通過(guò)分泌組分析鑒定MYH9作為滑膜細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

       類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的特征是滑膜增生和廣泛的血管生成，稱為血管膜形成，這被認(rèn)為是RA的病理標(biāo)志。RA患者的纖維原細(xì)胞樣的滑膜細(xì)胞 (RA-FLSs)分泌各種疾病加重因子。這些因素對(duì)RA的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨ぱ装Y的持續(xù)、免疫細(xì)胞的化學(xué)吸引、新血管的促進(jìn)、自身抗原的產(chǎn)生和對(duì)關(guān)節(jié)的長(zhǎng)期性損傷中起著重要作用。因此，RA-FLSs分泌的各種分子可以作為有用的生物標(biāo)志物，代表RA的疾病嚴(yán)重程度，并可能代表治療靶點(diǎn)。然而，來(lái)自RA-FLSs的分泌分子的全局系統(tǒng)概況仍有待澄清。因此，可以將蛋白質(zhì)組學(xué)分析和平行反應(yīng)監(jiān)控（PRM）相結(jié)合來(lái)評(píng)估RA-FLS衍生的分泌組，并隨后發(fā)現(xiàn)與侵襲性血管翳相關(guān)的關(guān)鍵分泌蛋白。本文發(fā)布于《Annals of the Rheumatoid Arthritis》,IF=27.4。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1、RA-FLSs的分泌組分析
       為了評(píng)估RA-FLSs的促炎分泌組，作者培養(yǎng)了從RA患者滑膜組織中分離的FLSs，這些患者未經(jīng)治療(對(duì)照組)或接受腫瘤壞死因子(TNF)α+白細(xì)胞介素(IL)-1β治療，模擬RA關(guān)節(jié)的炎癥狀態(tài)(圖1A)。在匯集培養(yǎng)上清后，作者將匯集的樣品分成24個(gè)部分，并使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析對(duì)單個(gè)部分進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析(圖1A)。使用LC-MS/MS數(shù)據(jù)集，作者通過(guò)使用MS- gf +和UniProt人類參考蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)(圖1A)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，鑒定出843種具有三個(gè)以上獨(dú)特兄弟肽的RA-FLS分泌蛋白，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<1%。基因本體細(xì)胞成分的富集分析表明，843個(gè)蛋白中最顯著富集的蛋白位于細(xì)胞外區(qū)域(747個(gè)蛋白)和細(xì)胞外囊泡(EVs);597個(gè)蛋白)(圖1B)。此外，843種蛋白中有94.3%與人血漿中檢測(cè)到的細(xì)胞外蛋白或分泌蛋白重疊(圖1C)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)支持作者通過(guò)LC-MS/MS分析獲得的RA-FLS分泌組的有效性。接下來(lái)，作者使用DAVID軟件對(duì)基因本體生物過(guò)程(Gene Ontology Biological processes, GOBPs)進(jìn)行富集分析，研究了與RA-FLSs釋放的843種蛋白質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程。RA-FLS分泌組主要與代謝(27.4%)、發(fā)育過(guò)程(19.2%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(17.4%)、細(xì)胞粘附/遷移(15.7%)、細(xì)胞增殖(8.7%)和免疫應(yīng)答(7.0%)相關(guān)(圖1D)。值得注意的是，RA-FLS分泌組最強(qiáng)烈地代表了與腸膜形成相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程;總體而言，48.5%(409個(gè)蛋白)的分泌組與pannus介導(dǎo)的RA病理相關(guān)，包括細(xì)胞遷移/侵襲(179個(gè)蛋白)、細(xì)胞外基質(zhì)組織(177個(gè)蛋白)、細(xì)胞增殖/凋亡(178個(gè)蛋白)、血管生成(46個(gè)蛋白)和pannus相關(guān)的信號(hào)通路(21個(gè)蛋白)(圖1E)。此外，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的RA-FLS分泌組顯著代表了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、Wnt、RhoA和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及參與免疫反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(核因子κ B、Fc受體和TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))(圖1F)。因此，RA-FLSs分泌組可以提供一個(gè)全面的RA-FLSs分泌因子列表，這些因子參與了pannus的形成，而pannus是RA的病理標(biāo)志。

