什么泡沫不泡沫不都得看LKB1嗎

       泡沫細(xì)胞形成是動脈粥樣硬化的早期標(biāo)志，大量研究表明血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）占據(jù)相當(dāng)比例的泡沫細(xì)胞。肝激酶B1（LKB1）在心血管疾病中起重要作用。然而，LKB1在VSMCs衍生泡沫細(xì)胞形成和動脈粥樣硬化中的作用尚不清楚。為探討LKB1對VSMC源性泡沫細(xì)胞形成和動脈粥樣硬化的影響，本研究構(gòu)建了平滑肌特異性LKB1基因敲除（LKB1^SMKO）小鼠。研究發(fā)現(xiàn)LKB1在斑塊負(fù)荷的主動脈和氧化低密度脂蛋白（oxLDL）處理的VSMCs中表達(dá)下降。與對照組相比，LKB1^SMKO小鼠的動脈粥樣硬化發(fā)展通過促進(jìn)VSMC源性泡沫細(xì)胞形成而加劇。相反，LKB1的過表達(dá)抑制VSMCs中的脂質(zhì)攝取和泡沫細(xì)胞形成。研究顯示LKB1與SIRT6結(jié)合并直接磷酸化并激活SIRT6，從而通過SIRT6依賴性的組蛋白去乙?；瘻p少凝集素樣oxLDL受體-1（LOX-1）。并且，平滑肌中LOX-1缺陷可改善LKB1^SMKO小鼠的動脈粥樣硬化。本研究表明，LKB1可能通過SIRT6的磷酸化和激活來調(diào)節(jié)VSMC源性泡沫細(xì)胞形成和動脈粥樣硬化。本文于2023年8月發(fā)表在《Cell Death Disease》IF:9.0期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)方法
1、LKB1在動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)降低
       為研究VSMC中的LKB1是否導(dǎo)致動脈粥樣硬化，從頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)的患者和正常供體的對照頸動脈中獲取動脈粥樣硬化斑塊，并對其進(jìn)行免疫熒光。與對照動脈相比，動脈粥樣硬化斑塊中LKB1的表達(dá)減少（圖1A）。用正常飲食（ND）或高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)ApoE^-/-小鼠12周。與ND組相比，HFD組小鼠主動脈中的LKB1蛋白水平明顯降低（圖1B）。此外，我們用免疫熒光技術(shù)評估α-SMA標(biāo)記的VSMC中LKB1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與ND組相比，HFD組小鼠主動脈平滑肌中的LKB1水平降低了（圖1C）。從小鼠主動脈中提取的VSMCs 被用于以下體外實(shí)驗(yàn)。體外氧化LDL（100 μg/mL）處理72小時(shí)后，LKB1蛋白水平下降（圖1D）。此外，LKB1的mRNA水平在oxLDL處理72小時(shí)后開始下降（圖1E）。
       接下來，測定oxLDL是否通過啟動子甲基化下調(diào)LKB1的轉(zhuǎn)錄。用oxLDL處理VSMC細(xì)胞72小時(shí)，然后用抗5-MC抗體（用于識別甲基化DNA）進(jìn)行MeDIP檢測，用抗MeCP2抗體（用于識別與甲基化DNA結(jié)合的特異性蛋白質(zhì)）進(jìn)行ChIP檢測。用ChIP或MeDIP檢測的染色質(zhì)DNA和針對LKB1啟動子中 CpG島的引物進(jìn)行PCR檢測的結(jié)果顯示，經(jīng)oxLDL處理的VSMC的LKB1啟動子甲基化程度高于對照組（圖1F，G），表明oxLDL通過啟動子DNA甲基化下調(diào)VSMC中LKB1的表達(dá)。

