METTL1在前列腺癌中通過tRNA衍生片段生物發(fā)生促進(jìn)腫瘤發(fā)生

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-01-18
目前越來越多的證據(jù)表明,tRNA及其修飾酶的失調(diào)也參與了腫瘤的發(fā)生......

       前列腺癌(PCa)是世界范圍內(nèi)診斷頻率第二高的癌癥,也是男性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。RNA修飾普遍存在于轉(zhuǎn)移RNA (tRNAs)中。目前越來越多的證據(jù)表明,tRNA及其修飾酶的失調(diào)也參與了腫瘤的發(fā)生。作者的研究揭示了tRNA m7g甲基組在PCa中的復(fù)雜作用,并強(qiáng)調(diào)了靶向METTL1作為治療PCa的新治療策略的潛力。本文于2023年7月發(fā)布在《Molecular Cancer》,IF=37.3。
技術(shù)路線


主要研究結(jié)果
1、METTL1在人和小鼠PCa中升高
       為了研究RNA修飾在PCa腫瘤發(fā)生中的潛在作用,作者采用了一種確保選擇與PCa腫瘤發(fā)生相關(guān)的RNA修飾的方法。作者專注于在五項(xiàng)PCa研究的數(shù)據(jù)集中鑒定132組帶注釋的RNAmodifying proteins (RMPs)的表達(dá)變化(圖1A)。此外,作者使用基因工程PCa小鼠模型將作者的分析擴(kuò)展到小鼠PCa(圖1A)。作者發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性PCa中表達(dá)差異最大的基因是METTL1(圖1B)。從原發(fā)性到轉(zhuǎn)移性腫瘤,METTL1的表達(dá)持續(xù)增加(圖1C),在劍橋、斯德哥爾摩和泰勒隊(duì)列中,METTL1的高表達(dá)顯示出更差的預(yù)后(圖1C)。作者還發(fā)現(xiàn)WDR4的表達(dá)升高(圖1C), WDR4是m7g RNA甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的調(diào)控亞基,在其他癌癥中也過表達(dá);然而,作者沒有發(fā)現(xiàn)WDR4過表達(dá)是不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(圖1D)。來自當(dāng)?shù)仃?duì)列(Basurto醫(yī)院)的PCa樣本證實(shí)了METTL1和WDR4蛋白表達(dá)的增加(圖1E)?;谇傲邢侔┠[瘤的激素依賴性,作者進(jìn)行了METTL1、WDR4和AR的表達(dá)分析,但METTL1、WDR4與AR的表達(dá)沒有明顯的相關(guān)性(圖1E)。為了證實(shí)METTL1和WDR4的表達(dá)是否與晚期腫瘤狀態(tài)相關(guān),作者通過S6K的磷酸化狀態(tài)來測量PI3K通路的活性,在大約70%的晚期PCa患者中,S6K的磷酸化狀態(tài)發(fā)生了改變。作者發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4表達(dá)與PI3K通路激活增強(qiáng)呈正相關(guān)(圖1E),表明METTL1和WDR4表達(dá)在晚期PCa腫瘤中升高。綜上所述,作者的研究結(jié)果表明,METTL1是PCa中發(fā)生改變的主要表轉(zhuǎn)錄組調(diào)控因子,其過表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。


圖1. METTL1在前列腺癌中高表達(dá)


