食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)生過(guò)程由正常上皮細(xì)胞向上皮內(nèi)瘤變,最后向浸潤(rùn)性癌轉(zhuǎn)變。然而,癌前病變?nèi)绾芜M(jìn)展為癌仍然是一個(gè)謎。本研究報(bào)告了一個(gè)全面的細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組研究79個(gè)多階段食管病變29例食管鱗癌患者。研究揭示了ANXA 1表達(dá)在上皮細(xì)胞中的逐漸和顯著的損失,是由于其轉(zhuǎn)錄因子KLF 4沿著病變進(jìn)展。本研究于2023年5月發(fā)表于《Cancer Cell》上,IF=50.3 。
技術(shù)路線
主要研究?jī)?nèi)容
1.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析解讀多階段食管鱗癌腫瘤發(fā)生中的不同細(xì)胞類型
對(duì)79個(gè)手術(shù)取出的食管樣品進(jìn)行scRNA-seq,包括45個(gè)NOR、9個(gè)LGIN、9個(gè)HGIN和來(lái)自29名ESCC患者的16個(gè)腫瘤(圖1A)?;趫D的聚類和典型細(xì)胞標(biāo)記注釋揭示了七種主要的細(xì)胞類型,即,上皮細(xì)胞(n = 5,218)、成纖維細(xì)胞(n = 28,530)、內(nèi)皮細(xì)胞(n = 14,388)、T細(xì)胞(n = 63,332)、B細(xì)胞(n = 38,220)、骨髓細(xì)胞(n = 21,627)和肥大細(xì)胞(n = 5,177),這些細(xì)胞類型的組成在不同的疾病階段不同(圖1B)。發(fā)現(xiàn)>25%的NOR和LGIN階段的上皮細(xì)胞高度表達(dá)MD程序,而該細(xì)胞亞型的比例在HGIN和ESCC階段降低至<6%,表明MD程序在保持食管上皮細(xì)胞的正常表型中起重要作用(圖1C)。超過(guò)95%的NOR和LGIN階段的成纖維細(xì)胞被鑒定為NF。CAF出現(xiàn)在HGIN階段,占ESCC中總成纖維細(xì)胞的63%(圖1D)。以表達(dá)IGFBP 3(Endo-IGFBP 3)為特征的內(nèi)皮細(xì)胞亞型在ESCC中增加至50%,但僅分別占NOR、LGIN和HGIN階段的總內(nèi)皮細(xì)胞的近25%(圖1 E)。如預(yù)期的,在ESCC腫瘤發(fā)生期間的不同階段,五種免疫細(xì)胞類型B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的比例變化(圖1F)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然B細(xì)胞比例由NOR的27%下降到ESCC的16%,但LGIN和HGIN的B細(xì)胞比例增加,分別為43.2%和47.0%;雖然ESCC中CD 8 + T細(xì)胞比例(51.3%)明顯高于NOR(26.7%),但NOR、LGIN(26.1%)和HGIN(24.3%)的比例相似。這些結(jié)果提示,食管鱗癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞數(shù)量的變化可能是食管鱗癌發(fā)生的晚期事件。
圖1:?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析解讀多階段食管鱗癌腫瘤發(fā)生中的不同細(xì)胞類型
2.食管鱗癌發(fā)生過(guò)程中ANXA1在上皮細(xì)胞中的表達(dá)逐漸受到抑制
進(jìn)一步探索了不同疾病階段上皮細(xì)胞的組成和轉(zhuǎn)錄改變。分析的上皮細(xì)胞(n = 5,218)由來(lái)自NOR的1,002個(gè)細(xì)胞、來(lái)自LGIN的205個(gè)細(xì)胞、來(lái)自HGIN的1,097個(gè)細(xì)胞和來(lái)自ESCC的2,914個(gè)細(xì)胞組成(圖2A)。無(wú)監(jiān)督聚類分析揭示了在ESCC發(fā)展期間以不同表達(dá)程序?yàn)樘卣鞯陌朔N不同上皮細(xì)胞類型(圖1C、2A和S2 A;表S2)。具有四種表達(dá)程序的上皮細(xì)胞,即,QP、CY、MD和TD占正常上皮細(xì)胞的88.1%(883/1,002);然而,在ESCC腫瘤中表達(dá)這些程序的細(xì)胞的百分比下降到43.1%(2,914個(gè)中的1,256個(gè))(圖2A)。相比之下,在ESCC發(fā)展過(guò)程中,表達(dá)其他四種癌癥相關(guān)程序(包括HY、RS、DO和AP)的上皮細(xì)胞的比例從9.8%增加到56.9%(圖2A和2B)。計(jì)算了程序標(biāo)記基因的平均表達(dá)的Z評(píng)分,并且結(jié)果還顯示與NOR相比,HGIN(p = 1.45×10-58)和ESCC(p = 1.94 ×10-105)中MD程序的顯著降低(圖2B)。