腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌外泌體LINC01232誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸

欄目：最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間：2023-12-26
本研究發(fā)現(xiàn)TAMs分泌外泌體LINC01232誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸......



       腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)浸潤促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡化，但其機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)TAMs分泌外泌體LINC01232誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。機(jī)制上，LINC01232直接結(jié)合E2F2并促進(jìn)E2F2進(jìn)入細(xì)胞核，兩者協(xié)同促進(jìn)NBR1的轉(zhuǎn)錄。NBR1通過泛素結(jié)構(gòu)域與泛素化的MHC-I蛋白結(jié)合增加，導(dǎo)致自噬溶酶體中MHC-I的降解增加以及腫瘤細(xì)胞表面MHC-I的表達(dá)減少，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避CD8+ CTL的免疫攻擊。該研究于2023年4月發(fā)表在《Advance Science》，IF：15.1。
技術(shù)路線




主要研究結(jié)果
1. M2-TAM衍生的外泌體促進(jìn)膠質(zhì)瘤免疫逃逸
       為模擬TAMs，作者將THP1細(xì)胞極化為M2-TAMs。細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，與M0-Exos相比，M2-Exos顯著抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷(圖1a)。流式細(xì)胞術(shù)和qRT-PCR結(jié)果顯示，與M2-Exos培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD8+ T細(xì)胞的增殖能力和IFN-γ、TNF-α、Gzmb的表達(dá)均降低(圖1b-e)。建立裸鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型：將U-87MG/U-251細(xì)胞植入裸鼠腦內(nèi)。12 d后，將小鼠分為兩組，每3 d腫瘤內(nèi)注射M0/M2-Exos。從健康人外周血中分離出活化的CD8+ T細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈注射。結(jié)果顯示，與注射M0-Exos的小鼠相比，注射M2-Exos的小鼠腫瘤體積顯著增加。動(dòng)物移植瘤標(biāo)本中CD8+的IHC分析表明，與M0-Exos組相比，M2-Exos組CD8+的表達(dá)顯著降低(圖1f，g)。這些數(shù)據(jù)表明，體外分離的M2-TAMs來源的外泌體顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞逃避CD8+ CTL細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。


圖1. M2-TAM衍生的外泌體促進(jìn)膠質(zhì)瘤免疫逃逸


2. M2-TAMs分泌的LINC01232被轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細(xì)胞
       使用M0-Exos和M2-Exos組成的lncRNA陣列鑒定TAMs中外泌體相關(guān)的lncRNA。層次聚類分析顯示LINC01232是最主要的非編碼RNAs之一(圖2a)。使用透射電子顯微鏡(TEM)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)和蛋白質(zhì)印跡法(WB)測量外泌體的形態(tài)、大小和表面標(biāo)志物，驗(yàn)證它們存在于TAM培養(yǎng)基中(圖2b)。下一步檢測細(xì)胞外LINC01232。在條件培養(yǎng)基(CM)中，單獨(dú)用RNase A處理M2-TAMs，LINC01232的水平?jīng)]有變化。然而，經(jīng)RNase A和Triton X-100處理后，CM中的LINC01232水平降低(圖2c)。此外，外泌體與CM中的的LINC01232水平相似(圖2d)。這些結(jié)果證明，外泌體是細(xì)胞外LINC01232的主要載體。
       此外，通過FISH和亞細(xì)胞分割研究LINC01232的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示LINC01232定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，并且主要定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞核(圖2e,f)。隨后，將鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的U-87MG細(xì)胞與pkh26標(biāo)記的M2外泌體孵育。IF結(jié)果顯示，鬼筆環(huán)肽脂質(zhì)染料與PKH26熒光在孵育的U-87MG細(xì)胞中共定位，表明外泌體被細(xì)胞有效吸收(圖2g)。這些結(jié)果表明，外泌體可以將M2分泌的LINC01232轉(zhuǎn)運(yùn)到膠質(zhì)瘤細(xì)胞。


圖2. M2-TAMs分泌的LINC01232被轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細(xì)胞