2、METTL1的表達(dá)受AKT - mTOR下游信號通路調(diào)控
       接下來,作者試圖闡明前列腺癌中METTL1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。由于雄激素受體(AR)活性增加是PCa的主要驅(qū)動因素之一,作者分析了通過受體和下游靶基因(如KLK3)的表達(dá)來測量的AR表達(dá)或活性增加是否與PCa中METTL1的表達(dá)相關(guān)。在Grasso數(shù)據(jù)集中,作者觀察到METTL1與AR和KLK3之間幾乎顯著的直接相關(guān)。在Taylor數(shù)據(jù)集中,作者發(fā)現(xiàn)了METTL1和AR之間的直接相關(guān)性,支持了這兩個(gè)因素之間潛在關(guān)系的概念。作者使用TGCA數(shù)據(jù)集的分析揭示了METTL1和KLK3之間的直接相關(guān)性。然而,有趣的是,在這個(gè)特定的數(shù)據(jù)集中,作者沒有發(fā)現(xiàn)METTL1和AR之間的顯著相關(guān)性。由于作者發(fā)現(xiàn)與良性前列腺增生標(biāo)本相比,前列腺癌標(biāo)本中METTL1蛋白表達(dá)與磷酸化- s6k呈正相關(guān)(圖1E),作者接下來分析了METTL1表達(dá)是否與PTEN表達(dá)相關(guān),PTEN是PI3K/AKT/mTOR通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子,在大約70%的晚期前列腺癌患者中缺失。分析的所有數(shù)據(jù)集均顯示METTL1與PTEN表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖2A),表明PI3K-mTOR軸調(diào)控了PCa中METTL1的表達(dá)。使用PI3K (BKM-120抑制劑)、AKT (MK2206)、mTORC1(rapamycin)和mTORC1/2 (Torin)的小分子抑制劑進(jìn)一步解剖PI3K - mTORC1/2通路發(fā)現(xiàn),AKT抑制降低了METTL1 mRNA的水平,mTOR抑制劑持續(xù)降低了METTL1 mRNA和蛋白的表達(dá)(圖2B-C),表明METTL1的表達(dá)是通過mTOR信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的。接下來,作者研究了METTL1表達(dá)水平是否有助于確定PTEN缺失相關(guān)的患者生存率降低,這與臨床相關(guān),并在臨床局部腫瘤患者中區(qū)分良性和侵襲性疾病。有趣的是,作者發(fā)現(xiàn)高M(jìn)ETTL1表達(dá)突出了PTEN -低患者預(yù)后不良的子集(圖2D)。為了確定前列腺癌中METTL1的上調(diào)是否是PTEN表達(dá)低或缺失的直接后果,作者分析了野生型(WT)小鼠和Probasine-Cre x PTENflox/flox小鼠(以下簡稱PTEN - ko)前列腺組織中METTL1 mRNA和蛋白水平,這些小鼠在前列腺上皮中有條件地缺失了PTEN。這些小鼠在12周后發(fā)展為高級別腫瘤前病變,在5個(gè)月大后發(fā)展為浸潤性腺癌。作者觀察到PTEN缺失后METTL1的表達(dá)逐漸增加(圖2E-G)。有趣的是,來自小鼠前列腺腫瘤的tRNA在組織中提取的tRNA以及尿液中顯示m7g的沉積顯著增加(圖2H-K)。免疫組織化學(xué)分析進(jìn)一步顯示,METTL1在小鼠前列腺癌中的表達(dá)更高,在腔細(xì)胞中也有高表達(dá),腔細(xì)胞是最常見的上皮細(xì)胞類型,被普遍認(rèn)為是人類前列腺癌的優(yōu)選起源細(xì)胞(圖2L)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明METTL1是mTORC1通路的下游效應(yīng)物,其激活可誘導(dǎo)METTL1在PCa中的表達(dá)增加。


圖2. PI3K-AKT-mTORC通路介導(dǎo)前列腺癌中METTL1表達(dá)上調(diào)