選擇了ANXA 1進(jìn)行驗(yàn)證和深入分析,發(fā)現(xiàn)ANXA 1表達(dá)水平從NOR逐漸降低到LGIN、HGIN和ESCC(圖2C,趨勢(shì)檢驗(yàn),p = 4.45×10-80),這通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析證實(shí),顯示位于上皮中的ANXA 1 RNA水平與NOR(分別為p = 3.80×10-161和p<10-308)或LGIN(分別為p=2.14×10-114和p=4.84×10-187)相比顯著降低,趨勢(shì)檢驗(yàn)P為6.57 ×10-17(圖2D和2 E)。還對(duì)不同疾病分期的組織進(jìn)行了ANXA 1免疫組化染色,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),與NOR組織相比,ANXA 1在癌前和ESCC部位的蛋白水平顯著下調(diào)(p=7.41×10-3,p=9.69×10-4和p = 3.52×10-6;趨勢(shì)檢驗(yàn),p= 7.36×10-15;圖2F)。這些結(jié)果有力地表明,食管特異性蛋白ANXA 1的功能喪失可能是ESCC腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件。
圖2:食管鱗癌發(fā)生過(guò)程中上皮細(xì)胞ANXA1表達(dá)的逐漸抑制
3.上皮細(xì)胞中ANXA1抑制促進(jìn)NFs向CAFs的轉(zhuǎn)化
鑒定了表達(dá)SLPI(NF-SLPI)、CCN 2(NF-CCN 2)或APOE(NF-APOE)標(biāo)志物基因的三種NF,以及兩種CAF類型,即:基于已知的CAF標(biāo)志物基因,可以鑒定炎性CAF(iCAF)和成肌纖維細(xì)胞CAF(myCAF)(圖3A)。iCAF顯示活性趨化因子產(chǎn)生途徑,具有高表達(dá)水平的諸如IL 24和CXCL 18的基因,而myCAF具有高表達(dá)水平的與ECM重塑和降解相關(guān)的基因,諸如MMPl和MMPll(圖3B和3C)。然后,構(gòu)建了成纖維細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的軌跡,結(jié)果顯示CAF活化軌跡從NF-SLPI亞型開始,通過(guò)NF-CCN 2到iCAF和最終的myCAF,而NF-APOE通過(guò)次要軌跡被活化為NF子集(圖3D)。沿著該軌跡,一致地鑒定了在NF中活化的途徑在起始點(diǎn)富集,而膠原蛋白三聚體中的CAF相關(guān)基因(即,CAF相關(guān)基因)在起始點(diǎn)富集。COL 1A 1和CTHRC 1)、炎癥(即,CXCL 1、CXCL 8和IL 24)和ECM重塑(即,F(xiàn)AP、MMPl和MMPll)在成纖維細(xì)胞活化的晚期富集(圖3E)。提示在食管鱗癌的形成和發(fā)展過(guò)程中,早在HGIN甚至LGIN階段,微環(huán)境中的NF就被激活為CAFs。計(jì)算成纖維細(xì)胞標(biāo)志物基因在NFS和CAF中的表達(dá)分?jǐn)?shù)以量化其生物學(xué)功能,并與上皮細(xì)胞表達(dá)程序分?jǐn)?shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明,在8種上皮細(xì)胞方案中,只有MD方案的評(píng)分與NF簽名評(píng)分顯著正相關(guān)(r=0.29,p=0.014),而與ICAF(r=-0.24,p=0.041)和myCAF0.27(r=-0.27,p=0.022)簽名評(píng)分顯著負(fù)相關(guān)(圖3F)??臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了ANXA 1與NF活性呈負(fù)相關(guān),與CAF活性呈負(fù)相關(guān)。具體地,揭示了隨著上皮中ANXA 1 RNA水平從LGIN/HGIN到ESCC降低,固有層和粘膜下層中的NF特征評(píng)分也顯著降低;然而,當(dāng)ANXA 1表達(dá)在ESCC發(fā)展期間被抑制時(shí),iCAF和myCAF特征評(píng)分顯著增加(圖3 H和3 I)。這些結(jié)果表明,食管上皮細(xì)胞分泌的ANXA 1可能通過(guò)上皮細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的相互作用在調(diào)控微環(huán)境NF中發(fā)揮重要作用,上皮細(xì)胞ANXA 1功能的缺失可能導(dǎo)致NF向CAF轉(zhuǎn)化。
圖3:上皮細(xì)胞中的ANXA 1抑制促進(jìn)NF轉(zhuǎn)化為CAFs
4.上皮ANXA1抑制促進(jìn)myCAF在體外和體內(nèi)的活化
