骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞新功能——其胞葬通過(guò)線粒體重塑破壞成骨細(xì)胞分化

       有效清除死亡和瀕死細(xì)胞，即胞葬，對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在骨髓微環(huán)境（BMME）中，這一作用主要由專(zhuān)職骨髓巨噬細(xì)胞完成，但最近的研究表明，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）在BMME中扮演非專(zhuān)職吞噬細(xì)胞的角色。然而，關(guān)于胞葬對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞及其功能的機(jī)制和影響知之甚少。本研究描述了間充質(zhì)干細(xì)胞作為BMME中的非專(zhuān)業(yè)吞噬細(xì)胞的新功能，并證明了間充質(zhì)干細(xì)胞的胞葬作用在指導(dǎo)線粒體重塑和間充質(zhì)干細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用。該研究于2023年7月發(fā)表在《Cell Death & Disease》，IF：9.0。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞參與胞葬

       為研究胞化對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，首先用流式細(xì)胞術(shù)分析ST2細(xì)胞（小鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞系）對(duì)中性粒細(xì)胞的攝取。該檢測(cè)表明，ST2細(xì)胞對(duì)終末期小鼠中性粒細(xì)胞（PMNs）進(jìn)行胞外吞噬（圖1A、B）。通過(guò)顯微鏡檢查證實(shí)ST2主動(dòng)吞噬終末期PMNs，細(xì)胞質(zhì)中遺留的空隙和z-堆棧成像證明了這一點(diǎn)（圖1C、D）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞可以積極參與胞葬，但胞葬后對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞支持正常功能的能力的影響仍有待闡明。

圖1. 間充質(zhì)干細(xì)胞可進(jìn)行胞葬

       為確定MSCs利用的胞漿機(jī)制，對(duì)暴露于過(guò)量人PMNs（1:10）的ST2細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序。在加入PMNs后3和24小時(shí)收集細(xì)胞，根據(jù)目標(biāo)標(biāo)簽的存在通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS）分離（圖2A）。

       主成分分析顯示，早期（3 h）和晚期（24 h）的胞葬細(xì)胞之間以及與非胞葬（對(duì)照）細(xì)胞之間的基因譜存在較大差異（圖2B）。正如預(yù)期的那樣，基于其進(jìn)行胞葬的功能能力，MSCs甚至在胞葬攻擊之前就表達(dá)許多吞噬和胞葬受體和信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄物（圖2C）。值得注意的是，吞噬和胞葬受體在胞葬后3小時(shí)上調(diào)（Axl，Tyro3，Itagv等），而降解凋亡貨物所需的內(nèi)部處理途徑所需的分子轉(zhuǎn)錄物（例如，Elmo1, Elmo2，Dock1，Gulp1）在24小時(shí)上調(diào)（圖2C-E）。骨髓來(lái)源的原代小鼠MSCs也可以吞噬凋亡的胸腺細(xì)胞（圖2F，G）。對(duì)暴露于凋亡胸腺細(xì)胞（SCAT）的原代小鼠骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)ST2細(xì)胞中相同的胞漿途徑（圖2H-J）。這些數(shù)據(jù)確定原代小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的關(guān)鍵胞漿介質(zhì)，并提示無(wú)論凋亡靶點(diǎn)如何，類(lèi)似的機(jī)制都被使用。

圖2. MSCs上調(diào)胞葬受體通路

2. MSCs胞葬誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)

       應(yīng)用基因集富集分析（GSEA）和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的通路分析預(yù)測(cè)胞葬對(duì)MSCs的功能影響。與胞葬行為一致，有轉(zhuǎn)錄證據(jù)表明參與吞噬體和溶酶體的基因增加（圖3A、B）。此外，該分析確定通過(guò)轉(zhuǎn)錄下調(diào)的代謝和生物發(fā)生途徑（圖3C、D）以及參與細(xì)胞衰老和凋亡的基因上調(diào)（圖3E、F）的MSC整體應(yīng)激的證據(jù)。為從功能上證實(shí)通過(guò)通路分析確定的細(xì)胞衰老，測(cè)定胞漿ST2細(xì)胞中β-半乳糖苷酶（β-Gal）和增殖潛能。與非胞葬（PMN-） ST2細(xì)胞相比，胞葬（PMN+） ST2細(xì)胞的β-Gal活性增加（圖3G）。與細(xì)胞衰老增加一致，分選的PMN + ST2細(xì)胞的細(xì)胞復(fù)制減少（圖3H）。因此，這些數(shù)據(jù)表明胞葬誘導(dǎo)MSCs顯著的細(xì)胞應(yīng)激。