3、METTL1優(yōu)先甲基化tRNA
       為了了解METTL1在PCa腫瘤發(fā)生中的作用,作者通過結(jié)合兩種轉(zhuǎn)錄組的方法確定了METTL1 RNA底物。為了鑒定PCa細(xì)胞中METTL1特異性RNA靶點(diǎn),作者使用了PAR-CLIP,將光反應(yīng)性核糖核苷類似物納入新生RNA中,通過紫外線交聯(lián)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和RNA之間的共價(jià)鍵,然后進(jìn)行下一代測序。以空載體感染多西環(huán)素誘導(dǎo)的細(xì)胞為對照。作者發(fā)現(xiàn),與對照樣本結(jié)合的RNA相比,tRNA代表了METTL1上最豐富的RNA物種,每個(gè)基因的reads密度最高,平均中位數(shù)密度為Log2 12 rpm。(圖3)。與對照樣品相比,作者沒有觀察到HA-METTL1樣品上結(jié)合的其他RNA物種的富集(圖3A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果,作者下載了Bao等人生成的數(shù)據(jù),分析了HEK293T細(xì)胞中METTL1結(jié)合的RNA。tRNA也是HEK293T細(xì)胞中與METTL1結(jié)合最豐富的RNA種類,平均中位密度為log28 rpm。接下來,為了精確定位tRNA中的m7g,作者使用CRISPR/Cas9敲除PCa細(xì)胞系PC3中的METTL1(圖3B)。使用抗m7g抗體的North-dot blot分析和質(zhì)譜分析證實(shí)了METTL1 KO細(xì)胞tRNA中m7g的缺失(圖3B-C)。然后,作者進(jìn)行了AlkAnaline-seq,以單核苷酸分辨率繪制m7g的發(fā)生圖譜,并使用METTL1 KO tRNA作為對照。高通量測序數(shù)據(jù)的分析證實(shí)了先前報(bào)道的鳥苷46可變環(huán)中強(qiáng)大的甲基化(圖3D, F)。作者鑒定出大約50%的同型受體為METTL1底物(圖3E, G)。綜上所述,作者的分析證實(shí)了METTL1優(yōu)先甲基化PCa細(xì)胞中可變環(huán)上的tRNA。


圖3. METTL1優(yōu)先甲基化trna


4、METTL1介導(dǎo)的甲基化保護(hù)tRNA不被切割成小的非編碼RNA
       在酵母和人類中,當(dāng)m7g甲基化降低時(shí),tRNA的穩(wěn)定性降低。為了確定METTL1缺失可能會擾亂PCa細(xì)胞中單個(gè)METTL1靶向tRNA的水平,作者對從PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞中分離的tRNA進(jìn)行了高通量測序。與之前的研究結(jié)果相反,作者沒有發(fā)現(xiàn)證據(jù)表明METTL1特異性甲基化的缺失會降低特異性成熟tRNA同受體的豐度(圖4A)。最近的報(bào)道表明,tRNA修飾保護(hù)或誘導(dǎo)tRNA切割成抑制性小ncRNA。作者分析了來自PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞的小RNA測序數(shù)據(jù),以尋找tRNA片段的主要類別的差異。有趣的是,作者在PC3 METTL1 KO細(xì)胞中檢測到一致的5’tRNA片段富集(圖4B);然而,與WT細(xì)胞相比,大多數(shù)METTL1 KO細(xì)胞的富集程度適度增加(圖4C)。作者的分析顯示,與WT細(xì)胞相比,在所有5'tRNA片段中,一個(gè)特定的類別,即5 '末端低鳥嘌呤tRNA片段(5'TOGs),在KO細(xì)胞中顯著過度代表(log2 FC>2, p值<0.05)(圖4B;圖4C)。5 ' togs長約20或30個(gè)核苷酸,主要來源于METTL1靶tRNA Cys(產(chǎn)生含有5 ' togs的5個(gè)末端鳥嘌呤(5G))和Ala(產(chǎn)生含有5 ' togs的4G)的裂解(圖4DE)。Northern blotting證實(shí),與WT細(xì)胞相比,PC3 METTL1 KO細(xì)胞的兩個(gè)獨(dú)立克隆中cys衍生的5 ' trf的積累較弱,但明顯較高(圖4F)。在PC3、DU145和22Rv1細(xì)胞中,METTL1下調(diào)時(shí)觀察到5'tRFs,表明5'tRFs的形成與PTEN、p53和AR狀態(tài)無關(guān)(圖4F)。一小部分tRNA切割成tRNA衍生的ncRNA是對應(yīng)激的保守反應(yīng),tRNA修飾保護(hù)它們免受應(yīng)激誘導(dǎo)的切割。在應(yīng)激反應(yīng)中,tRNA切割在METTL1 KO細(xì)胞中比在WT細(xì)胞中更為突出,早在氧化應(yīng)激暴露2小時(shí)達(dá)到峰值,在應(yīng)激刺激8小時(shí)后下降,可能是因?yàn)闊o法解決應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加(圖4G, H)。總之,作者的數(shù)據(jù)表明,METTL1介導(dǎo)的甲基化是一種保守的機(jī)制,它調(diào)節(jié)了PCa細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)中源自5’tRNA片段的一類新型小ncRNA的生物發(fā)生,而不管它們的遺傳狀態(tài)如何。