圖1 LKB1在動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)降低

2、平滑肌中LKB1缺失加速動脈粥樣硬化
       為探索平滑肌 LKB1 在動脈粥樣硬化中的作用，利用注射了AAV8/D377Y-mPCSK9的對照組（CTR）和LKB1^SMKO小鼠建立了動脈粥樣硬化動物模型，并喂食Paigen飲食12周。結(jié)果顯示相比于CTR小鼠，LKB1^SMKO小鼠的主動脈表面和橫斷主動脈根部的動脈粥樣硬化病變區(qū)域都更大（圖2A,B），脂質(zhì)負(fù)擔(dān)更重（圖2C）。此外，LKB1敲低增加了斑塊中的巨噬細(xì)胞積累（圖2D）。然而，LKB1敲低不影響血漿TG，TC，HDL-C和LDL-C的水平（圖2E）。因此，平滑肌中LKB1缺失加速動脈粥樣硬化。

圖2 平滑肌中LKB1缺失加速動脈粥樣硬化

3、LKB1抑制VSMC來源的泡沫細(xì)胞的形成
       為探索LKB1是否在VSMC衍生的泡沫細(xì)胞形成過程中發(fā)揮作用，使用BODIPY檢測斑塊中泡沫細(xì)胞的脂滴。斑塊中BODIPY和α-SMA均呈陽性的細(xì)胞被認(rèn)為是VSMC衍生的泡沫細(xì)胞。與CTR比較，LKB1^SMKO小鼠斑塊中BODIPY?+?/α-SMA+區(qū)域顯著增加，表明LKB1敲除促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。為證實(shí)這一結(jié)果，用oxLDL刺激VSMC 24小時(shí)，以模擬體外VSMC衍生的泡沫細(xì)胞。在用oxLDL刺激VSMC之前的24小時(shí)，用腺病毒過表達(dá)LKB1，并用油紅O染色法測定VSMC的脂質(zhì)負(fù)荷。結(jié)果顯示，與GFP組相比，過表達(dá)LKB1能顯著減少脂滴在VSMC中的積累（圖3B）。由于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量取決于脂質(zhì)攝取和膽固醇外流之間的平衡，脂質(zhì)研究了LKB1是否抑制oxLDL的吞噬或增強(qiáng)膽固醇的外流。為評估血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取脂質(zhì)的能力，用表達(dá)GFP或LKB1的腺病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后用Dil-oxLDL處理血管內(nèi)皮細(xì)胞。LKB1的過表達(dá)抑制了VSMC對Dil-oxLDL的吸收（圖3C）。膽固醇外排實(shí)驗(yàn)表明，LKB1并不影響膽固醇從VSMCs排出（圖3D）。培養(yǎng)CTR和LKB1^SMKO小鼠的原代VSMCs并用oxLDL或Dil-oxLDL處理。不出所料，LKB1缺乏會增加脂質(zhì)沉積和脂質(zhì)攝?。▓D3E、F）。此外，LKB1缺乏并不影響膽固醇外流（圖3G）。因此，得出結(jié)論，LKB1可抑制VSMC衍生的泡沫細(xì)胞形成。

圖3 LKB1抑制VSMC來源的泡沫細(xì)胞的形成

4、LKB1抑制LOX-1的表達(dá)
       接下來，用WB測定負(fù)責(zé)膽固醇攝取和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果顯示，LKB1過表達(dá)會降低LOX-1的蛋白水平，而LKB1缺失則會升高LOX-1的蛋白水平。然而，LKB1并沒有改變其他清除受體或膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白水平（圖4A，B）。此外，LKB1過表達(dá)會降低LOX-1 mRNA水平（圖 4C），而LKB1缺失會增加LOX-1 mRNA水平（圖4D）。此外，與CTR小鼠相比，LKB1^SMKO小鼠主動脈中的LOX-1表達(dá)水平明顯增加（圖4E）。因此，LKB1可抑制LOX-1的表達(dá)，這可能是抑制VSMC衍生泡沫細(xì)胞形成的原因之一。

圖4 LKB1抑制LOX-1的表達(dá)