分別從5例ESCC患者的NOR、LGIN、HGIN和ESCC組織中獲得食管類器官和成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的免疫熒光染色和類器官及其相應(yīng)組織的組織病理學(xué)表征以及選擇標(biāo)志物的免疫化學(xué)染色的圖像示于圖4A。食管組織的免疫熒光分析還顯示,上皮細(xì)胞和ECM中的ANXA 1水平被抑制,同時(shí)HGIN和ESCC組織中周圍基質(zhì)中的FAP(CAF活化標(biāo)志物)水平顯著增加(圖4 B),進(jìn)一步證實(shí)了兩種細(xì)胞類型之間的相關(guān)性和潛在的相互作用。然后建立了ANXA 1缺失或過(guò)表達(dá)的ESCC和正常食管上皮細(xì)胞系(OE;圖4C),并將它們與NF共培養(yǎng)。結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞共培養(yǎng)的那些相比,NF在與ANXA 1耗盡的ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)具有顯著更高的迀移能力,但在與ANXA 1-OE ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)具有顯著更低的迀移能力(圖4D)。與相應(yīng)的對(duì)照相比,myCAF活化標(biāo)志物在與ANXA 1敲除(KO)細(xì)胞共培養(yǎng)的NF中顯示一致的上調(diào),但在與ANXA 1-OE細(xì)胞共培養(yǎng)的NF中顯示一致的下調(diào)。然而,在這些體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境中,未檢測(cè)到iCAF相關(guān)標(biāo)志物變化(圖4 E)。此外,將重組人ANXA 1蛋白(rANXA 1)添加到NF和ESCC的共培養(yǎng)物中以劑量依賴性方式基本上抑制myCAF活化,并且該效果與與具有強(qiáng)制ANXA 1過(guò)表達(dá)的ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)的效果相同(圖4F)。接下來(lái)檢測(cè)ECSS細(xì)胞中ANXA1表達(dá)的變化是否會(huì)影響與或不與從食管組織樣本中分離的NF共移植的小鼠腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)速率。如圖4G所示,與僅來(lái)源于ESCC細(xì)胞的異種移植物相比,來(lái)源于KYSE30細(xì)胞加NF的異種移植物具有顯著增加的生長(zhǎng)速率,表明CAF可以促進(jìn)ESCC進(jìn)展。
圖4:上皮ANXA1抑制促進(jìn)myCAF在體內(nèi)外的活化
5.ANXA1缺失通過(guò)減弱其與FPR2的相互作用促進(jìn)myCAF活化
通過(guò)使用相互免疫共沉淀分析來(lái)檢查結(jié)合是否是通過(guò)FPR,如果是,則哪個(gè)FPR家族成員是ANXA1靶標(biāo),結(jié)果顯示ANXA1特異性結(jié)合FPR2,而不是其他兩個(gè)FPR成員(圖5A和B)。這種配體-受體相互作用進(jìn)一步得到免疫熒光測(cè)定的支持,所述免疫熒光測(cè)定顯示rANXAl和FPR 2在NF和CAF細(xì)胞膜中的共定位(圖5C)。還觀察了ANXA 1-FPR2結(jié)合破壞后NF向myCAF轉(zhuǎn)化的功能改變,并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)FPR 2敲低NF與ANXA 1-OE ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),myCAF活化標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著增加(圖5D),表明ANXA 1通過(guò)NF中與FPR 2的配體-受體相互作用對(duì)NF向myCAF轉(zhuǎn)化的控制作用。進(jìn)一步檢查了抑制NF向myCAF轉(zhuǎn)化的ANXA 1FRP 2信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)子,并且發(fā)現(xiàn)ANXA 1-FPR 2相互作用強(qiáng)烈抑制AKT、ERK和SMAD 3的磷酸化,這伴隨著myCAF標(biāo)志物FAP、Vim、MMP 1和a-SMA的水平顯著降低(圖5E)。當(dāng)用rANXAl或ERK(SCH 772984)、AKT(MK-2206)和SMAD 3(SIS 3)的抑制劑處理NF時(shí),也觀察到這些類似的變化(圖5 F)。盡管ANXAl和TGF-b作用的下游分子模塊可能相似,但TGF-b對(duì)NF轉(zhuǎn)化為myCAF的作用不依賴于FPR 2(圖5E)。這些結(jié)果表明正?;虬┬陨掀ぜ?xì)胞與NF或CAF之間的實(shí)質(zhì)性相互作用。最后,檢查了ANXA 1在由致癌物4-NQO誘導(dǎo)的小鼠ESCC模型中抑制ESCC發(fā)展和進(jìn)展的潛在功能。我們向小鼠施用Ac2 -26(一種結(jié)合FPR受體的ANXA 1模擬肽)持續(xù)5周,并發(fā)現(xiàn)與用媒介物處理的對(duì)照小鼠相比,Ac 2 -26處理組中癌前病變和腫瘤的負(fù)擔(dān)顯著降低(圖5G)。這些體內(nèi)結(jié)果進(jìn)一步支持ANXA 1在抑制ESCC中的重要作用。
圖5:ANXA1缺失通過(guò)減弱其與FPR2的相互作用促進(jìn)myCAF活化
6.ANXA1功能的喪失是由其轉(zhuǎn)錄因子KLF4的抑制引起的