圖3. MSCs的胞葬降低代謝基因的表達(dá)，增加應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)

3. 間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞胞葬破壞成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化能力

       為測(cè)試胞葬對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響，用胞葬靶點(diǎn)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。將ST2細(xì)胞以ST2:PMN的比例為1:1,1:2和1:3暴露于PMN中24小時(shí)，在去除未被吞噬的PMN后，將ST2細(xì)胞暴露于成骨誘導(dǎo)或脂肪誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中。盡管在之前的實(shí)驗(yàn)中，24小時(shí)只有一部分ST2細(xì)胞為PMN+（見(jiàn)圖1B），但通過(guò)堿性磷酸酶和Von Kossa染色，與未暴露于PMN的ST2細(xì)胞相比，暴露于PMN的ST2細(xì)胞降低了成骨細(xì)胞分化（圖4A ~ D）。通過(guò)FACS分離PMN+和PMN- ST2細(xì)胞（圖4E）。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，有胞葬細(xì)胞的MSCs （PMN+）的堿性磷酸酶染色減少，而其非胞葬細(xì)胞（PMN -）的MSCs的堿性磷酸酶染色令人驚訝地有小幅但顯著的增加，對(duì)照組也接受未分離的FACS流體（圖4E-G）。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞的胞葬作用在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中誘導(dǎo)細(xì)胞自主缺陷。與成骨的功能缺陷相一致，胞葬后，正性成骨調(diào)節(jié)基因如Osr1、Bmp4、Omd、Igf-1減少，而負(fù)性成骨調(diào)節(jié)基因如Suv39h1增加（圖4H，紅色突出的特定基因）。與成骨抑制相似，胞葬的間充質(zhì)干細(xì)胞如誘導(dǎo)后脂質(zhì)空泡形成減少所示，脂肪細(xì)胞分化減少（圖5A-F）。與脂肪生成中的功能缺陷一致，陽(yáng)性的脂肪生成調(diào)節(jié)基因，如Cebpa, Cebpg, Srebf1和Fosb在胞葬后減少（圖5G，紅色突出顯示的特定基因）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明胞葬作用通過(guò)抑制間充質(zhì)干細(xì)胞分化而破壞間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力，而不是通過(guò)從成骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。

圖4. 終末期中性粒細(xì)胞胞葬破壞成骨細(xì)胞分化

圖5. 終末期中性粒細(xì)胞胞葬破壞脂肪細(xì)胞分化

4. 間充質(zhì)干細(xì)胞的胞葬破壞代謝和線粒體網(wǎng)絡(luò)

       在胞葬MSCs的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的許多通路與代謝失調(diào)相關(guān)（圖3C、D）。測(cè)定氧消耗率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECR），這兩項(xiàng)分別測(cè)定氧化磷酸化和糖酵解。與轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)一致，MSCs的胞葬減少氧化磷酸化（圖6A、B）和糖酵解（圖6C、D）。分選PMN+和PMN- MSCs，并測(cè)定OCR和ECR，發(fā)現(xiàn)在氧耗和糖酵解方面，最劇烈的代謝紊亂出現(xiàn)在胞葬型（PMN+） MSCs中，而非胞葬型（PMN -） MSCs的糖酵解相對(duì)保留（圖6E-H）。這些數(shù)據(jù)表明胞葬顯著改變間充質(zhì)干細(xì)胞的代謝過(guò)程。