5、LKB1通過LOX-1調(diào)控oxLDL的攝取
       根據(jù)這些數(shù)據(jù)，脂質(zhì)推測LKB1可通過下調(diào)LOX-1抑制VSMC衍生的泡沫細(xì)胞形成。為驗(yàn)證這一假設(shè)，用表達(dá)GFP、LOX-1或LKB1的腺病毒感染VSMC，然后處理oxLDL。油紅O染色表明，LKB1過表達(dá)后脂質(zhì)沉積和oxLDL吸收的減少被LOX-1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)（圖5A，B）。在與oxLDL培養(yǎng)之前，用LOX-1 siRNA轉(zhuǎn)染CTR和LKB1缺失的VSMC。LKB1缺失后，LOX-1的缺失持續(xù)抑制了脂質(zhì)積累和吸收的增強(qiáng)（圖5C、D）?？傊?，這些結(jié)果表明LKB1通過LOX-1減少了oxLDL的吸收。

圖5 LKB1通過LOX-1調(diào)控oxLDL的攝取

6、LKB1通過SIRT6調(diào)控LOX-1的表達(dá)
       為研究LKB1調(diào)控LOX-1表達(dá)的分子機(jī)制，化合物C被用來阻斷經(jīng)典信號通路LKB1-AMPK。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制AMPK并不能消除LKB1對LOX-1的下調(diào)作用，這表明LKB1以一種不依賴于AMPK的方式調(diào)控LOX-1的表達(dá)。為確定組蛋白乙?；欠駞⑴cLKB1對LOX-1表達(dá)的調(diào)控作用，對感染了表達(dá)GFP或LKB1的腺病毒的VSMC進(jìn)行乙酰基H3K9和H3K56的ChIP檢測。如圖6A所示，LKB1過表達(dá)后，LOX-1啟動子中的H3K9和H3K56乙?；斤@著降低。SIRT6是一種核去乙?；?，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞衍生泡沫細(xì)胞的形成。為確定SIRT6是否參與了LKB1對LOX-1的調(diào)控，用SIRT6 siRNA轉(zhuǎn)染GFP或LKB1表達(dá)的VSMC。SIRT6的缺乏減輕了LKB1過表達(dá)引起的LOX-1表達(dá)的減少（圖6B）。此外，SIRT6的缺乏也抑制了LKB1過表達(dá)引起的脂質(zhì)積累和吸收的減少（圖6C，D）。相反，SIRT6的過表達(dá)抑制了LKB1缺失的VSMC中LOX-1表達(dá)、脂質(zhì)積累和脂質(zhì)攝取的增加（圖6E-G）。這些數(shù)據(jù)表明，LKB1通過SIRT6介導(dǎo)的組蛋白去乙?；{(diào)節(jié)LOX-1的表達(dá)。

圖6 LKB1通過SIRT6調(diào)控LOX-1的表達(dá)

