代謝重編程角度揭示自噬與糖酵解之間的相互作用的機制

欄目：最新研究動態(tài) 發(fā)布時間：2024-01-29
本研究描述了自噬調(diào)控機制，整合了兩個高度保守的生命過程（糖酵解和自噬）......



       自噬和糖酵解是涉及生理和病理細胞程序的高度保守的生物過程，但這些過程之間的相互作用并不明確。本研究發(fā)現(xiàn)了ULK 1直接與LDHA相互作用促進乳酸產(chǎn)生，乳酸通過Vps 34乳?；B接自噬和糖酵解，Vps 34乳?；鰪娏薞ps 34與Beclin 1、Atg 14 L和UVRAG的結(jié)合，然后增加了Vps 34脂質(zhì)激酶活性，從而促進了自噬通量和內(nèi)溶酶體運輸。本研究描述了自噬調(diào)控機制，整合了兩個高度保守的生命過程（糖酵解和自噬）。本文于2023年6月發(fā)表于《Science Advances》上，IF=13.6。
技術(shù)路線

















研究內(nèi)容

1.ULK1誘導LDHA Ser196磷酸化

       ULK 1是參與自噬早期到晚期階段的最關(guān)鍵的蛋白激酶。為了全面鑒定ULK 1相互作用蛋白，進行了串聯(lián)親和純化。免疫沉淀和酵母雙雜交測定證實ULKl與LDHA相互作用（圖1A-C）。由于ULK1介導糖酵解酶HK和PFK1的磷酸化，我們推測ULK1可能是一種LDHA激酶。為了檢驗這一假設(shè)，進行了體外激酶測定和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)LDHA在S196被ULK1磷酸化。為了驗證LDHA S196的磷酸化，產(chǎn)生特異性識別S196-磷酸化LDHA的多克隆抗體（圖1D）。用丙氨酸替換196位的絲氨酸（S196 A）完全消除了LDHA磷酸化（圖1E）。此外，通過Earle平衡鹽溶液（EBSS）誘導的饑餓或雷帕霉素（mTOR）抑制劑雷帕霉素的機制靶標的ULKl活化增強LDHA S196磷酸化，并且通過ULKl抑制劑MRT68921的ULKl抑制降低LDHA S196磷酸化（圖1F）。同樣地，與對照細胞相比，ULK1敲除（KO）小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）中的LDHA S196磷酸化降低，并且在正常和EBSS培養(yǎng)基中ULK1重新表達后，LDHA S196磷酸化重新建立（圖1G）。LDHA敲低抑制p62降解，并且LDHAWT和LDHAS196D的轉(zhuǎn)染完全逆轉(zhuǎn)了LDHA敲低的作用，而LDHAS196A部分挽救了這些作用（圖1H）。體外激酶測定和Western印跡進一步證實了LDHAWT的Ser196被ULK1磷酸化，但LDHA突變體（LDHAS96A）在體外不被ULK1磷酸化（圖1I）。因此，這些結(jié)果表明ULK1作為上游調(diào)節(jié)因子介導LDHA S196磷酸化。


