J、K)。RIP結(jié)果顯示，在NSCLC細(xì)胞中，YAP1 mRNA富集于ALYREF-免疫沉淀復(fù)合物中(圖5L)。LINC02159敲低降低了ALYREF與YAP1 mRNA的結(jié)合(圖5M)。此外，LINC02159敲低顯著降低了YAP1 3 ' -UTR的m5C水平(圖5N)。隨后，我們通過Act D實驗發(fā)現(xiàn)，LINC02159/ALYREF敲低削弱了YAP1 mRNA的穩(wěn)定性(圖5O)。這些結(jié)果表明，LINC02159通過ALYREF介導(dǎo)的m5C修飾調(diào)控YAP1 mRNA的表達(dá)和穩(wěn)定性。

6）LINC02159通過YAP1/β-catenin軸促進(jìn)NSCLC進(jìn)展
       既往研究表明，YAP1不僅作為轉(zhuǎn)錄共激活因子參與Hippo通路，而且作為Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子。此外，YAP1還可以調(diào)解它們之間的相互串?dāng)_。以P < 0.05和fold change > 1.5為過濾條件，KEGG富集分析結(jié)果顯示，在LINC02159敲低組中，Wnt/β-catenin信號通路顯著富集(圖6A)。因此，我們研究LINC02159是否也會影響NSCLC中Wnt/β-catenin信號通路的激活狀態(tài)。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，LINC02159和ALYREF敲低組β-catenin、c-Myc和cyclin-D1的表達(dá)顯著降低，而過表達(dá)LINC02159則相反(圖6B-D)。為了進(jìn)一步分析ALYREF、YAP1和LINC02159的相互作用，我們在NSCLC細(xì)胞中敲低LINC02159并同時過表達(dá)ALYREF。數(shù)據(jù)顯示，ALYREF過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)LINC02159敲低導(dǎo)致的YAP1下調(diào)(圖6E)。然后，我們研究了YAP1的過表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)LINC02159敲低在NSCLC中的作用(圖6F)。功能增益和功能損失實驗結(jié)果顯示，LINC02159的敲低明顯抑制YAP1的表達(dá)和NSCLC細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，但這種抑制作用可以被YAP1的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)(圖6G-H)。這些結(jié)果表明，LINC01259通過YAP1/β-catenin軸促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。

結(jié)論
       我們首次發(fā)現(xiàn)，一種新的lncRNA LINC01259通過與m5C修飾物ALYREF相互作用，提高YAP1 m5C水平和mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)，從而促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。我們的研究為非小細(xì)胞肺癌提供了潛在的的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。

實驗方法
FISH，TRAP實驗，LC-MS/MS，RNA測序，RIP，體內(nèi)動物實驗，qRT PCR，western blotting，CCK-8，克隆形成實驗，transwell，細(xì)胞周期和凋亡實驗，免疫熒光，RNA穩(wěn)定實驗，生物信息學(xué)分析。
參考文獻(xiàn)
Yang Q, Wang M, Xu J, Yu D, Li Y, Chen Y, Zhang X, Zhang J, Gu J, Zhang X. LINC02159 promotes non-small cell lung cancer progression via ALYREF/YAP1 signaling. Mol Cancer. 2023 Aug 4;22(1):122. doi: 10.1186/s12943-023-01814-x.