抑制“行走的殺手”骨關(guān)節(jié)炎的“利器”之抑制PIM-1激酶

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2024-01-12
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種炎癥性關(guān)節(jié)炎,巨噬細胞驅(qū)動的滑膜炎被認為與軟骨破壞密切相關(guān),可發(fā)生在任何階段......

       骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種炎癥性關(guān)節(jié)炎,巨噬細胞驅(qū)動的滑膜炎被認為與軟骨破壞密切相關(guān),可發(fā)生在任何階段。然而,目前還沒有有效的治療骨性關(guān)節(jié)炎進展的靶點?;ぞ奘杉毎械腘OD-、LRR-和pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)炎癥小體參與病理性炎癥過程,所以針對它的治療策略被認為是治療OA的有效途徑。PIM-1激酶作為多種細胞因子信號通路的下游效應(yīng)者,在炎癥性疾病中發(fā)揮促炎作用。
       在這項研究中,研究者評估了PIM-1的表達和滑膜巨噬細胞在人骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的滲透。以小鼠和人巨噬細胞為模型,研究了PIM-1對脂多糖(LPS)和尼日利亞菌素、三磷酸腺苷、尿酸鈉(MSU)、鋁鹽等激動劑的作用及其機制。采用改良的巨噬細胞條件培養(yǎng)液(CM)共培養(yǎng)體系評價其對軟骨細胞的保護作用。體內(nèi)療效通過內(nèi)側(cè)半月板(DMM)誘導的小鼠骨性關(guān)節(jié)炎得到證實。
       PIM-1在人骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達增加,并伴有滑膜巨噬細胞的浸潤。在體外實驗中,特異性抑制劑SMI-4a對PIM-1的抑制作用迅速抑制了小鼠和人巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活以及gasdermin-D(GSDME)介導的細胞焦亡。此外,PIM-1的抑制在組裝階段特異性阻斷了含有CARD(ASC)寡聚化的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白。機制上,PIM-1的抑制可減輕線粒體活性氧(ROS)/氯離子胞內(nèi)通道蛋白(CLICs)依賴的Cl -外泄信號通路,最終導致ASC寡聚化和NLRP3炎性體活化受阻。此外,PIM-1的抑制在改良的共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯示出軟骨保護作用。最后,SMI-4a顯著抑制滑膜中PIM-1的表達,并降低DMM誘導的OA模型中的滑膜炎評分和國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(OARSI)評分。本文于2023年7月發(fā)表在《Journal of Translational Medicine》期刊上,IF=7.4。
技術(shù)路線


主要實驗結(jié)果
1、人骨關(guān)節(jié)炎滑膜巨噬細胞PIM-1表達上調(diào)
       探討PIM-1在巨噬細胞和骨性關(guān)節(jié)炎進展中的作用。研究者研究了巨噬細胞標志物(F4/80)在人滑膜中的表達。與之前的研究一樣,與正?;は啾龋切躁P(guān)節(jié)炎患者滑膜中F4/80陽性細胞的數(shù)量增加(圖1a,b)。此外,在骨性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜中,PIM-1陽性細胞的百分比也升高(圖1a,c)。有趣的是,PIM-1主要定位于巨噬細胞,PIM-1和F4/80共存。綜上所述,這些結(jié)果表明巨噬細胞在OA滑膜中聚集,并增加PIM-1的表達。


圖1 巨噬細胞和PIM-1在OA滑膜中表達上調(diào)