圖1. RA-FLS分泌組的特征

2、SFs中pannus相關(guān)的RA-FLS分泌組的靶向分析
       為了進(jìn)一步表征RA-FLSs的分泌組譜，作者使用PRM方法進(jìn)行了靶向蛋白定量，并試圖確定臨床相關(guān)性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，作者從843個(gè)蛋白中選擇了493個(gè)參與pannus相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程(圖2A)。其中，作者根據(jù)前面描述的標(biāo)準(zhǔn)，選擇了151個(gè)含有2或3個(gè)定量肽的蛋白質(zhì)，并獲得了高質(zhì)量的MS/MS譜，然后作者構(gòu)建了包含151個(gè)蛋白質(zhì)的436個(gè)定量肽的MS/MS譜的譜庫(kù)(見(jiàn)圖1A, pannus相關(guān)分泌組)。為了測(cè)試151個(gè)蛋白的生物學(xué)相關(guān)性，作者對(duì)SFs(關(guān)節(jié)中的代表性生物液)中的151個(gè)pannus相關(guān)分泌蛋白進(jìn)行了PRM分析，SFs來(lái)自RA (n=117)和骨關(guān)節(jié)炎(n=45，非RA對(duì)照)患者，通過(guò)關(guān)節(jié)穿刺獲得。在使用IgY14耗盡柱去除14個(gè)豐富的蛋白后，使用PRM分析對(duì)單個(gè)SF樣品中的151個(gè)蛋白進(jìn)行定量(圖2B)。在至少一個(gè)SF樣品中鑒定出對(duì)應(yīng)121個(gè)蛋白的277個(gè)定量肽的豐度。接下來(lái)，作者研究了121種pannus相關(guān)分泌蛋白中哪一種與RA的病理嚴(yán)重程度相關(guān)，包括滑膜增生和血管生成，在SF取樣時(shí)通過(guò)肌肉骨骼US同時(shí)評(píng)估;由于US能以無(wú)創(chuàng)的方式密切反映關(guān)節(jié)病變的嚴(yán)重程度，因此被廣泛用于RA的研究。因此，作者采用US比較了OA(病理對(duì)照)、輕度RA和重度RA三組患者中PRM肽的豐度。根據(jù)以下嚴(yán)重程度標(biāo)準(zhǔn)(圖2C)，作者發(fā)現(xiàn)與OA和輕度RA組相比，DEPs在重度RA組中表達(dá)增加:(1) 9個(gè)DEPs(膜聯(lián)蛋白A1 (ANXA1)， rho GDP解解抑制劑α (ARHGDIA)，環(huán)化酶相關(guān)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白1 (CAP1)，膠原V型α 2鏈(COL5A2)，纖維連接蛋白1 (FN1)，葡萄糖-磷酸異構(gòu)體酶(GPI)， moesin (MSN)， MYH9和S100鈣結(jié)合蛋白A6 (S100A6))，灰色US (GSUS)等級(jí)為0和1,GSUS等級(jí)為2和3(輕度和重度滑膜肥厚);(2)10個(gè)DEPs (ANXA1, CAP1, COL5A2, FN1, GPI, MSN, MYH9, MYH9，帕金森病相關(guān)脫糖酶7 (PARK7)， S100A6和超氧化物歧化酶2 (SOD2))在功率多普勒US (PDUS)分級(jí)為0與PDUS分級(jí)為1-3之間的差異。此外，當(dāng)活動(dòng)性滑膜炎被定義為GSUS分級(jí)為2或3或PDUS分級(jí)為1-3時(shí)，與非活動(dòng)性滑膜炎患者相比，活動(dòng)性滑膜炎R(shí)A樣本中鑒定出9個(gè)DEPs (ANXA1、ARHGDIA、CAP1、COL5A2、FN1、GPI、MSN、MYH9和S100A6)(圖2C)。8種典型dep的差異表達(dá)反映滑膜肥大、血管擴(kuò)張和活動(dòng)性滑膜炎，如圖2D所示。作者還試圖確定121種蛋白與RA炎癥活性的相關(guān)性。隨后，通過(guò)SF WBC計(jì)數(shù)≥5000×103 cells/mL與SF WBC <5000×103 cells/mL的比較，作者鑒定了10個(gè)DEPs (APOA1、arhdia、CAP1、cofilin 1 (CFL1)、GPI、谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶P1 (GSTP1)、MSN、MYH9、硫氧還蛋白依賴性過(guò)氧化物還原酶(PRDX3)和S100A9)，并通過(guò)血液CRP水平≥0.5 mg/dL與<0.5 mg/dL的比較鑒定了5個(gè)DEPs (GPI、GSTP1、MSN、MYH9和S100A9)(圖2E、F)。作者最終選擇了16例dep，這些dep與上述四項(xiàng)RA嚴(yán)重程度(基于US)和炎癥活性(基于SF WBC計(jì)數(shù)和血液CRP水平)中的至少一項(xiàng)密切相關(guān)。在16種DEPs中，APOA1、FN1、GPI和S100A9作為自身抗原、炎癥介質(zhì)、增殖誘導(dǎo)劑或細(xì)胞凋亡抑制劑與RA發(fā)病有關(guān)。此外，已知某些DEPs是由RA-FLSs產(chǎn)生的(GPI和S100A9)，其他DEPs參與RA-FLSs的增殖(MSN)和侵襲(ANXA1和CFL1)，并參與炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生(CAP1)，這表明作者的PRM分析結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致?？偟膩?lái)說(shuō)，PRM分析鑒定出16個(gè)關(guān)鍵dep，表明RA的“侵襲性pannus”和“炎癥活性”，隨后被稱為“滑膜細(xì)胞分泌組特征”(SSS)。