圖1：1.ULK1誘導LDHA Ser196磷酸化

2.LDHA磷酸化增強其酶活性

       為了測試磷酸化對LDHA酶活性的生物學效應，通過EBSS培養(yǎng)基或mTOR抑制劑雷帕霉素的ULK 1活化增加了細胞溶質(zhì)乳酸鹽水平，而ULK1抑制劑MRT 68921降低了細胞溶質(zhì)乳酸鹽水平（圖2A）。同樣地，通過短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低ULKl表達也降低了正常培養(yǎng)基或EBSS培養(yǎng)基中的細胞溶質(zhì)乳酸水平，但沉默其他自噬基因（即Vps 34、Atg 5和Atg 7）的表達對細胞溶質(zhì)乳酸水平?jīng)]有影響（圖2B和C）。此外，ULK 1敲低H1299細胞中ULK 1 WT表達的恢復重新建立了細胞溶質(zhì)乳酸鹽水平，而ULK1 ΔKI突變體（具有丟失的激酶結(jié)構(gòu)域）的表達未恢復（圖2D）。氨基酸饑餓和mTOR抑制劑Torinl處理降低了細胞溶質(zhì)NADH/NAD+比率，然后氨基酸補充和去除Torinl恢復了NADH/NAD+比率（圖2 E）。此外，LDHA沉默降低了細胞溶質(zhì)乳酸水平，并且LDHAWT和LDHAS196D表達的恢復恢復了細胞溶質(zhì)乳酸水平，而LDHAS196A表達未能挽救LDHA酶活性（圖F和G）。這些表型通過體外測量酶活性和體內(nèi)進行流式細胞術(shù)來證實（圖2 H）。此外，通過草氨酸鹽或shRNA抑制LDHA酶活性和通過MRT 68921抑制ULK1活性降低了在EBSS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中的胞質(zhì)乳酸鹽水平（圖2 I）。這些結(jié)果表明ULK1介導LDHA磷酸化并增強其酶活性。


圖2：LDHA磷酸化增強其酶活性

3.Vps34通過乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP60在K356和K781處被乳?；?/strong>

       為了驗證乳酰化在自噬調(diào)節(jié)中的作用，測量了哺乳動物自噬核心蛋白的乳糖化的免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡與抗泛-乳糖化抗體。發(fā)現(xiàn)許多在不同自噬階段的乳?；允珊诵牡鞍祝╒ps 34、ULK 1、UVRAG等）在細胞內(nèi)表達（圖3A和B）。同時，發(fā)現(xiàn)在LDHA敲低細胞中Vps 34乳?；浇档停▓D3C）和LDHA抑制劑草氨酸鹽處理的細胞，但乳酸鹽、A-7669662（AMPK激活劑）或魚藤酮處理的細胞中增加（圖3D）。為了鑒定Vps 34乳酰化位點，在免疫沉淀后從用IOmM乳酸鹽處理24小時的人胚腎（HEK）293 T細胞中純化Vps 34-Flag，并通過質(zhì)譜分析，并鑒定了兩個賴氨酸殘基（K356和K781）。為了驗證這兩個乳?；稽c，通過定點誘變將兩個賴氨酸殘基改變?yōu)榫彼釟埢?，并將這些突變體轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。Vps34K356R和Vps34K781R的乳?；斤@著降低，并且雙突變體Vps342KR的乳?；奖幌▓D3E）。為了鑒定Vps 34乳?；瘯鴮懻?，構(gòu)建乙酰轉(zhuǎn)移酶shRNA文庫，并通過免疫共沉淀和用抗泛乳?；贵w的蛋白質(zhì)印跡法測定Vps 34乳?；健Ｇ玫蚄AT5/TIP60表達減弱了Vps34的乳?；?，但沒有其他乙酰轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮這種作用（圖3F）。為了鑒定與Vps 34相互作用的蛋白質(zhì)，用二硫代雙溶液（DSP）處理過表達Vps 34-Flag的細胞以誘導交聯(lián)。Vps 34-Flag相互作用蛋白通過免疫共沉淀被拉下，然后通過質(zhì)譜法鑒定。除了PI3KC3亞基Beclinl、UVRAG、Atgl 4、Pacer和Rubicon之外，Vps 34還與TIP60和p300相互作用（圖3G）。內(nèi)源性和外源性免疫沉淀實驗證實了Vps34與TIP60相互作用，并且EBSS饑餓促進了Vps34和TIP60的相互作用（圖3H）。通過TIP60抑制劑MG149或TIP60激酶GSK3抑制劑SB216763抑制TIP60活性降低了Vps34乳?；?，并且通過氨基酸或血清剝奪增強TIP60活性增加了Vps34乳?；剑▓D3I）。同樣地，用野生型TIP60處理在TIP60敲低的HEK293T細胞中重新建立了Vps34乳?；南抡{(diào)，但是功能喪失突變體TIP60S86A未能挽救已經(jīng)被TIP60敲低的HEK293T細胞中已經(jīng)降低的Vps34乳酰化（圖3J）。體外乳酰化測定顯示TIP60通過泛-Kla抗體和通過質(zhì)譜法使Vps 34 K356和K781乳?；▓D3K）。這些結(jié)果表明，TIP 60介導Vps 34乳?；?。