2、PIM?1的抑制抑制了NLRP3炎性體的激活
       為了確定Smi-4a是否特異性地抑制巨噬細胞中的PIM-1,研究者用Smi-4a對脂多糖誘導的BMDM(骨髓源性巨噬細胞)進行了2 h的蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果表明,SMI-4在LPS刺激(3.3 μm, 10 μm, 30 μm)后可下調(diào)jak2、stat的磷酸化水平,并呈劑量依賴性(圖2a)。這意味著PIM-1活性被SMI-4a抑制。此外,研究者在尼日利亞菌素或ATP刺激用Smi-4a培養(yǎng)脂多糖誘導的BMDM。結(jié)果表明,SMI-4a以劑量依賴性(3.3 μm, 10 μm, 30 μm抑制pro-IL-1β(P31)和pro-caspase-1(P45)裂解為IL-1β(P17)和caspase-1(P20)(圖2b、c),但不影響TNF-a的分泌。生長因子IL-3可通過JAK/ STAT信號通路上調(diào)PIM-1的活性。值得注意的是,研究者的研究結(jié)果表明,添加IL-3(25和50ng/ml)可以恢復SMI-4a(10 μm)誘導的jak2、stat的低磷酸化水平(圖2d)。這意味著補充IL-3(25和50ng/ml)可以恢復PIM-1的活性。此外,PIM-1的激活能夠“挽救”SMI-4a(30 μm)誘導的IL-1β分泌下調(diào)(圖2e和f),而不改變TNF-a分泌。這些發(fā)現(xiàn)表明,PIM-1可以參與NLRP3炎性小體激活的組裝階段,而不影響啟動階段。
       為了觀察PIM-1對巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的啟動階段和組裝階段的作用,在LPS刺激前和刺激后應(yīng)用SMI-4a。結(jié)果表明,在LPS刺激前預(yù)處理SMI-4a抑制了TNF-α的產(chǎn)生、pro-IL-1β和NLRP3蛋白的表達,而在LPS刺激后用SMI-4a處理時,這些沒有明顯變化(圖2g–i)。這些發(fā)現(xiàn)表明,PIM-1的抑制可抑制NF-κB信號通路,并可在啟動期和裝配期抑制NLRP3炎癥小體的激活。研究者繼續(xù)探索當巨噬細胞在LPS刺激后用SMI-4a處理時,PIM-1在裝配階段的作用。有趣的是,被SMI-4a抑制的PIM-1顯示出對NLRP3炎癥小體激活的快速抑制作用(圖2j–l)。為了進一步消除SMI-4a脫靶的可能性,這項研究還發(fā)現(xiàn),另一種PIM-1抑制劑AZD1208可以快速抑制NLRP3炎癥小體激活的組裝階段,而不影響啟動階段。


圖2 . PIM-1的阻斷抑制了巨噬細胞NLRP3炎性體活化


3、阻斷PIM?1可廣泛抑制NLRP3、AIM2、NLRC4炎性體和焦亡,并特異性減輕ASC低聚物的形成
       為了進一步研究PIM-1是否在NLRP3炎性小體激活中起共同作用,研究者在不同的巨噬細胞中使用不同的激動劑研究了PIM-1對NLRP3炎性小體激活的作用。研究者發(fā)現(xiàn)SMI-4a劑量依賴性地抑制小鼠和人巨噬細胞NLRP3炎性體的激活,如雄性C57BL/6小鼠的PMs(圖3a, b),THP-1細胞(圖3c, d),健康人的外周血單核細胞(PBMC)。除尼日利亞菌素外,SMI-4a還能抑制MSU和Alum誘導的caspase-1裂解和IL-1β分泌(圖3e, f)。
       為了探究PIM-1是否在NLRP3炎性小體激活中起特定作用,研究者研究了PIM-1在NLRC4和AIM2炎性小體激活中的作用。結(jié)果顯示SMI-4a對AIM2炎性小體和NLRC4炎性小體具有抑制作用,可由poly(dA:dT)轉(zhuǎn)染或沙門氏菌感染觸發(fā)(圖3g, h),導致IL-1β產(chǎn)生減少。
       LDH釋放和GSDMD裂解是炎性小體誘導的焦亡的兩個關(guān)鍵特征。然后,研究者發(fā)現(xiàn)SMI-4a對PIM-1的抑制可以抑制LDH的釋放,阻斷GSDMD的裂解(圖3i, j)。接下來,研究者研究了PIM-1如何影響NLRP3炎性體形成的組裝階段。NLRP3和ASC之間的相互作用對于NLRP3炎性體的組裝至關(guān)重要。共免疫沉淀(CO-IP)結(jié)果表明SMI-4a不影響NLRP3和ASC的相互作用。在NLRP3和ASC裝配后,隨后的ASC募集形成ASC寡聚體和ASC斑點。結(jié)果首先表明,PIM-1抑制可以特異性減弱尼日利亞菌素誘導的DSS交聯(lián)的ASC寡聚體和ASC-斑點(圖3k - m)。