圖2. pannus相關(guān)RA-FLS分泌組蛋白的差異表達(dá)

3、鑒定MYH9作為RA-FLSs侵襲性和炎癥活性的新候選指標(biāo)
       在SSS中，GPI、MYH9和MSN三個(gè)蛋白滿足選擇SSS的所有標(biāo)準(zhǔn)(圖3A)。雖然GPI和MSN與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，但MYH9在RA中的作用很少被研究。因此，作者決定進(jìn)一步研究這個(gè)新的靶點(diǎn)。作者首先使用ELISA比較了RA和OA sf中的MYH9水平，發(fā)現(xiàn)RA sf中的MYH9水平明顯高于OA sf(圖3B)。此外，RA-FLSs產(chǎn)生的主要趨化因子和細(xì)胞因子CCL2、IL-6、IL-8、TGFβ和IL-1β的水平，以及RA-FLSs的中樞激活因子TNFα的水平，與RA SFs中MYH9的水平相關(guān)(圖3C)。這些發(fā)現(xiàn)與作者的PRM分析結(jié)果一致，顯示MYH9水平的升高取決于滑膜炎和全身炎癥的嚴(yán)重程度(圖2D,F)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種異質(zhì)性疾病，涉及多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞過(guò)程，其主要病理，盡管存在泛膜形成的共性，但可能因疾病分期和表型而異。作者質(zhì)疑MYH9表達(dá)是否特別反映在優(yōu)先表現(xiàn)為“侵襲性血管翳”病理的亞組中。因此，作者首先獲得了先前報(bào)道的使用152例RA患者滑膜組織生成的大量RNA-seq數(shù)據(jù)集，并使用正交非負(fù)矩陣分解聚類(圖3D)確定了RA的三個(gè)主要亞型(Sub1, Sub2和Sub3)。為了進(jìn)一步表征每種亞型的特征，作者試圖通過(guò)使用ConsensusPathDB進(jìn)行基因集富集分析來(lái)定義每種亞型中主要上調(diào)基因所代表的主要細(xì)胞通路。Sub1主要與細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞通路相關(guān)(如圖3E中的細(xì)胞周期和G2/M檢查點(diǎn))，Sub2與細(xì)胞代謝相關(guān)的通路相關(guān)(如圖3E中的丙酮酸、氨基酸和脂質(zhì)代謝)，Sub3與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的通路相關(guān)(如圖3E中的膠原形成、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用和TGFβ/BMP/Hippo信號(hào)傳導(dǎo))，表明Sub3是侵襲性腸腺所特有的。值得注意的是，MYH9在Sub3中表達(dá)水平最高(圖3F)，這與作者的PRM分析結(jié)果一致，表明MYH9與促遷移和促侵襲病理的關(guān)系比與其他細(xì)胞過(guò)程(細(xì)胞增殖和代謝)的關(guān)系更大。作者進(jìn)一步分析了從大量RNAseq數(shù)據(jù)中鑒定的三種亞型滑膜組織中富集的細(xì)胞類型。然后，作者通過(guò)使用CIBERSORTx對(duì)相應(yīng)的大量RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞型反褶積，估計(jì)了三個(gè)亞組的每個(gè)滑膜組織中五種細(xì)胞類型的比例。作者發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他四種免疫細(xì)胞類型的比例，Sub3含有高比例的成纖維細(xì)胞，與RA-FLSs相對(duì)應(yīng)(圖3G)。這些數(shù)據(jù)，再加上Sub3中MYH9表達(dá)的增加(圖3F)，表明MYH9與RA滑膜中成纖維細(xì)胞顯性病理密切相關(guān)，這與圖2D的US分析結(jié)果一致。