3. M2-TAM衍生的外泌體LINC01232誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸
       使用含有不同siRNAs和兩個(gè)shRNAs的慢病毒載體敲低LINC01232基因。在加入外泌體抑制劑Annexin V或敲低LINC01232后，M2-Exos抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力顯著降低(圖3a)。流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與M2-Exos培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的CD8+ T細(xì)胞增殖能力和IFN-γ、TNF-α、Gzmb的表達(dá)均降低。然而，在加入外泌體抑制劑Annexin V或敲低LINC01232后，這一現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)(圖3b-e)。
       建立裸鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型。12 d后，將小鼠分為4組，每3 d腫瘤內(nèi)注射M2- Exos、M2- Exos +Annexin V、M2/sh-NC-Exos和M2/sh-1232#1-Exos。從健康人外周血中分離出活化的CD8+ T細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈注射。結(jié)果表明，與單純注射M2-Exos或M2/sh-NC-Exos相比，M2-Exos +Annexin V或M2/sh-1232#1-Exos顯著降低腫瘤體積。動(dòng)物移植瘤標(biāo)本中CD8+的IHC顯示，與單獨(dú)注射M2- Exos或M2/sh-NC-Exos的小鼠相比，M2-Exos +Annexin V或M2/sh-1232#1-Exos組的CD8+表達(dá)顯著增加(圖3f，g)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M2-Exos衍生的LINC01232誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。相反，使用AnnexinV處理或敲低LINC01232的外泌體均不能促進(jìn)這些過程。


圖3. M2-TAM衍生的外泌體LINC01232誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸


4. M2-TAM衍生的LINC01232通過調(diào)節(jié)自噬-溶酶體途徑介導(dǎo)MHC-I的表達(dá)
       與M0-Exos相比，M2-Exos對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MHC-I的mRNA水平和mRNA穩(wěn)定性沒有顯著影響，但卻顯著降低MHC-I的蛋白水平和蛋白穩(wěn)定性(圖4a，b)。使用M0/M2-Exos處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞，然后同時(shí)使用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑leupeptin處理。結(jié)果表明，只有溶酶體抑制劑消除M2-Exos對MHC-I蛋白的抑制作用(圖4c)。正如預(yù)期的那樣，在CHX追逐試驗(yàn)中，MHC-I在過表達(dá)(OE) LINC01232的細(xì)胞中具有較短的半衰期。同樣，在下調(diào)LINC01232的細(xì)胞中，MHC-I的半衰期較長(圖4d，e)。這些數(shù)據(jù)表明，M2-Exos衍生的LINC01232通過調(diào)節(jié)自噬-溶酶體途徑介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MHC-I的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。


圖4. M2-TAM衍生的LINC01232通過調(diào)節(jié)自噬-溶酶體途徑介導(dǎo)MHC-I的表達(dá)


5. LINC01232與E2F2結(jié)合并加速E2F2的核轉(zhuǎn)位
       采用RNA pull-down確定與LINC01232相互作用的蛋白E2F2 (圖5a)。RIP檢測結(jié)果表明，LINC01232在E2F2-免疫沉淀復(fù)合物中特異性富集(圖5b)。從LINC01232下拉實(shí)驗(yàn)中提取的蛋白質(zhì)表明，E2F2特異性地結(jié)合正義鏈而不是反義鏈(圖5c)。此外，LINC01232可以調(diào)節(jié)E2F2的整體水平和細(xì)胞核內(nèi)的水平。在U-87MG陰性對照細(xì)胞中，E2F2主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少量定位于細(xì)胞核。在敲低LINC01232細(xì)胞的細(xì)胞核中幾乎檢測不到E2F2。相比之下，在過表達(dá)LINC01232細(xì)胞的細(xì)胞核中有相當(dāng)水平的E2F2(圖5d)。與核裂解液相比，U-87MG細(xì)胞質(zhì)裂解液中E2F2蛋白表達(dá)最多。沉默LINC01232后，U-87MG細(xì)胞中E2F2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)量明顯減少，然而，異位表達(dá)LINC01232后，細(xì)胞核相關(guān)的E2F2含量增加，與IF結(jié)果一致(圖5e)。co-IP測試LINC01232是否可以介導(dǎo)E2F2和NBR1的相互結(jié)合。正如預(yù)期的那樣，過表達(dá)LINC01232增強(qiáng)這種結(jié)合，而敲低則減弱這種結(jié)合(圖5f)。這些結(jié)果表明LINC01232與E2F2結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。


圖5. LINC01232與E2F2結(jié)合并加速E2F2的核轉(zhuǎn)位


6. LINC01232促進(jìn)E2F2介導(dǎo)的NBR1轉(zhuǎn)錄
       使用JASPAR數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)E2F2可能與NBR1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。構(gòu)建由野生型(WT)或突變型(mut) NBR1啟動(dòng)子組成的熒光素酶載體，轉(zhuǎn)染U-87MG和U-251細(xì)胞(圖6a)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)E2F2刺激野生型NBR1啟動(dòng)子的活性，表現(xiàn)為熒光素酶活性的增加，但過表達(dá)對mut型NBR1啟動(dòng)子活性無影響。此外，LINC01232增強(qiáng)E2F2誘導(dǎo)的熒光素酶活性的增加(圖6b)。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E2F2與NBR1啟動(dòng)子結(jié)合，并且這種相互作用被LINC01232增強(qiáng)(圖6c)。此外，增強(qiáng)E2F2表達(dá)顯著上調(diào)NBR1 mRNA和蛋白水平，LINC01232進(jìn)一步促進(jìn)NBR1 mRNA和蛋白水平(圖6d)。這些結(jié)果表明，E2F2直接結(jié)合到NBR1的啟動(dòng)子區(qū)域激活其轉(zhuǎn)錄，而LINC01232促進(jìn)這一過程。