圖3  PIM-1的抑制廣泛抑制了NLRP3、AIM2、NLRC4炎性體和焦亡,并特異性減輕了ASC低聚物形成


4、PIM-1的抑制阻斷了Cl-外排以抑制ASC寡聚化
       Cl-外排在ASC寡聚化中起著至關(guān)重要的作用,并且是NLRP3炎癥小體激活的重要上游事件。為了了解PIM-1對Cl-流出的影響,研究者進行了離子置換實驗來驅(qū)動K+或Cl-的流出。與以前的研究一致,單獨的無氯條件不會引起IL-1β的釋放,但它可以進一步增強無鉀條件引起的IL-1β的釋放。此外,在用SMI-4a處理的這些上清液中沒有觀察到IL-1β(圖4a)。此外,在無K+和Cl-的條件下,SMI-4a可以劑量依賴性地抑制IL-1β的釋放(圖4b,c)。與先前的研究一致,研究者發(fā)現(xiàn)無K+和無Cl-的條件可以激活A(yù)SC寡聚化。SMI-4a可以減輕由尼日利亞菌素或無K+和Cl-條件引起的ASC寡聚化(圖4d)。以上結(jié)果提示,PIM1抑制NLRP3炎性小體激活可能與Cl?外流有關(guān)。
       如圖4e,f所示,nigericin或無K+和Cl-條件顯著增加了細胞內(nèi)熒光強度,表明細胞內(nèi)Cl-水平降低,Cl-流出增強。但是,這些進程被SMI-4a阻止了。氯離子細胞內(nèi)通道蛋白(CLICs)家族由CLIC1、CLIC4和CLIC5組成,存在于胞漿和質(zhì)膜中。CLICs可以移位到質(zhì)膜上,形成陰離子通道,介導細胞內(nèi)的Cl-外流。研究者進一步探索SMI-4a誘導的Cl-外排變化是否是通過阻斷CLICs轉(zhuǎn)運介導的。蛋白質(zhì)印跡分析表明,SMI-4a可以阻斷由尼日利亞菌素和無K+和Cl-條件誘導的CLICs易位(圖4g,h)。綜上所述,研究者首次表明PIM-1在CLICs轉(zhuǎn)運和Cl-外流中發(fā)揮關(guān)鍵作用,以實現(xiàn)ASC寡聚化和NLRP3炎癥小體激活。


圖4  PIM-1的抑制可阻斷Cl?外排,從而抑制巨噬細胞中ASC的低聚化


5、PIM-1的抑制通過線粒體ROS阻斷Cl-外排
       線粒體ROS在Cl-流出的上游起作用,加速NLRP3炎癥體的激活,并在AIM2和NLRC4炎癥體的激活中起關(guān)鍵作用。為了研究PIM-1抑制是否通過調(diào)節(jié)線粒體ROS阻斷Cl-外排和NLRP3炎癥小體激活,研究者首先使用MitoSOX紅色探針檢測巨噬細胞中線粒體ROS的水平。結(jié)果顯示,伴隨線粒體ROS和SMI-4a而產(chǎn)生的NLRP3炎癥激活可以抑制線粒體的ROS水平(圖5a,b)。此外,在SMI-4a和尼日利亞菌素孵育之前,用魚藤酮(一種線粒體電子傳遞鏈復合物I抑制劑)處理LPS誘導的BMDMs時,線粒體ROS的產(chǎn)生顯著增加。這一發(fā)現(xiàn)表明魚藤酮阻斷了SMI-4a對線粒體ROS產(chǎn)生的抑制功能(圖5c,d)。此外,魚藤酮預(yù)處理后,Cl-外排和NLRP3炎癥小體的激活增強(圖5e - h)??傊?,這些結(jié)果首次表明PIM-1的抑制抑制了線粒體ROS的產(chǎn)生并阻斷了Cl-外排,導致了對NLRP3炎癥小體的抑制作用。