圖3. MYH9作為SSS的重要成員，代表RA-FLSs的侵襲性

4、MYH9在RA患者FLSs和滑膜中的表達(dá)
       基于PRM和細(xì)胞型反褶積分析，作者驗(yàn)證了MYH9是否真的在RA-FLSs中表達(dá)，是否參與了FLS的遷移和侵襲。正如預(yù)期的那樣，基于qPCR分析，MYH9 mRNA在RA-FLSs中表達(dá)，并且在促炎細(xì)胞因子(包括IL-1β和TGFβ)的刺激下表達(dá)增加(圖4A)。經(jīng)ELISA檢測(cè)，IL-1β和TNFα刺激的RA-FLSs分泌MYH9蛋白相似，但TGFβ不分泌MYH9蛋白(圖4B)。作者之前證明，RA-FLSs嚴(yán)重暴露于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)刺激，如缺氧和促炎刺激。值得注意的是，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激源tunicamycin治療RA-FLSs，可顯著增加MYH9分泌，而不影響MYH9 mRNA水平(圖4A,B);另一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激源thapsigargin未能誘導(dǎo)MYH9分泌(圖4B)。有趣的是，TGFβ和IL-6處理并沒(méi)有激發(fā)RA-FLSs(細(xì)胞外)MYH9的分泌(圖4B)，但通過(guò)western blot分析，它確實(shí)大幅上調(diào)了RA-FLSs(細(xì)胞內(nèi))MYH9的表達(dá)(圖4C)。這些數(shù)據(jù)表明，促炎細(xì)胞因子IL-1β和tnf - α以及tunicamin可以誘導(dǎo)RA-FLSs分泌MYH9，并且似乎與其在細(xì)胞中的表達(dá)水平并不一定相關(guān)。RA滑膜細(xì)胞不僅由FLSs組成，還包括巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(MLSs)。從血液中募集的mls和單核細(xì)胞是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)慢性炎癥長(zhǎng)期存在所必需的。作者發(fā)現(xiàn)，LPS處理后，人血源性單核細(xì)胞MYH9 mRNA表達(dá)和MYH9蛋白分泌均顯著增加(圖4D,E)。TNFα也適度增加單核細(xì)胞MYH9 mRNA的表達(dá)，但不能像LPS那樣顯著提高M(jìn)YH9的分泌(圖4D,E)。值得注意的是，培養(yǎng)單核細(xì)胞的MYH9分泌量明顯高于RA-FLSs(見(jiàn)圖4B和圖E)。此外，通過(guò)western blot分析，LPS、TNFα和IL-1β刺激外周單核細(xì)胞顯著增加(細(xì)胞內(nèi))MYH9表達(dá)(圖4F)。這些數(shù)據(jù)表明，TLR4結(jié)扎和促炎細(xì)胞因子TNFα和IL-1β可以增加人單核細(xì)胞MYH9的分泌和/或表達(dá)。免疫組織化學(xué)顯示，MYH9在RA滑膜中的表達(dá)高于OA滑膜，尤其是在粘膜層和下層白細(xì)胞中(圖4G)。免疫熒光染色同樣顯示myh9表達(dá)細(xì)胞與抗cd55 +和antid68 +細(xì)胞明顯共定位，證實(shí)了FLSs和MLSs是RA滑膜中主要表達(dá)myh9的細(xì)胞(圖4H)?？偟膩?lái)說(shuō)，MYH9在RA滑膜的FLSs和MLSs中表達(dá)，并且可以在促炎細(xì)胞因子、toll樣受體激動(dòng)劑(LPS)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的刺激下從這些細(xì)胞分泌(或排泄)。

圖4. MYH9在RA- FLSs和RA滑膜中的表達(dá)