圖4. tRNA中缺乏m7g甲基化導(dǎo)致5'tRNA片段積累


5、METTL1的缺失通過tRNA片段生物發(fā)生抑制翻譯起始
       由于已知5'TOGs抑制全局翻譯,作者接下來研究了5'TOGs的積累是否導(dǎo)致了PC3 METTL1缺失細(xì)胞的翻譯改變。作者證實(shí),與WT細(xì)胞相比,METTL1 KO細(xì)胞中通過o -丙基嘌呤霉素(OP-puro)摻入測量的蛋白質(zhì)翻譯減少(圖5A)。細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中5’tRNA片段的產(chǎn)生在應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制中起關(guān)鍵作用。這個(gè)過程有助于抑制整體蛋白質(zhì)合成,使細(xì)胞能夠恢復(fù)并在壓力條件下生存。為了確定METTL1的去除是否會影響應(yīng)激反應(yīng),作者測量了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)合成速率。m7g的缺失顯著抑制了蛋白合成,并且這一過程與eIF2α磷酸化狀態(tài)無關(guān)。接下來,作者試圖確定METTL1 KO細(xì)胞獨(dú)特的翻譯抑制及其對5'TOGs的依賴的分子基礎(chǔ)。先前的證據(jù)表明,5'TOGs通過取代mRNA帽上的翻譯起始復(fù)合物eIF4A/G/E和調(diào)控因子YB1和PABP1的組分,從而損害翻譯起始。為了確定翻譯起始因子是否從PC3 METTL1 KO細(xì)胞中7-甲基-鳥苷化(m7g)覆蓋的mRNA中轉(zhuǎn)移,作者分析了翻譯起始因子對m7g -帽狀結(jié)構(gòu)被的sepharose beads的親和力。作者發(fā)現(xiàn),與WT細(xì)胞相比,METTL1 KO細(xì)胞中eIF4G和PABP1的m7 g -cap親和力顯著降低(圖5B)。這表明,5'TOGs積累的增加破壞了翻譯起始復(fù)合物某些因子的組裝和結(jié)合的穩(wěn)定性,導(dǎo)致METTL1 KO細(xì)胞中的翻譯受到抑制。作者進(jìn)一步評估了在WT細(xì)胞中表達(dá)的合成5'TOG是否能夠結(jié)合翻譯起始因子和調(diào)節(jié)因子,以及它們對這些因子的親和力是否可以通過合成的逆補(bǔ)體5'TOG RNA(或抗tog)來阻斷。為此,作者用5 '生物素化的5'TOG RNA(包含PC3 METTL1 KO細(xì)胞中最豐富的5'TOG序列)轉(zhuǎn)染PC3 WT細(xì)胞,并添加或不添加抗tog。在去除5 '生物素化-5 ' togs后,作者發(fā)現(xiàn)在抗togs存在下,PABP1和YB1對5'TOG的親和力顯著降低(圖5C)。接下來,作者研究了人工合成的5'TOGs是否可以在WT細(xì)胞中表型化翻譯起始復(fù)合物的位移,以及抗tog RNA是否可以在METTL1 KO細(xì)胞中挽救這種觀察到的效應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染5'TOGS的WT細(xì)胞中,PAPB1與m7g -cap的結(jié)合被取代,但在轉(zhuǎn)染抗tog RNA的METTL1 KO細(xì)胞中,PAPB1與m7g -cap的親和力顯著增加(圖5D)??偟膩碚f,這表明5'TOGs的形成通過取代PAPB1來抑制蛋白質(zhì)翻譯。有趣的是,PAPB1先前已被證明對其他細(xì)胞類型的5'TOGs具有很強(qiáng)的親和力。因此,作者的研究結(jié)果證實(shí),METTL1 KO細(xì)胞中表達(dá)的5'TOGs可以取代mRNA帽上的翻譯調(diào)節(jié)因子,并為METTL1介導(dǎo)的翻譯抑制的分子基礎(chǔ)提供了關(guān)鍵見解。