圖6. 胞葬MSCs的氧化磷酸化和糖酵解被破壞

5. 抑制線粒體分裂減少胞葬并挽救成骨細(xì)胞分化障礙

       利用ST2 RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集探索線粒體動(dòng)力學(xué)基因和通路，發(fā)現(xiàn)胞葬介導(dǎo)的基因動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)與線粒體分裂和融合有關(guān)。在胞葬過(guò)程的早期（3小時(shí)），間充質(zhì)干細(xì)胞上調(diào)融合基因，如Mfn2和Opa1（圖7A，藍(lán)色標(biāo)記），然而隨著胞葬過(guò)程的進(jìn)行（24小時(shí)），間充質(zhì)干細(xì)胞上調(diào)分裂基因，如Fis1和Dmnl1（圖7A，紅色標(biāo)記）。這些數(shù)據(jù)表明，MSCs在進(jìn)行胞葬后，從線粒體融合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉至褷顟B(tài)。為證實(shí)胞葬MSCs的線粒體重塑，使用MitoTracker Red或TMRE標(biāo)記對(duì)照組和PMN+ MSCs的線粒體，并分別評(píng)估線粒體長(zhǎng)度和膜電位。發(fā)現(xiàn)胞葬MSCs的線粒體長(zhǎng)度（圖7B、C）和TMRE信號(hào)（圖7D）降低，與線粒體發(fā)生分裂相一致。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，由于胞葬，MSCs的氧化功能降低，線粒體發(fā)生重塑，這與線粒體發(fā)生分裂的情況一致。

       測(cè)試從人骨髓分離的MSCs是具有胞漿功能。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）表現(xiàn)出與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的胞葬率（圖7E、F）。與對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響相似，胞葬也抑制hMSCs向成骨細(xì)胞的分化（圖7K）。在胞葬前用Mdivi（線粒體分裂的抑制劑）處理hMSCs。在使用Mdivi預(yù)處理的hMSCs中，在24小時(shí)檢測(cè)的胞葬的總體速率和效率（MFI）降低，但不影響其活力（圖7G-J）。與線粒體重塑在MSC向成骨細(xì)胞分化中的作用一致，在沒(méi)有PMN的情況下，Mdivi處理有增加成骨細(xì)胞分化的趨勢(shì)（圖7K）。重要的是，Mdivi和PMN共同處理可恢復(fù)hMSCs的成骨分化潛能（圖7K）。綜上所述，在MSC胞葬過(guò)程中抑制線粒體分裂可以挽救胞葬MSC的成骨分化潛能。這些數(shù)據(jù)表明，在MSCs中，線粒體分裂的增加介導(dǎo)胞葬誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化缺陷。

圖7. 胞葬使MSC線粒體趨向分裂

結(jié)論

       本研究描述了間充質(zhì)干細(xì)胞作為BMME中的非專(zhuān)業(yè)吞噬細(xì)胞的新功能，并證明了間充質(zhì)干細(xì)胞的胞葬作用在指導(dǎo)線粒體重塑和間充質(zhì)干細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用。因此，MSCs的胞葬功能可能是一種功能障礙和衰老的新機(jī)制。由于人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)據(jù)表明，間充質(zhì)干細(xì)胞胞葬是保守的，因此，MSC胞葬的結(jié)果可能會(huì)影響這些細(xì)胞在人類(lèi)骨骼中的行為，包括在衰老、癌癥和其他疾病背景下的骨髓重塑和骨丟失。

實(shí)驗(yàn)方法

體外胞葬分析，共聚焦顯微技術(shù)，RNA 測(cè)序，生物能量學(xué)分析，線粒體網(wǎng)絡(luò)測(cè)量，線粒體膜電位測(cè)量，分化實(shí)驗(yàn)，BODIPY染色，堿性磷酸酶和Von Kossa染色，光顯微鏡，藥物抑制線粒體分裂的胞葬分析，藥物抑制線粒體分裂的堿性磷酸酶測(cè)定，流式細(xì)胞術(shù)

參考文獻(xiàn)

Quarato ER, Salama NA, Li AJ, Smith CO, Zhang J, Kawano Y, McArthur M, Liesveld JL, Becker MW, Elliott MR, Eliseev RA, Calvi LM. Efferocytosis by bone marrow mesenchymal stromal cells disrupts osteoblastic differentiation via mitochondrial remodeling. Cell Death Dis. 2023 Jul 14;14(7):428. doi: 10.1038/s41419-023-05931-9. PMID: 37452070; PMCID: PMC10349065.