5、MYH9在RA-FLSs遷移和侵襲中的重要作用
       MYH9編碼非肌球蛋白IIA重鏈。由MYH9和MLC組成的非肌球蛋白IIA是細(xì)胞粘附和遷移不可缺少的因子。由于FLSs的遷移和侵襲增強(qiáng)是RA的關(guān)鍵病理之一，作者研究了MYH9在這些細(xì)胞過(guò)程中的作用。作者發(fā)現(xiàn)，在TNFα和TGFβ處理的RA-FLSs中，MLC磷酸化(非肌肉肌球蛋白可以轉(zhuǎn)化為活性形式)顯著增加，這表明促炎細(xì)胞因子刺激增強(qiáng)了RA-FLSs的myh9依賴性活性(圖5A)。眾所周知，激活的非肌球蛋白IIA通過(guò)其頭部結(jié)構(gòu)域與f -肌動(dòng)蛋白結(jié)合。在細(xì)胞擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(圖5B)中，作者發(fā)現(xiàn)，在將懸浮的RA-FLSs附著在涂有纖維連接蛋白的玻璃上20min后，MYH9彌散分布在細(xì)胞質(zhì)中，而F-actin主要分布在細(xì)胞邊緣，其中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架經(jīng)歷了廣泛的重塑，這是通過(guò)F-actin和MYH9的雙重免疫染色確定的。隨著時(shí)間的推移，在RA-FLSs在纖維連接蛋白涂層玻璃上孵育60min和120min后，MYH9主要在細(xì)胞邊緣被檢測(cè)到，并與f -肌動(dòng)蛋白共定位。此外，在RA-FLSs穩(wěn)定附著一夜后，大多數(shù)MYH9在細(xì)胞質(zhì)中彌散重新分布，但在TGFβ刺激下，一些MYH9分子在細(xì)胞邊緣被發(fā)現(xiàn)，并與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架中的F-actin共定位(圖5C)?？傊@些結(jié)果支持了先前的報(bào)道，即MYH9活性可以由TGFβ誘導(dǎo)，并與腫瘤細(xì)胞中的f -肌動(dòng)蛋白結(jié)合。為了確定MYH9對(duì)RA-FLSs遷移和侵襲的影響，作者使用siRNA敲低MYH9(圖6A)。敲除MYH9后，RA-FLS遷移(圖6B)、實(shí)時(shí)傷口遷移(圖6C)、侵襲(圖6D)均顯著降低。此外，含有板足的RA-FLSs的數(shù)量通過(guò)MYH9敲低相應(yīng)減少(圖6E)，板足是眾所周知的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，代表遷移細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白重組。與此同時(shí)，MYH9缺陷顯著損害了paxillin磷酸化(圖6F)，這是局灶黏附的重要步驟，也是細(xì)胞遷移動(dòng)力學(xué)不可或缺的。綜上所述，這些觀察結(jié)果以及早期的報(bào)告表明，TGFβ刺激可以增加MYH9的活性和表達(dá)，從而誘導(dǎo)paxillin的磷酸化以及MYH9與F-actin的結(jié)合，最終促進(jìn)RA-FLSs的粘附、遷移和侵襲。為了進(jìn)一步研究MYH9在體內(nèi)RA-FLS侵襲性中的作用，作者建立了SCID小鼠異種移植模型，這是一種人源化滑膜炎模型，在SCID小鼠的左側(cè)植入含有RA-FLS的人軟骨，在同一小鼠的右側(cè)植入不含RA-FLS的人軟骨。植入MYH9缺陷RA-FLSs的軟骨在同側(cè)(左側(cè))和對(duì)側(cè)(右側(cè))的破壞和降解水平均顯著降低(圖6G)，表明MYH9敲低抑制了RA-FLSs的局部侵襲，并可能延緩RA-FLSs從受影響關(guān)節(jié)向未受影響軟骨的遠(yuǎn)處遷移。體外和體內(nèi)使用siRNA的研究結(jié)果強(qiáng)烈表明，MYH9是調(diào)節(jié)FLS遷移和侵襲的一個(gè)極好的靶點(diǎn)。因此，作者測(cè)試了blebbistatin(一種特異性MYH9抑制劑，可抑制非肌球蛋白II的活性)是否能在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)軟骨破壞，并在體外抑制RA-FLSs的親遷移和親侵襲表型。blebbistatin處理后，RA-FLSs的遷移、侵襲、板壁形成和實(shí)時(shí)創(chuàng)面遷移均被顯著抑制，體外不影響細(xì)胞活力(圖7A-D)，這與MYH9 siRNA敲低實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，在SCID小鼠體內(nèi)人源性滑膜炎模型中，腹腔注射blebbistatin (10 mg/kg，每周兩次)可顯著降低RA-FLSs介導(dǎo)的同側(cè)和對(duì)側(cè)軟骨降解(圖7E)。這些結(jié)果表明，blebbistatin抑制了RA-FLSs在同側(cè)的局部侵襲，并阻止了它們向未植入RA-FLSs的對(duì)側(cè)遷移。為了在更復(fù)雜的關(guān)節(jié)炎模型中進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，除了FLSs外，還有多種免疫細(xì)胞參與疾病進(jìn)展，作者引入了兩種不同的慢性炎性關(guān)節(jié)炎小鼠模型，包括甲基化牛血清白蛋白(BSA)/ il -1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。結(jié)果顯示，腹腔注射blebbistatin(每天10 mg/kg)可顯著減少BSA/ il -1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠的骨和軟骨破壞，盡管其對(duì)受影響關(guān)節(jié)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響不大(圖7F);大多數(shù)小鼠耐受blebbistatin甚至重復(fù)治療，并且沒(méi)有明顯的不良反應(yīng)或毒性，包括血小板減少癥(數(shù)據(jù)未顯示)。用blebbistatin (10 mg/kg，每周2次)治療的小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度也明顯低于單獨(dú)使用vehicle的小鼠。這些數(shù)據(jù)表明，blebbistatin治療可有效改善多種免疫/炎癥細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)的破壞，并延緩主要由RA-FLSs介導(dǎo)的關(guān)節(jié)破壞和疾病傳播。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了MYH9對(duì)于RA-FLSs的遷移和侵襲至關(guān)重要，并證明了blebbistatin抑制MYH9在體外和體內(nèi)成功地抑制了RA-FLSs介導(dǎo)的局部侵襲和軟骨降解。