圖6. LINC01232促進(jìn)E2F2介導(dǎo)的NBR1轉(zhuǎn)錄


7. LINC01232通過調(diào)節(jié)NBR1促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤免疫逃逸
       在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87MG和U-251中敲低NBR1，同時(shí)過表達(dá)LINC01232。細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果顯示，與vector相比，LINC01232-OE/U-87MG/U251細(xì)胞顯著抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷。然而，敲低NBR1過表達(dá)LINC01232可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖7a)。流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與LINC01232-OE膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的CD8+ T細(xì)胞增殖能力和IFN-γ、TNF-α、Gzmb的表達(dá)均較低;然而，敲低NBR1同時(shí)過表達(dá)LINC01232可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖7b - e)。建立裸鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型:Vector/LINC01232-OE/LINC01232-OE+NBR1-KD U-87MG/U-251細(xì)胞原位移植入小鼠腦內(nèi)。12 d后，從健康人外周血中分離出活化的CD8+ T細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射。結(jié)果顯示，與注射vector的小鼠相比，LINC01232-OE組小鼠腫瘤體積顯著增加。動(dòng)物移植瘤標(biāo)本中CD8+的免疫組化結(jié)果顯示，與vector組小鼠相比，LINC01232-OE組小鼠CD8+的表達(dá)明顯降低。敲低NBR1同時(shí)過表達(dá)LINC01232可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖7f，g)。這些結(jié)果進(jìn)一步說明LINC01232通過調(diào)節(jié)NBR1促進(jìn)膠質(zhì)瘤免疫逃逸。


圖7. LINC01232通過調(diào)節(jié)NBR1促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤免疫逃逸


8. LINC01232/E2F2/NBR1/MHC-I軸與臨床進(jìn)展的相關(guān)性
       比較正常腦組織(NBT)、低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織(LGG)、高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織(HGG)中LINC01232/E2F2/NBR1/MHC-I的表達(dá)水平。與NBT相比，LINC01232/E2F2/NBR1在腫瘤組織中表達(dá)水平較高，尤其是在HGG中。然而，MHC-I的表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢(圖8a-d)。此外，LINC01232/E2F2/NBR1信號(hào)軸成員之間的表達(dá)水平成正比。然而，MHC-I的表達(dá)與LINC01232/E2F2/NBR1的表達(dá)成反比(圖8e-i)。此外，F(xiàn)ISH、IF和IHC結(jié)果顯示，LINC01232水平與E2F2/NBR1信號(hào)通路呈正相關(guān)。然而，MHC-I與LINC01232/E2F2/NBR1的表達(dá)成反比(圖8j)。以上數(shù)據(jù)表明，LINC01232/E2F2/NBR1軸可以通過自噬-溶酶體途徑調(diào)節(jié)MHC-I的表達(dá)。


圖8. LINC01232/E2F2/NBR1/MHC-I軸與臨床進(jìn)展的相關(guān)性


結(jié)論
       綜上所述，本研究揭示了TAMs與膠質(zhì)瘤之間存在關(guān)鍵的分子交流，即TAMs分泌富含LINC01232的外泌體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，通過LINC01232/E2F2/NBR1/MHC-I軸支持惡性腫瘤的生長，誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，表明靶向該軸可能具有治療潛力。

實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)，質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染，WB，qRT-PCR，生信分析，外泌體的分離與鑒定，ChIP，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，亞細(xì)胞分離分析，F(xiàn)ISH，免疫熒光，免疫組化，免疫共沉淀，鄰位連接技術(shù)（PLA），RNA pull-down，RIP，腦異種原位移植。
參考文獻(xiàn)
Li J, Wang K, Yang C, Zhu K, Jiang C, Wang M, Zhou Z, Tang N, Wang Q, Wang S, Shu P, Yuan H, Xiong Z, Li J, Liang T, Rao J, Wang X, Jiang X. Tumor-Associated Macrophage-Derived Exosomal LINC01232 Induces the Immune Escape in Glioma by Decreasing Surface MHC-I Expression. Adv Sci (Weinh). 2023 Jun;10(17):e2207067. doi: 10.1002/advs.202207067. Epub 2023 Apr 25. PMID: 37097629; PMCID: PMC10265094.