靶向PGLYRP1促進(jìn)抗腫瘤免疫同時(shí)抑制自身免疫性神經(jīng)炎癥
摘要
共抑制和檢查點(diǎn)分子抑制腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的功能，從而使T細(xì)胞失去功能。盡管免疫檢查點(diǎn)阻滯是多種人類(lèi)癌癥的成功治療選擇，但嚴(yán)重的自身免疫樣不良效應(yīng)可能會(huì)限制其應(yīng)用。在這里，我們展示了編碼肽聚糖識(shí)別蛋白1（PGLYRP1）的基因高度與編碼共抑制分子的基因共表達(dá)，這表明它可能是癌癥免疫治療的有前途的靶點(diǎn)。在小鼠中遺傳敲除Pglyrp1導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)減緩，并使CD8+ T細(xì)胞呈現(xiàn)出增強(qiáng)的激活/效應(yīng)器表型，這表明PGLYRP1在CD8+ T細(xì)胞中具有抑制功能。令人驚訝的是，遺傳敲除Pglyrp1能夠保護(hù)免受實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)展，這是中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病的模型。PGLYRP1缺陷的髓系細(xì)胞在抗原呈遞和T細(xì)胞激活方面存在缺陷，這表明PGLYRP1在自身免疫期間可能在髓系細(xì)胞中起到促炎分子的作用。這些結(jié)果突出了PGLYRP1作為免疫治療的有前途的靶點(diǎn)，當(dāng)被靶向時(shí)，能夠引發(fā)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫應(yīng)答，同時(shí)保護(hù)免受一些形式的組織炎癥和自身免疫疾病的影響。
該研究于2023年10月發(fā)表在《Nature Immunology》，IF：30.5。
技術(shù)路線
結(jié)果
1、Plyrp1與共抑制基因在T細(xì)胞中的共表達(dá)
我們實(shí)驗(yàn)室以及其他研究組的早期工作表明，在T細(xì)胞中，共抑制分子高度共表達(dá)在一個(gè)基因模塊中。因此，我們推斷，與共抑制基因在腫瘤中CD8+ T細(xì)胞中高度共表達(dá)的基因可能編碼新的T細(xì)胞檢查點(diǎn)分子。我們利用了我們先前發(fā)表的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來(lái)自B16F10黑色素瘤，以識(shí)別共變化的所有基因通過(guò)單個(gè)細(xì)胞的編碼已知免疫檢查點(diǎn)（Pdcd1、Tigit、Ctla4、Havcr2和Lag3）的基因與干細(xì)胞特性相關(guān)的基因（Ccr7、Cxcr5、Tcf7和Sell）（圖1a）。T細(xì)胞中編碼多種已知功能分子的基因，包括Cxcr6、Nkg7、Gzmb、Ifng、Prf1、Irf8和Bhlhe40，與檢查點(diǎn)基因正相關(guān)并與干細(xì)胞基因負(fù)相關(guān)。此外，Pglyrp1一個(gè)在T細(xì)胞中沒(méi)有已知功能的基因，也遵循這樣的模式（與共抑制分子的Spearman相關(guān)系數(shù)=0.47，P=1.2×10^-21；與干細(xì)胞基因的Spearman相關(guān)系數(shù)= -0.27，P=1.8×10^-7；P值是用Spearman的漸近t檢驗(yàn)計(jì)算的）。一致地，Pglyrp1在表達(dá)共抑制基因（Pdcd1、Tigit、Ctla4、Havcr2和Lag3）和T細(xì)胞功能障礙特征的細(xì)胞群中表達(dá)，而在表達(dá)干細(xì)胞樣基因（Slamf6、Ccr7、Cxcr5、Tcf7和Sell）的細(xì)胞群中不表達(dá)（圖1b、c）。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從MC38-OVA腫瘤中分離的PD-1+TIM-3+ CD8+ T細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成了耗竭T細(xì)胞，Pglyrp1的表達(dá)在體外增加（圖1d）。在對(duì)來(lái)自人類(lèi)黑色素瘤的免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)PGLYRP1與其他共抑制分子一起在耗竭CD8+ T細(xì)胞中表達(dá)最高，盡管其RNA水平較低于編碼其他檢查點(diǎn)分子的RNA，這表明PGLYRP1與共抑制基因的共表達(dá)在耗竭人類(lèi)T細(xì)胞中也是保守的，但可能由于RNA水平較低而沒(méi)有得到足夠的關(guān)注。
因此，我們的數(shù)據(jù)顯示，Pglyrp1在小鼠和人類(lèi)的耗竭CD8+ T細(xì)胞中與共抑制基因高度共表達(dá)。
2、IL-27對(duì)T細(xì)胞Plyrp1表達(dá)的調(diào)節(jié)