圖5. METTL1下調(diào)抑制體內(nèi)蛋白合成、增殖和腫瘤生長


6、METTL1下調(diào)可抑制前列腺腫瘤在體內(nèi)和體外的生長
       鑒于METTL1 KO細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)較少,作者假設(shè)METTL1抑制可以降低細(xì)胞和腫瘤的生長。事實(shí)上,作者觀察到METTL1的敲低會損害PC3、DU145和22Rv1細(xì)胞的生長(圖5E)。METTL1下調(diào)還會減少細(xì)胞分裂,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,增加細(xì)胞凋亡,損害球體形成能力,并顯著降低腫瘤異種移植物的生長和增殖(圖5F-I)。因此,作者的數(shù)據(jù)表明,下調(diào)METTL1可以有效地抑制腫瘤生長,有力地支持METTL1在調(diào)節(jié)PCa進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。接下來,作者研究了METTL1甲基化酶活性是否足以促進(jìn)細(xì)胞生長。作者在PC3 METTL1 KO細(xì)胞中重新表達(dá)了野生型METTL1 (WT)和催化死亡突變體(AFPA)(圖5J-L)。與用空載體(eV)轉(zhuǎn)導(dǎo)的KO細(xì)胞相比,重新表達(dá)WT METTL1的KO細(xì)胞的增殖和球體形成能力增強(qiáng)。相比之下,無催化活性突變體的表達(dá)未能促進(jìn)METTL1 KO細(xì)胞生長和球體形成能力(圖5M-N)。由于METTL1的催化活性得到了與調(diào)控亞基WDR4形成復(fù)合物的支持,并且WDR4在PCa中過表達(dá)(圖1C, E),因此作者測試了WDR4的致癌潛力。誘導(dǎo)沉默WDR4并不會降低細(xì)胞或腫瘤的生長。綜上所述,這些結(jié)果表明METTL1以酶活性依賴的方式促進(jìn)PCa細(xì)胞的生長,但不依賴于WDR4。為了進(jìn)一步確定5'TOG是否足以誘導(dǎo)生長停滯和凋亡,作者用5'TOG轉(zhuǎn)染PC3 WT細(xì)胞,用抗tog轉(zhuǎn)染METTL1 KO細(xì)胞,并測量細(xì)胞凋亡和增殖。作者檢測到WT細(xì)胞轉(zhuǎn)染5'TOG RNA后,凋亡顯著增加,增殖顯著減少,而METTL1 KO細(xì)胞轉(zhuǎn)染抗togs后,凋亡顯著減少,但不顯著,增殖顯著增加(圖50,P)??傊?,作者的數(shù)據(jù)表明,METTL1失活和5'TOGs是誘導(dǎo)生長停滯的必要條件。METTL1催化活性版本和抗togs的重新表達(dá)可以部分修復(fù)METTL1 KO細(xì)胞中觀察到的缺陷。
7、METTL1丟失激活I(lǐng)FN信號通路
       鑒于翻譯受到METTL1抑制的影響,作者探討了METTL1缺失對翻譯體即刻變化的影響。為此,作者利用OP-puro特性來標(biāo)記新生蛋白,隨后將其偶聯(lián)到生物素包被的微球上,然后進(jìn)行微球上的消化和LC-MS /MS(圖6A)。基因本體(GO)術(shù)語富集分析發(fā)現(xiàn),與細(xì)胞分裂和有絲分裂相關(guān)的基因翻譯減少,證實(shí)了觀察到的METTL1 KO細(xì)胞增殖缺陷(圖6B)。出乎意料的是,作者還發(fā)現(xiàn)METTL1 KO細(xì)胞中與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本翻譯增加,包括I型和II型干擾素(IFN)信號通路、免疫效應(yīng)過程和分解代謝過程(圖6B)。