7、LKB1磷酸化激活SIRT6
       為驗(yàn)證LKB1和SIRT6之間的相互作用，用這兩種蛋白的抗體進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示LKB1和SIRT6在VSMCs中部分共定位（圖7A）。免疫沉淀試驗(yàn)顯示，LKB1可與VSMC中的SIRT6結(jié)合（圖7B）。這一點(diǎn)在轉(zhuǎn)染了Flag標(biāo)記的LKB1和HA標(biāo)記的SIRT6的HEK 293 T細(xì)胞中得到進(jìn)一步證實(shí)（圖7C、D）。此外，GST牽引試驗(yàn)證明LKB1可直接與SIRT6結(jié)合（圖7E）。
       LKB1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可磷酸化并激活下游蛋白，所以作者在線預(yù)測了LKB1可磷酸化SIRT6的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)SIRT6序列中在人，小鼠，大鼠中保守的LKB1磷酸化位點(diǎn)是蘇氨酸51，57，184。為檢驗(yàn)LKB1能否在預(yù)測位點(diǎn)上磷酸化SIRT6，構(gòu)建攜帶磷酸化位點(diǎn)突變體SIRT6（蘇氨酸51、57和184被丙氨酸取代）質(zhì)粒。用攜帶HA-SIRT6-WT或三種不同突變體（HA-SIRT6-T51A、T57A 和T184A）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293 T細(xì)胞，然后用GFP或LKB1過表達(dá)腺病毒感染。用抗-HA或IgG進(jìn)行免疫沉淀，然后用抗-磷酸（Ser/Thr）或抗-HA 一抗進(jìn)行蛋白印跡分析。結(jié)果表明，LKB1提高了HA-SIRT6-WT和HA-SIRT6-T51A的磷酸化水平，但沒有提高HA-SIRT6-T57A或HA-SIRT6-T184A的磷酸化水平（圖7F）。此外，HA-SIRT6-WT和HA-SIRT6-T51A能顯著降低VSMC的LOX-1表達(dá)和脂質(zhì)攝取，而這些因素與HA-SIRT6-T57A和HA-SIRT6-T184A并無差異（圖7G，H）。此外，用SIRT6活性測定試劑盒測定，LKB1能顯著提高 VSMCs中SIRT6的去乙?；富钚?，而蘇氨酸57或184處的丙氨酸突變會阻斷LKB1對SIRT6的激活（圖7I）。此外，與HA-SIRT6-WT相比，磷酸擬態(tài)突變體（蘇氨酸突變?yōu)樘於彼?、HA-SIRT6-T57D和HA-SIRT6-T184D）表達(dá)的SIRT6進(jìn)一步降低了VSMC的LOX-1表達(dá)和脂質(zhì)吸收（圖7J、K）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LKB1在Thr 57和184位點(diǎn)磷酸化SIRT6，從而激活SIRT6，導(dǎo)致VSMCs中LOX-1表達(dá)和脂質(zhì)吸收的減少。

圖7 LKB1磷酸化激活SIRT6

8、在LKB1敲除小鼠中平滑肌LOX-1缺失改善動脈粥樣硬化
       為探討平滑肌LKB1缺乏是否會通過LOX-1促進(jìn)體內(nèi)動脈粥樣硬化，用AAV9-shCON或AAV9-shLOX-1在SM22α啟動子下感染CTR和LKB1^SMKO小鼠，注射AAV8/D377Y-mPCSK9，并喂食Paigen飲食12周。與CTR相比，LKB1^SMKO小鼠的斑塊負(fù)荷更重，AAV9-shLOX-1可減輕斑塊負(fù)荷（圖8A-D）。此外，AAV9-shLOX-1也抑制了平滑肌LKB1缺失導(dǎo)致的病變中BODIPY+/α-SMA+區(qū)域的增加（圖8E）。然而，平滑肌LOX-1的缺失并不影響LKB1^SMKO小鼠的TG、TC、HDL-C或LDL-C水平（圖8F）。因此，體內(nèi)缺乏LOX-1可改善平滑肌LKB1缺失導(dǎo)致的動脈粥樣硬化。

圖8 在LKB1敲除小鼠中平滑肌LOX-1缺失改善動脈粥樣硬化

實(shí)驗(yàn)方法
特異性敲除小鼠的構(gòu)建，動脈粥樣硬化病變測定，免疫熒光，免疫組化，脂質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，油紅O染色，BODIPY染色，膽固醇攝取實(shí)驗(yàn)，膽固醇外排實(shí)驗(yàn)，WB，qPCR，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP），甲基化的DNA免疫沉淀（MeDIP）實(shí)驗(yàn)，共免疫沉淀（CoIP），Pull-down實(shí)驗(yàn)，SIRT6活性實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
Deng Q, Li H, Yue X, Guo C, Sun Y, Ma C, Gao J, Wu Y, Du B, Yang J, Zhang C, Zhang W. Smooth muscle liver kinase B1 inhibits foam cell formation and atherosclerosis via direct phosphorylation and activation of SIRT6. Cell Death Dis. 2023 Aug 22;14(8):542. doi: 10.1038/s41419-023-06054-x. PMID: 37607939; PMCID: PMC10444762.

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