圖3：Vps34通過乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP60在K356和K781處被乳?；?/span>

4.Vps34乳酰化正調(diào)控其與UVRAG和Beclin1的相互作用以及脂質(zhì)激酶活性

       為探討Vps 34乳?；纳飳W功能，采用免疫沉淀和Western blot分析Vps 34與Vps15、Beclin1、ATG14L和UVRAG的相互作用。通過shRNA介導的LDHA敲低降低Vps 34乳?；瘬p害了Vps34與Beclinl、ATG14L和UVRAG的結(jié)合，并且功能喪失突變體LDHAS196A未能挽救Vps34與LDHA敲低細胞中這些亞基的結(jié)合，這與野生型LDHA處理的效果相反（圖4A）。Vps 34 K356R和Vps 34 K781R突變體分別使Vps 34-Beclin1-ATG14L復合物（I）和Vps34-Beclin1-UVRAG復合物（II）不穩(wěn)定，而Vps 342KR突變體在兩個乳?；稽c處具有取代，降低了Vps 34與Beclin1、ATG14L和UVRAG在正常培養(yǎng)基和EBSS培養(yǎng)基中的結(jié)合（圖4B和C）。此外，高乳酸鹽處理促進了Vps34WT與Beclin1、ATG14L和UVRAG的結(jié)合，而不是Vps342KR的結(jié)合（圖4D）。此外，與對照細胞相比，當在正?；駿BSS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中Vps 34乳?；瘜懭肫鱇AT5/TIP60被敲低時，Vps34與Beclin1、ATG14L和UVRAG的結(jié)合減少（圖4 E）。結(jié)果表明，Vps 34乳?；龠M了Vps 34與Beclin 1、ATG 14 L和UVRAG的結(jié)合。在Vps 34沉默的細胞中轉(zhuǎn)染Vps 34 WT完全恢復了Vps 34敲低的作用，而轉(zhuǎn)染Vps342KR僅部分逆轉(zhuǎn)了這些作用（圖4F和G）。同樣地，在饑餓條件下，與對照細胞中相比，Vps34沉默減少了GFP-DFCPl斑點的數(shù)目，Vps 34沉默的細胞中恢復Vps 34 WT表達完全儲存了GFPDFCPl斑點的數(shù)目，并且Vps 342 KR表達僅部分逆轉(zhuǎn)了這些效應（圖4H）。體內(nèi)和體外ELISA結(jié)果顯示Vps 34脫?；糠謸p害Vps34脂質(zhì)激酶活性（圖4J和K）?？傊@些結(jié)果表明，乳糖化通過增強Vps34與Beclin1、ATG14L和UVRAG的結(jié)合來促進Vps 34脂質(zhì)激酶活性。