翻譯的差異反映在PC3 METTL1 KO細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)組組成中,但與RNA表達(dá)水平無關(guān),這表明轉(zhuǎn)錄后或翻譯調(diào)控是導(dǎo)致METTL1 KO細(xì)胞中不相關(guān)的RNA -蛋白表達(dá)水平的原因(圖6C)。為了進(jìn)一步測試METTL1 KO細(xì)胞中某些轉(zhuǎn)錄本的翻譯效率是否存在差異,作者進(jìn)行了多體分析。這種方法使作者能夠確認(rèn)METTL1 KO細(xì)胞中活性多體的形成減少,同時(shí)整體蛋白合成減少(圖6D)。對METTL1 KO細(xì)胞多體部分mRNA富集的分析顯示,與干擾素信號相關(guān)的特定轉(zhuǎn)錄物的翻譯增加,如干擾素調(diào)節(jié)因子9 (IRF9)和干擾素刺激基因15 (ISG15)(圖6D)。作為翻譯變化特異性的對照,作者沒有發(fā)現(xiàn)在METTL1 KO細(xì)胞的多體部分中富集GAPDH、Catenin β、KIF20A或STAT1等轉(zhuǎn)錄本(圖6D)。綜上所述,作者的研究結(jié)果表明,METTL1介導(dǎo)的tRNA甲基化引導(dǎo)著一個(gè)獨(dú)特的翻譯程序。由于5'TOGs可以重新編程翻譯機(jī)制,以支持癌細(xì)胞所需的翻譯程序,作者接下來研究了METTL1 KO細(xì)胞的翻譯變化是否由5'TOGs的生物發(fā)生增加介導(dǎo)。為此,作者用5'TOG和抗tog RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)PC3 WT和METTL1 KO細(xì)胞,并評估蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。作者發(fā)現(xiàn),WT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染5'TOGs增加了IRF9和ISG15蛋白的表達(dá),而在METTL1 KO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染抗tog RNA輕微但顯著地降低了這兩種蛋白的表達(dá)(圖6E)。作者還觀察到METTL1 KO細(xì)胞和異種移植物中STAT1的蛋白表達(dá)和磷酸化增加(圖6E),但其表達(dá)的增加與翻譯的增加無關(guān)(圖6D),而是轉(zhuǎn)錄依賴的,這表明STAT1表達(dá)的增加是由METTL1 KO細(xì)胞中IFN信號通路的激活誘導(dǎo)的??紤]到STAT1激活的抗增殖和促凋亡作用,作者測試了下調(diào)STAT1是否可以逆轉(zhuǎn)METTL1 KO PC3細(xì)胞的生長缺陷。作者發(fā)現(xiàn),在STAT1敲除后,PC3 METTL1 KO細(xì)胞的凋亡減少,增殖增加(圖6F, G),這表明METTL1抑制的抗增殖作用可能部分是通過激活STAT1信號通路介導(dǎo)的。綜上所述,作者的數(shù)據(jù)表明,METTL1介導(dǎo)的tRNA甲基化和tRNA片段生物發(fā)生誘導(dǎo)了激活I(lǐng)FN信號通路的翻譯程序。為了證實(shí)METTL1的高表達(dá)與人類PCa樣本中IFN通路活性的降低相關(guān),作者在三個(gè)PCa表達(dá)數(shù)據(jù)集中評估了ISGs的表達(dá)。綜上所述,作者的數(shù)據(jù)表明,在PCa細(xì)胞和腫瘤中,METTL1的表達(dá)與IFN通路的激活呈負(fù)相關(guān),METTL1的抑制可翻譯激活I(lǐng)FN信號通路。


