FABP5通過降低FASN表達調(diào)控mTOR介導(dǎo)的自噬抑制結(jié)腸癌進展

       脂質(zhì)代謝在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。在本研究中，作者研究了脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）在結(jié)直腸癌（CRC）中的作用。首先，他們觀察到CRC中FABP5顯著下調(diào)，F(xiàn)ABP5對細胞增殖、克隆形成、體內(nèi)遷移、侵襲以及腫瘤生長有抑制作用。FABP5與脂肪酸合酶（FASN）相互作用，激活泛素蛋白酶體通路，導(dǎo)致FASN表達和脂質(zhì)積累降低，抑制mTOR信號傳導(dǎo)，促進細胞自噬。奧利司他是一種FASN抑制劑，在體內(nèi)和體外均具有抗癌作用。此外，上游RNA去甲基化酶ALKBH5通過m6A非依賴性機制正向調(diào)控FABP5表達。該研究于2023年6月發(fā)表在《International Journal of Biological Sciences》，IF：9.2。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. CRC中FABP5下調(diào)
       FABP5在腎透明細胞癌和肝癌中過表達，而在肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌中下調(diào)（圖1A）。此外，腫瘤中FABP5 mRNA水平低于對照組織，但差異不顯著（圖1B）。生存分析數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)ABP5水平較高的患者預(yù)后更好（圖1C）。作者最初創(chuàng)建了由90個CRC和腫瘤周圍組織組成的腫瘤微陣列。其結(jié)果顯示FABP5在CRC中顯著下調(diào)（圖1E-1F）。

圖1：CRC中FABP5沉默

2. FABP5過表達與CRC細胞增殖、遷移和侵襲減少有關(guān)
       為明確FABP5是否在CRC中發(fā)揮腫瘤抑制作用，作者通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染產(chǎn)生穩(wěn)定過表達FABP5的HCT116和SW620細胞系。WB結(jié)果驗證了FABP5過表達的效率（圖2A）。在CCK-8和EdU實驗中，F(xiàn)ABP5上調(diào)伴隨著細胞增殖的抑制（圖2B-2C；2F-2G）。此外，過表達FABP5的HCT116和SW620細胞克隆數(shù)量減少（圖2D-2E）。在transwell實驗中，F(xiàn)ABP5上調(diào)抑制細胞遷移和侵襲（圖2H-2J）?？傊?，F(xiàn)ABP5在CRC中具有抗癌作用。

圖2：FABP5過表達抑制細胞增殖、遷移和侵襲

3. 敲低FABP5促進CRC細胞增殖、遷移和入侵
       為進一步探索FABP5在結(jié)直腸癌中的抗癌功能，作者在HCT116 和 SW620 細胞系中穩(wěn)定敲低FABP5 。WB結(jié)果證實FABP5敲低效果（圖3A）。在CCK-8和EdU實驗中，F(xiàn)ABP5下調(diào)促進細胞增殖（圖3B-3C、3F-3G）?？寺⌒纬蓽y定中，F(xiàn)ABP5抑制增加了HCT116和SW620細胞克隆數(shù)量（圖3D-3E）。transwell結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP5沉默促進HCT116和SW620細胞的遷移和侵襲（圖3H-3J），這些結(jié)果均支持FABP5在CRC細胞中的抑瘤作用。

圖3：FABP5敲除促進CRC細胞惡性生物學(xué)行為。

4. FABP5與FASN相互作用并促進泛素-蛋白酶體通路
       通過免疫沉淀和質(zhì)譜聯(lián)合分析，作者共鑒定出395個與FABP5相互作用的蛋白。在這些互作蛋白中，F(xiàn)ASN引起了作者的注意，它是一種脂肪酸合成酶。而Co-IP則證實FABP5與FASN發(fā)生互作（圖4A）。敲低FABP5導(dǎo)致FASN表達增加，相反，過表達FABP5誘導(dǎo)FASN減少（圖4B）。用CHX處理后，F(xiàn)ASN穩(wěn)定性在FABP5敲低組中增加，而在FABP5過表達組中降低。此外，MG132處理后FASN水平顯著升高（圖4C）。FASN和泛素的Co-IP結(jié)果表明，F(xiàn)ABP5過表達導(dǎo)致泛素與FASN結(jié)合增加（圖4D）。然后，作者通過shRNA或奧利司他抑制FASN。FASN敲低條件下（圖4E），細胞增殖（圖4F，4H）、克隆形成（圖4G）、細胞遷移和侵襲（圖4I）受到抑制。在奧利司他處理組中也觀察到類似的結(jié)果（圖4J-4M）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)ABP5通過刺激泛素-蛋白酶體通路調(diào)節(jié)FASN。