圖5. TGFβ對(duì)MYH9的激活及其與RA-FLSs中F-actin的共定位

圖6. MYH9對(duì)RA-FLSs遷移和侵襲的影響

圖7. 非肌球蛋白II特異性抑制劑blebbistatin減少RA-FLSs的遷移和侵襲

結(jié)論
       總之，作者的研究為RA-FLSs衍生的分泌組提供了一個(gè)全面的資源，可以應(yīng)用于各種研究，以幫助發(fā)現(xiàn)由RA-FLSs分泌的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的病理過(guò)程的新調(diào)節(jié)因子。此外，對(duì)RA-FLSs衍生的分泌組進(jìn)行PRM分析，發(fā)現(xiàn)包含SSS的16種分泌蛋白代表了侵襲性輸卵管的病理。類似的PRM分析應(yīng)該應(yīng)用于識(shí)別RA發(fā)病機(jī)制中其他過(guò)程的關(guān)鍵分泌蛋白，包括RA-FLSs的代謝改變、異常增殖和去分化，因?yàn)樗晒Φ胤诸惲饲忠u性泛膜相關(guān)的SSS。最后，作者提出MYH9是一個(gè)有希望延緩RA-FLSs異常遷移和侵襲的靶點(diǎn)，也提出了SSS的潛在治療候選物，可以設(shè)計(jì)詳細(xì)的功能實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方法
樣本收集（滑膜液）、評(píng)估滑膜炎嚴(yán)重程度、細(xì)胞活力測(cè)定、免疫組化、ELISA、q-PCR、WB、分泌組的蛋白質(zhì)組學(xué)分析、基于RNA-seq數(shù)據(jù)的RA亞型鑒定、RA-FLS分泌組的PRM分析、滑膜組織免疫熒光染色、Cell-spreading化驗(yàn)、細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn)、SCID小鼠人源化滑膜炎體內(nèi)模型
參考文獻(xiàn)
Lee S, Choi E, Chae S, Koh JH, Choi Y, Kim JG, Yoo SA, Hwang D, Kim WU. Identification of MYH9 as a key regulator for synoviocyte migration and invasion through secretome profiling. Ann Rheum Dis. 2023 Aug;82(8):1035-1048. doi: 10.1136/ard-2022-223625. Epub 2023 May 15. PMID: 37188496; PMCID: PMC10359537.