圖6. m7G tRNA甲基化的缺失導(dǎo)致不同的翻譯程序


8、前列腺癌中METTL1的低表達(dá)與促炎免疫細(xì)胞極化增加相關(guān)
       最近,表觀遺傳靶向治療已被證明在幾種癌癥類型中觸發(fā)IFN抗病毒反應(yīng),包括PCa,引發(fā)先天免疫反應(yīng)并導(dǎo)致許多細(xì)胞因子的產(chǎn)生。為了闡明METTL1抑制是否可以通過激活I(lǐng)FN信號通路引發(fā)先天免疫反應(yīng),作者研究了METTL1下調(diào)是否會改變PCa細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌??傮w而言,在METTL1 KO細(xì)胞中,細(xì)胞因子組成分析顯示,參與促炎活性的細(xì)胞因子分泌增加,并使巨噬細(xì)胞極化為m1樣內(nèi)型,包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子α (TNF-α)(圖7A)。METTL1的去除也誘導(dǎo)了抗炎細(xì)胞因子的下調(diào),包括巨噬細(xì)胞或集落刺激因子(M-CSF)、IL10和IL13(圖7A),可使巨噬細(xì)胞極化為m2樣內(nèi)型。這些數(shù)據(jù)表明,腫瘤細(xì)胞中METTL1的抑制可以使腫瘤微環(huán)境(TME)中的免疫細(xì)胞向細(xì)胞毒性殺瘤內(nèi)型分化。分子技術(shù)的出現(xiàn),如單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué),使審計(jì)腫瘤免疫微環(huán)境的組成成為可能。無監(jiān)督的scRNAseq聚類和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示,在先天免疫群體中,巨噬細(xì)胞在PCa中所占比例最大。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tam)通常表現(xiàn)出m2樣或促腫瘤巨噬細(xì)胞的表達(dá)模式特征,是支持腫瘤發(fā)生的TME的主要組成部分。眾所周知,它們促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲性、血管生成和免疫耐受,同時(shí)也有助于對標(biāo)準(zhǔn)治療、免疫治療和化療的耐藥性。因此,迫切需要開發(fā)能夠消耗巨噬細(xì)胞或誘導(dǎo)其向m1樣或抗腫瘤狀態(tài)再極化的臨床藥物??紤]到這些情況,以及觀察到表達(dá)METTL1的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子已知可驅(qū)動巨噬細(xì)胞向m2樣內(nèi)型極化,作者重點(diǎn)闡明了METTL1在巨噬細(xì)胞極化中的作用。作者用PC3 WT或METTL1 KO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(cm)培養(yǎng)人單核細(xì)胞系THP1,并研究了m1樣和m2樣巨噬細(xì)胞內(nèi)源性標(biāo)記物的表達(dá)(圖7B)。tSNE分析顯示,WT細(xì)胞中的c.m.誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向m1樣內(nèi)型轉(zhuǎn)變,而抑制PCa細(xì)胞中的METTL1則誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向m1樣內(nèi)型轉(zhuǎn)變(圖7B)。此外,PC3 METTL1 KO細(xì)胞cm存在下培養(yǎng)的外周血巨噬細(xì)胞對CD3+T細(xì)胞的增殖和遷移具有更高的誘導(dǎo)作用(圖7C, D)。總之,作者的數(shù)據(jù)表明,METTL1在癌細(xì)胞中的抑制可能會刺激TME的細(xì)胞毒性和抗腫瘤炎癥反應(yīng)。為了在體內(nèi)驗(yàn)證作者的發(fā)現(xiàn),作者使用免疫組織化學(xué)分析評估了人類前列腺腫瘤的腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞組成。分析表明,在PCa石蠟樣品中,m2樣巨噬細(xì)胞浸潤與METTL1表達(dá)之間存在顯著的直接相關(guān),但m1樣巨噬細(xì)胞浸潤呈相反趨勢。同樣,CD8+T細(xì)胞浸潤與METTL1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖7E)??傊?,作者的研究結(jié)果表明,抑制前列腺癌細(xì)胞中METTL1的表達(dá)可以在體外引發(fā)細(xì)胞毒性免疫反應(yīng),并進(jìn)一步支持人前列腺癌中METTL1的低表達(dá)與腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的增加有關(guān)。


圖7. METTL1在PCa中的低表達(dá)與細(xì)胞毒性浸潤增加和對ICB治療的良好反應(yīng)相關(guān)