圖5 PIM-1的抑制抑制了線粒體ROS的產(chǎn)生,從而阻斷了巨噬細胞中Cl-的流出


6、在共培養(yǎng)體系中,PIM-1的抑制抑制了軟骨細胞凋亡并改善軟骨細胞增殖和ECM代謝
       研究者進一步利用共培養(yǎng)系統(tǒng)來研究巨噬細胞和軟骨細胞的相互作用。首先,研究者應(yīng)該檢測SMI-4a對軟骨細胞的細胞毒性作用。結(jié)果顯示濃度< 50 μM的SMI-4a 處理軟骨細胞24或48小時沒有顯著的細胞毒性作用(圖6b)。隨后,研究者用參與NLPR3炎癥體激活的各種單一成分刺激巨噬細胞,并用CM培養(yǎng)軟骨細胞。有趣的是,與對照組相比,Nigericin組軟骨細胞的活性降低,而其他組無明顯變化。這意味著從用尼日利亞菌素處理的巨噬細胞收集的CM對軟骨細胞具有明顯的毒性作用(圖6c)。最終,研究者放棄了尼日利亞菌素,選擇了無K+和Cl-的條件來激活NLRP3炎癥小體。因此,建立了改良的巨噬細胞-軟骨細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)(圖6a)。
       在該共培養(yǎng)系統(tǒng)中,與無LPS+KCl組相比,在SMI4a處理下軟骨細胞的存活力增加(圖6d)。從TUNEL染色中觀察到一致的結(jié)果(圖6g,h)。此外,與無LPS+KCl組相比,SMI-4a處理后,裂解的caspase 3和Bax的表達降低,Bcl-2的表達升高(圖6e)。這些結(jié)果表明,PIM-1的抑制可以減輕軟骨細胞凋亡。此外,與無LPS+KCl組相比,在SMI-4a處理下,膠原II和聚集蛋白聚糖的表達水平增加,MMP13和ADAMTS5的表達水平降低(圖6f)。這些結(jié)果表明,抑制PIM-1可以恢復軟骨細胞的細胞外基質(zhì)代謝。EDU染色顯示,與無LPS+ KCl組相比,用SMI-4a處理的軟骨細胞的增殖水平增加(圖6i和j)?;谠摻Y(jié)果,如Toloniumchloride和S&F染色的染色強度和細胞面積分數(shù)的增加所示(圖6k – n),用SMI-4a處理的軟骨細胞的數(shù)量增加。這些結(jié)果首次證明PIM-1的抑制對軟骨細胞增殖有有益的影響。


圖6 在共培養(yǎng)體系中PIM-1的抑制防止了軟骨細胞損傷


7、PIM-1的抑制可以改善DMM模型小鼠骨關(guān)節(jié)炎的進展
       該研究進一步探索了PIM-1抑制對體內(nèi)OA的潛在治療作用。H&E染色顯示,smim4a治療DMM小鼠改善了滑膜的肥大和增生,并降低了滑膜襯里細胞層的厚度(圖7b)。結(jié)果表明SMI-4a可以降低滑膜炎評分,該評分在DMM組中升高(圖7c)。此外,與人類OA滑膜一致,與巨噬細胞共定位的PIM-1(F4/80)在DMM小鼠中顯著上調(diào)(圖7d–f)。然而,用SMI-4a處理對PIM-1的抑制表明滑膜中的這些陽性細胞顯著下調(diào)。此外,S&F染色顯示,與DMM組相比,SMI-4a的治療改善了粗糙和糜爛的關(guān)節(jié)表面軟骨、軟骨細胞減少和異常狹窄的關(guān)節(jié)間隙。結(jié)果表明SMI-4a可以降低在DMM組中升高的OARSI評分(圖7h)。這些蛋白質(zhì)的免疫組織化學在OA的發(fā)展中起著特征性的病理學指示作用,如膠原II、聚集蛋白聚糖、MMP13、ADAMTS5和cleaved-caspase3。與DMM組相比,用SMI-4a處理改善了II型膠原和聚集蛋白聚糖的下調(diào),并抑制了MMP13、ADAMTS5和cleaved-caspase3的上升(圖7i)。出于SMI-4a的安全性考慮,測試了肝酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的血清水平的肝毒性(圖7j),評估了血尿素氮(BUN)和肌酐(Cre)的腎毒性(圖7k),評估了體重的全身毒性(圖7l)。與對照組和DMM組相比,這些參數(shù)在SMI-4a處理后均無明顯變化。此外,從肝、脾和腎的H&E染色中沒有觀察到明顯的變化(圖7m)。研究者的體內(nèi)研究結(jié)果首次表明PIM-1抑制可以在OA小鼠中發(fā)揮保護作用。


圖7  PIM-1抑制改善了小鼠DMM模型中OA的進展


       總之,我們的研究強調(diào)PIM-1是治療OA的有效靶點。抑制PIM-1可抑制NLRP3炎癥體和GSDMED介導的細胞焦亡,其機制可能是通過阻斷組裝階段線粒體ROS/Cl?外流來實現(xiàn)。我們的研究表明,PIM-1特異性抑制劑能有效地治療小鼠骨性關(guān)節(jié)炎。因此,PIM-1代表了一類新的有希望的治療OA的靶點,靶向于巨噬細胞中的這些機制,并拓寬了治療OA策略的道路。

實驗方法
酶聯(lián)免疫吸附、乳酸脫氫酶釋放試驗、WB、細胞內(nèi)氯離子水平的評估、H&E染色、S&F染色
參考文獻
Zhang, Z. et al. Targeting macrophagic PIM-1 alleviates osteoarthritis by inhibiting NLRP3 inflammasome activation via suppressing mitochondrial ROS/Cl? efflux signaling pathway. Journal of Translational Medicine 2023 Jul, 21:452 doi:10.1186/s12967-023-04313-1