使用四個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬分析,得到了ANXA 1的11個(gè)候選TF。然后,分析了scRNA-seq數(shù)據(jù)中這些TF的表達(dá)水平與ANXA 1之間的相關(guān)性,結(jié)果表明四種潛在的TF,KLF 4、KLF 5、CEBPB和FOXA 1,與ANXA 1 RNA水平顯著正相關(guān)(r > 0.3,p < 0.05;圖6A)。通過(guò)scRNA-seq和免疫化學(xué)染色,我們發(fā)現(xiàn)與NOR相比,從LGIN、HGIN到ESCC,KLF4 RNA和蛋白質(zhì)水平均顯著 降低(圖6 B和6C)。ANXA 1 RNA和KLF 4 RNA水平之間存在顯著正相關(guān)(r = 0.39,p = 5.4×10-5;圖6D)。HET-1A和KYSE 450細(xì)胞中的基因敲低測(cè)定顯示,在四種TF中,僅靶向KFL 4的小干擾RNA(siRNA)顯著抑制ANXA 1表達(dá)(圖6 E)。電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定證實(shí)KLF 4特異性結(jié)合ANXA 1啟動(dòng)子序列,其可被抗KLF4的抗體消除(圖6 F)。染色質(zhì)免疫沉淀與定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定偶聯(lián)顯示ANXA 1被KLF4抗體顯著富集,并且結(jié)果在HET-1A、KYSE 450和KYSE 30細(xì)胞中是一致的(圖6 G)??傊@些生化結(jié)果證明KLF 4是一種真正的TF,它能正向調(diào)節(jié)食管上皮細(xì)胞中ANXA 1的表達(dá)。最終證明了KLF 4調(diào)節(jié)ANXA 1轉(zhuǎn)錄,這連接到NFs向CAFs的轉(zhuǎn)化。為此,進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn),以探討KLF 4表達(dá)狀態(tài)對(duì)CAF遷移和激活的影響。結(jié)果顯示,沉默KLF 4顯著增強(qiáng)CAF活化和迀移,而恢復(fù)ANXA 1(通過(guò)向共培養(yǎng)基中添加rANXA 1)可以顯著抑制由KLF 4抑制引起的CAF活化和迀移(圖6 H和6I)。這些結(jié)果支持KLF4調(diào)控ANXA1的轉(zhuǎn)錄,ANXA1調(diào)控NF向myCAF的轉(zhuǎn)化。我們還在正常食管樣品中進(jìn)行了KLF4和ANXA1蛋白的免疫熒光染色,結(jié)果顯示這兩種分子共定位且正相關(guān)(圖6J)。
圖6:ANXA1缺失是由其轉(zhuǎn)錄因子KLF4的抑制引起的
結(jié)論
總之,本研究通過(guò)利用來(lái)自同一個(gè)ESCC個(gè)體的NOR、LGIN、HGIN和癌標(biāo)本,并使用整合的scRNA-seq、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、功能測(cè)定和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了ESCC從其癌前病變通過(guò)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的異常串?dāng)_的進(jìn)展的重要機(jī)制。本研究結(jié)果可能對(duì)了解癌癥的發(fā)展和ESCC的預(yù)防和臨床治療具有深遠(yuǎn)的意義。
實(shí)驗(yàn)方法
收集臨床樣本,單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,軌跡分析,基因集變異分析,空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, ANXA 1表達(dá)改變的細(xì)胞系的建立,基因表達(dá)的RNA干擾, Co-培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),成纖維細(xì)胞遷移測(cè)定,小鼠異種移植實(shí)驗(yàn),小鼠原代ESCC模型和Ac 2 -26治療,定量實(shí)時(shí)PCR分析,蛋白質(zhì)印跡測(cè)定,免疫組織化學(xué)和多重免疫熒光分析,免疫熒光分析,免疫沉淀測(cè)定,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定,電泳遷移率轉(zhuǎn)移試驗(yàn),報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建和報(bào)告試驗(yàn),染色質(zhì)免疫沉淀偶聯(lián)定量PCR分析。
參考文獻(xiàn)
Chen, Y., Zhu, S., Liu, T., Zhang, S., Lu, J., Fan, W., Lin, L., Xiang, T., Yang, J., Zhao, X., Xi, Y., Ma, Y., Cheng, G., Lin, D., & Wu, C. (2023). Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer cell, 41(5), 903–918.e8. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.03.001