圖4：FABP5與FASN互作發(fā)揮腫瘤抑制作用

5.敲低或抑制FASN抑制由FABP5下調(diào)激活的惡性生物學(xué)行為
       上述結(jié)果表明，F(xiàn)ABP5下調(diào)促進CRC中的惡性生物學(xué)行為。為探討FASN上調(diào)是否介導(dǎo)致癌活性，作者在FABP5下調(diào)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中進行FASN敲低或奧利司他處理。首先，WB檢測到敲低效果（圖5A）。CCK-8、克隆形成和EdU實驗表明，下調(diào)FASN或抑制其活性則抑制了由FABP5敲低促進的細胞增殖（圖5B-5F）。在transwell中，F(xiàn)ASN沉默或抑制逆轉(zhuǎn)了由FABP5下調(diào)誘導(dǎo)的遷移和侵襲增加（圖5G-5H）。尼羅紅染色結(jié)果表明，F(xiàn)ABP5過度表達減少脂質(zhì)積累，而其敲低增加脂質(zhì)積累（圖5I）。FASN耗竭引起FABP5沉默誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累減弱，突出FASN在FABP5調(diào)節(jié)惡性行為中的關(guān)鍵作用（圖5J）。此外，野生型CRC細胞中只有FASN敲除始終導(dǎo)致脂質(zhì)積累減少（圖5K）。這些結(jié)果表明，由FABP5下調(diào)啟動的致癌進展能夠被CRC細胞中抑制FASN而恢復(fù)。

圖5：奧利司他恢復(fù)FABP5下調(diào)誘導(dǎo)的CRC細胞惡性行為

6.FABP5通過FASN介導(dǎo)的mTOR通路失活促進自噬
       作者對FABP5過表達和FASN敲除進行RNA-seq和脂質(zhì)組學(xué)研究。與許多生物學(xué)過程和信號通路相關(guān)的基因發(fā)生失調(diào)，其中包括TGF-β、Hippo、Wnt、NF-κB和mTOR，正如RNA-seq中觀察到的一樣（圖6A）。脂質(zhì)組學(xué)分析表明，F(xiàn)ABP5和FASN通過影響脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)自噬（圖6B，6D）。WB結(jié)果證實，F(xiàn)ABP5上調(diào)促進自噬，而FABP5敲低抑制自噬（圖6E）。此外，F(xiàn)ASN沉默或奧利司他處理挽救了FABP5沉默誘導(dǎo)的自噬抑制（圖6F）。而FABP5過表達抑制mTOR通路，F(xiàn)ABP5敲低激活mTOR通路（圖6G）。FASN沉默和FASN抑制劑處理均使mTOR通路失活（圖6H），這些結(jié)果支持FABP5通過FASN抑制mTOR發(fā)揮腫瘤抑制作用。

圖6：FABP5與FASN互作通過mTOR通路促進細胞自噬

7. FABP5過表達和FASN敲除抑制體內(nèi)腫瘤生長
       作者借助腫瘤異種移植物模型進一步研究FABP5和FASN在體內(nèi)的作用。作者將FABP5過表達或FASN敲低載體、FABP5敲低載體加奧利司他和對照載體轉(zhuǎn)染SW620細胞，然后細胞植入裸鼠當中。注入FABP5過表達和FASN敲低載體的SW620細胞的小鼠異種移植物中，腫瘤重量和體積降低（圖7A-7F）。相反，與對照組相比，具有穩(wěn)定FABP5敲低的SW620細胞顯示出腫瘤生長加速，而對照組被奧利司他抑制（圖7G-7I）。FABP5和FASN的免疫熒光染色表明FABP5在體內(nèi)負向調(diào)節(jié)FASN（圖7I-7J）?？傊?，以上結(jié)果支持體外和體內(nèi)FABP5在FASN介導(dǎo)的CRC進展中發(fā)揮重要作用。

圖7：FABP5通過體內(nèi)調(diào)節(jié)FASN抑制腫瘤生長

8. ALKBH5以m6A獨立方式調(diào)節(jié)FABP5
       接下來，作者重點研究CRC中FABP5下調(diào)機制。m6A預(yù)測服務(wù)器SRAMP揭示FABP5上豐富的m6A修飾位點。敲除m6A閱讀器（METTL3、METTL14、WTAP）和去甲基化酶（FTO和ALKBH5）后，ALKBH5缺失條件下，觀察到FABP5正向調(diào)節(jié)（圖8A、8B）。此外，ALKBH5負向調(diào)節(jié)FASN水平（圖8C-8E）。為探索ALKBH5是否通過FABP5抑制CRC，作者耗竭了ALKBH5過表達細胞中的FABP5（圖8F）。ALKBH5的抗癌作用（包括抑制細胞增殖、遷移和侵襲）通過FABP5沉默部分恢復(fù)，這表明FABP5可能是ALKBH5的下游基因（圖8G-8M）。

圖8：ALKBH5正向調(diào)控FABP5發(fā)揮抗癌作用

結(jié)論
       本研究表明，CRC中FABP5下調(diào)，F(xiàn)ASN被泛素-蛋白酶體抑制所誘導(dǎo)激活，導(dǎo)致CRC通過mTOR信號調(diào)節(jié)自噬。在FABP5缺失條件下，脂質(zhì)積累增加，最終加速CRC進展。作者的研究支持ALKBH5/FABP5/FASN/mTOR軸在CRC進展調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，并為該疾病的治療提供有希望的治療靶點。

實驗方法
細胞培養(yǎng)，real time Qpcr，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，CCK，EdU，細胞遷移與增殖，WB，co-IP，RNA-seq
參考文獻：
Ye M, Hu C, Chen T, Yu P, Chen J, Lu F, Xu L, Zhong Y, Yan L, Kan J, Bai J, Li X, Tian Y, Tang Q. FABP5 suppresses colorectal cancer progression via mTOR-mediated autophagy by decreasing FASN expression. Int J Biol Sci. 2023 Jun 12;19(10):3115-3127. doi: 10.7150/ijbs.85285. PMID: 37416772; PMCID: PMC10321282.