圖4：Vps34乳?；{(diào)控其與UVRAG和Beclin1的相互作用以及脂質(zhì)激酶活性

5.Vps34乳酰化促進自噬體的形成和成熟

       為了分析Vps 34乳?；瘜ψ允赏康挠绊?，通過蛋白質(zhì)印跡分析p62降解。Vps 342KR部分地抑制p62降解，與Vps 34 WT在正常培養(yǎng)基中和EBSS饑餓條件下在細胞水平上的作用相反（圖5A）。用GFP-LC 3切割測定法驗證乳酸和Vps 34乳?；瘜ψ允赏康纳飳W功能。Vps 34敲低的HEK293 T細胞中的GFP-LC 3切割在正常培養(yǎng)基和EBSS培養(yǎng)基中受到抑制，并且Vps 34 WT表達的恢復促進了GFP-LC3切割，并且Vps 342KR的再表達僅部分逆轉(zhuǎn)了這些效應（圖5 B）。此外，Vps 34敲低的HEK 293T細胞中的GFP-LC 3切割在正常培養(yǎng)基和EBSS培養(yǎng)基中受到抑制，并且Vps 34 WT表達的恢復促進了GFP-LC 3切割，并且Vps 342KR的再表達僅部分逆轉(zhuǎn)了這些效應（圖5 B）。這些結(jié)果通過內(nèi)源性LC 3斑點測定進一步證實（圖5C和D）。此外，透射電子顯微鏡測定顯示，與正常培養(yǎng)基和EBSS誘導的饑餓條件下培養(yǎng)的對照細胞相比，Vps 34敲低的H1299細胞中自噬囊泡的數(shù)量減少，Vps34 WT表達逆轉(zhuǎn)了自噬囊泡的數(shù)量減少，而Vps 342KR部分恢復了囊泡的數(shù)量（圖5E和F）。這些結(jié)果表明，Vps 34乳?；亲允审w形成和成熟所必需的。


圖5：5.Vps34乳酰化促進自噬體的形成和成熟


6.Vps 34乳?；龠M內(nèi)體-溶酶體降解

       為了確定Vps34乳酰化是否調(diào)節(jié)這種表型，在Vps34敲低的U2OS中表達了Vps34WT和Vps342KR。免疫熒光顯微鏡顯示用Vps34WT重建校正了擴大的內(nèi)體積累的表型，并且Vps342KR部分挽救了內(nèi)體積累（圖6A）。通過Western印跡分析分析乳酸鹽介導的Vps34乳酸化是否調(diào)節(jié)EGFR降解、內(nèi)源性EGFR降解。在Vps34敲低細胞中轉(zhuǎn)染Vps34WT完全促進EGFR降解，而Vps342KR轉(zhuǎn)染僅部分恢復EGFR降解（圖6B）。晚期核內(nèi)體標志物Rab7和LysoTracker red的共定位顯示Vps34敲低阻斷了晚期核內(nèi)體和預先存在的溶酶體的融合，Vps34WT的再表達挽救了這種表型而不是Vps342KR（圖6E和F）。由于不充分的內(nèi)溶酶體融合，我發(fā)現(xiàn)Lampl表達通過免疫熒光染色和Western印跡在Vps34敲低的U2OS中增加，但Vps34WT恢復了這種表型，并且Vps34脫酰化突變體失去了這種功能（圖6G和H）。這些結(jié)果表明，Vps34乳糖化位點的突變體損害了其生物學功能，導致溶酶體降解不足。