9、METTL1抑制增強(qiáng)了前列腺癌患者對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的應(yīng)答
       PTEN-KO小鼠前列腺上皮中METTL1雜合缺失(PTEN-KO/METTL1+/-)和METTL1條件缺失(PTEN-KO/ mett1flox /flox)導(dǎo)致腹側(cè)和前葉腫瘤體積顯著減少,PTEN-KO/METTL1+/+小鼠的腫瘤體積始終較大(圖7F)?;谄涮卣魇钦T導(dǎo)m1樣巨噬細(xì)胞極化,以及體外CD8+T細(xì)胞的增殖和遷移增強(qiáng)(圖7AD),作者隨后的研究重點(diǎn)是分析METTL1缺陷前列腺腫瘤中巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的組成。免疫組織化學(xué)分析顯示,與METTL1+/+腫瘤相比,m1樣巨噬細(xì)胞(iNOS+)的瘤內(nèi)浸潤顯著增加,而m2樣巨噬細(xì)胞(Arg1/CD68+)的浸潤則顯著增加,并且METTL1+/-和METTL1+/+和METTL1 /flox腫瘤中CD8+T細(xì)胞增加(圖7G)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞,以其CD8的表達(dá)而聞名,具有直接識別和消除癌細(xì)胞的非凡能力,使其成為抗癌免疫反應(yīng)中最有效的效應(yīng)器。為了確定小鼠METTL1缺失的抗腫瘤作用是否由于腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞浸潤增加,作者檢測了抗CD8α抗體處理PTEN-KO/METTL1+/+和PTEN-KO/METTL1fl/fl小鼠全身消除CD8+T細(xì)胞的效果。為了闡明METTL1抑制對免疫腫瘤組成重編程的影響,作者分析了免疫調(diào)節(jié)分子,包括細(xì)胞因子和趨化因子,作為腫瘤中存在的免疫細(xì)胞的替代標(biāo)記物。作者的研究結(jié)果揭示了細(xì)胞因子組成的顯著變化,其特征是促腫瘤細(xì)胞因子的分泌減少。此外,作者觀察到在PTEN-KO/ mePCa1fl /fl腫瘤中,已知與免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)治療有利應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子分泌增加(圖7H)。這些發(fā)現(xiàn)表明,抑制METTL1可能有助于改善ICB治療結(jié)果的免疫微環(huán)境,突出了靶向METTL1作為增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的治療策略的潛力。為了確定mett1缺陷腫瘤的腫瘤內(nèi)細(xì)胞因子組成是否可以增強(qiáng)ICB治療的療效,作者用抗pd1和抗ctl4a抗體治療小鼠。與未治療的小鼠相比,PTEN-KO/METTL1+/+小鼠在ICB治療后未顯示腫瘤體積減少,而PTEN-KO/ mett1flox /flox小鼠在ICB治療后腫瘤體積顯著減少(圖7I)。作者還研究了METTL1表達(dá)水平是否可以預(yù)測患者ICB治療的療效。使用ROC繪圖儀平臺,作者分析了METTL1在抗pd1治療的幾種腫瘤類型中的表達(dá)水平。作者發(fā)現(xiàn),在乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,對ICB治療有反應(yīng)的METTL1表達(dá)低于無反應(yīng)的METTL1表達(dá),這表明高M(jìn)ETTL1表達(dá)預(yù)示著對ICB治療的不良反應(yīng)(圖7J)??傊髡叩难芯拷Y(jié)果表明,METTL1的表達(dá)水平可以決定腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性免疫浸潤和ICB治療的成功。
結(jié)論
       作者的研究為METTL1在前列腺癌(PCa)中的致癌功能和過表達(dá)提供了令人信服的證據(jù)。作者還通過tRNA片段生物發(fā)生發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的表達(dá)調(diào)控和選擇性翻譯控制層。通過抑制METTL1介導(dǎo)的甲基化,作者能夠增加一類新的ncRNA (5'TOGs)的生物發(fā)生,這些ncRNA調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中干擾素信號通路的激活。此外,癌細(xì)胞中METTL1的抑制導(dǎo)致細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的浸潤增加,從而將免疫抑制的前列腺TME轉(zhuǎn)變?yōu)闅⒘鰞?nèi)型。這些結(jié)果表明,單獨(dú)靶向METTL1或聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑具有開發(fā)有效治療策略的巨大潛力,特別是對于治療選擇有限的去勢抵抗性前列腺癌患者。

實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)、PI3K通路抑制和DHT治療、患者樣本收集、人類前列腺腫瘤數(shù)據(jù)集的計(jì)算表達(dá)和突變負(fù)荷分析、穩(wěn)定細(xì)胞系的克隆和生成、WB、RNA提取、qPCR、斑點(diǎn)印跡、免疫組化、免疫熒光、PAR?CLIP、AlkAniline?seq、tRNA?seq、Northern blotting、流式細(xì)胞術(shù)、Cap binding assay、轉(zhuǎn)染、pulldown、增殖實(shí)驗(yàn)、外周血T細(xì)胞分離、增殖和遷移試驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
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