圖6：Vps34乳?；龠M內(nèi)體-溶酶體降解。


    7.Vps34的乳?；诠趋兰?nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用

             為了評估Vps34乳?；纳砉δ?，構(gòu)建了強迫游泳小鼠模型，發(fā)現(xiàn)游泳3h不影響總AMPKα、總ULK1、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達水平游泳誘導AMPKα（Thr172）、總mTOR、ULK1（Ser555）、LDHA（Ser196）的上調(diào)和mTOR（Ser2448）和ULK1（Ser757）的下調(diào)（圖7A和B）。此外，運動誘導小鼠肌肉組織中的乳酸產(chǎn)生，并且該增加被草胺鹽處理部分地減少（圖7B）。骨骼肌生物化學的評估顯示，游泳誘導細胞自噬，如通過p62降解的測量和LC3斑點測定所確定的，并且值得注意的是，這些表型的獲得被草胺鹽處理部分抑制（圖7C-F）。游泳促進Vps34乳糖化并增加PtdIns（3）P水平，并且這些表型被草胺鹽處理部分抑制（圖7C，D和G）。這些結(jié)果表明，通過ULK1-LDHA途徑的乳酸鹽介導的Vps34乳酸化是骨骼肌穩(wěn)態(tài)所需的。為了獲得Vps34乳?；瘏⑴c體內(nèi)自噬和骨骼肌穩(wěn)態(tài)的進一步證據(jù)，通過肌內(nèi)注射用對照病毒rAAV-Vps34 WT或rAAV-Vps342KR（1 × 1011 CFU）處理小鼠。病毒注射4周后，每組半數(shù)小鼠進行3小時的急性游泳運動。結(jié)果顯示，在肌肉中施用Vps 34 WT比對照增強了靜息狀態(tài)和游泳狀態(tài)下的自噬水平，但施用Vps 342KR通過p62降解和LC3轉(zhuǎn)換比Vps 34WT部分地損害肌肉自噬水平（圖7H）。透射電子顯微鏡分析顯示，Vps34WT過表達促進小鼠肌細胞在靜息狀態(tài)和游泳狀態(tài)下自噬空泡的形成，但Vps342KR降低其作用（圖7I和J）。這些結(jié)果表明Vps34乳?；枪趋兰〖毎允珊图毎€(wěn)態(tài)所必需的。


      圖7：Vps34的乳?；诠趋兰?nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用


      8.Vps34乳糖化與癌癥進展相關(guān)

             為了獲得Vps34乳?；牟±韺W功能，分析了人肺癌和胃癌中乳酸和Vps34乳酰化水平之間的關(guān)系。與鄰近組織相比，人肺癌和胃癌中乳酸水平升高（圖8A和E）。此外，與鄰近組織相比，人肺癌和胃癌組織中Vps34乳?；潭仍黾?，并且這種乳?；黾影殡S著LDHA表達的上調(diào)和自噬通量的增加（圖8B，C，F(xiàn)和G）。此外，與鄰近組織相比，人肺癌和胃癌組織中的Vps34激酶活性增強，如用體外PtdIns（3）P水平測定所測定的（圖8D和H）。結(jié)果表明，乳酸通過Vps34乳?；{(diào)節(jié)腫瘤組織中的自噬活性，并與癌癥進展相關(guān)。


      圖8：Vps34乳糖化與癌癥進展相關(guān)


      結(jié)論
             總之，這些結(jié)果表明，絲氨酸/蘇氨酸激酶ULK1通過磷酸化LDHA在S196，以增強LDHA活性和促進乳酸的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)糖酵解途徑。乳酸介導的Vps34乳酰化促進其脂質(zhì)激酶活性以促進細胞自噬和內(nèi)溶酶體降解。Vps34乳糖化通過調(diào)節(jié)細胞自噬在運動和腫瘤進展期間的骨骼肌穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。本研究描述了自噬調(diào)控機制，整合了兩個高度保守的生命過程（糖酵解和自噬）。

      實驗方法
      收集臨床樣本，游泳訓練動物模型，免疫印跡分析，免疫熒光實驗，質(zhì)譜分析，透射電鏡，自噬分析，LDHA酶測定實驗，體外乳?；瘻y定，Vps34激酶測定，PtdIns（3）P ELISA測定，酶標儀檢測活細胞中的乳酸鹽和NADH/NAD+，流式細胞儀測定活細胞中的乳酸和NADH/NAD+，PAS染色，PCR
      參考文獻
      Jia, M., Yue, X., Sun, W., Zhou, Q., Chang, C., Gong, W., Feng, J., Li, X., Zhan, R., Mo, K., Zhang, L., Qian, Y., Sun, Y., Wang, A., Zou, Y., Chen, W., Li, Y., Huang, L., Yang, Y., Zhao, Y., … Cheng, X. (2023). ULK1-mediated metabolic reprogramming regulates Vps34 lipid kinase activity by its lactylation. Science advances, 9(22), eadg4993. https://doi.org/10.1126/sciadv.adg4993