我們先前已經(jīng)證明，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-27（IL-27）誘導(dǎo)了T細(xì)胞中的一個(gè)共抑制模塊。值得注意的是，Pglyrp1是這個(gè)由IL-27誘導(dǎo)的共抑制模塊的一部分。為了確認(rèn)IL-27在T細(xì)胞中誘導(dǎo)Pglyrp1表達(dá)，我們體外培養(yǎng)了有或沒(méi)有IL-27原生的CD4+和CD8+ T細(xì)胞，確認(rèn)IL-27信號(hào)傳導(dǎo)后CD4+（約27倍）和CD8+（約2.5倍）T細(xì)胞中Pglyrp1表達(dá)顯著增加（圖1e）。先前已經(jīng)確定轉(zhuǎn)錄因子PRDM1和c-MAF是IL-27誘導(dǎo)的共抑制模塊的協(xié)同調(diào)控因子。為了測(cè)試它們是否對(duì)IL-27介導(dǎo)的T細(xì)胞中Pglyrp1表達(dá)的誘導(dǎo)起作用，我們體外培養(yǎng)了來(lái)自PRDM1/c-MAF缺陷小鼠（Maf–/–Prdm1–/–）的原生的有或沒(méi)有IL-27的CD4+ T細(xì)胞（圖1f）。結(jié)果顯示，IL-27對(duì)Pglyrp1表達(dá)的誘導(dǎo)在Maf–/– Prdm1–/– T細(xì)胞中明顯減少，表明IL-27-PRDM1/c-MAF軸在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞中的Pglyrp1表達(dá)。為了檢查IL-27和PRDM1/c-MAF是否在T細(xì)胞中的Pglyrp1表達(dá)中起作用，我們分析了先前發(fā)表的CD8+ T細(xì)胞的總RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，這些細(xì)胞是從野生型（WT）和IL-27受體缺陷型（Il27ra–/–）小鼠或Maf–/–Prdm1–/–小鼠的B16F10黑色素瘤腫瘤中分離的（圖1g,h）。在這兩種情況下，與相應(yīng)的WT對(duì)照相比，我們發(fā)現(xiàn)Pglyrp1的表達(dá)水平降低。因此，我們的結(jié)果表明，IL-27-PRDM1/c-MAF軸在體內(nèi)外都調(diào)控T細(xì)胞中Pglyrp1的表達(dá)。
3、Plyrp1基因缺陷小鼠中腫瘤生長(zhǎng)受到抑制
為了分析PGLYRP1在抗腫瘤免疫中是否起到功能性作用，我們研究了PGLYRP1在不同人類(lèi)癌癥中的表達(dá)水平與生存率之間的關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PGLYRP1的腫瘤患者有明顯更差的預(yù)后，這表明PGLYRP1在人類(lèi)癌癥中可能作為抗腫瘤免疫的負(fù)調(diào)控因子。
為了研究PGLYRP1在免疫反應(yīng)中的作用，我們獲得了Pglyrp1–/–小鼠，這些小鼠在穩(wěn)態(tài)下對(duì)免疫系統(tǒng)組成和T細(xì)胞表型沒(méi)有改變。為了測(cè)試PGLYRP1在小鼠抗腫瘤免疫中的作用，我們植入MC38-OVA結(jié)腸癌細(xì)胞和B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞到Pglyrp1–/–小鼠和相匹配的野生型（WT）同窩對(duì)照小鼠中（圖2）。我們發(fā)現(xiàn)植入MC38-OVA細(xì)胞的Pglyrp1–/–小鼠的腫瘤大小和腫瘤重量減?。▓D2a–c），這表明PGLYRP1可能是抗腫瘤免疫的潛在負(fù)調(diào)控因子。我們還發(fā)現(xiàn)Pglyrp1–/–小鼠植入B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)減緩，突顯了PGLYRP1缺陷對(duì)不同腫瘤類(lèi)型的腫瘤生長(zhǎng)具有保守性作用。
為了了解PGLYRP1可能在腫瘤微環(huán)境中對(duì)哪種免疫細(xì)胞類(lèi)型發(fā)揮作用，我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）評(píng)估了MC38-OVA腫瘤中分離的不同免疫細(xì)胞群體中Pglyrp1的表達(dá)。與我們先前的分析一致，Pglyrp1的表達(dá)在耗竭CD8+ T細(xì)胞中最高。在腫瘤微環(huán)境的固有成分中，自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和中性粒細(xì)胞表達(dá)Pglyrp1的水平最高。在MC38-OVA腫瘤中，相對(duì)頻率方面，Pglyrp1–/–小鼠與野生型小鼠相比，免疫細(xì)胞種群沒(méi)有主要差異，除了Treg細(xì)胞在Pglyrp1–/–小鼠的腫瘤中明顯減少（圖2d）。
因?yàn)镻glyrp1與CD8+ T細(xì)胞中的共抑制分子共表達(dá)，我們接下來(lái)集中研究CD8+ T細(xì)胞組分。有趣的是，Pglyrp1–/–小鼠的腫瘤和淋巴結(jié)中CD8+ T細(xì)胞中高頻率表達(dá)促炎細(xì)胞因子，包括干擾素-γ（IFNγ）、腫瘤壞死因子（TNF）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），表明增加了效應(yīng)功能（圖2e）。我們?cè)贑D4+ T細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子表達(dá)的差異，除了腫瘤中IFNγ產(chǎn)生的增加。TIM-3和PD-1是共抑制分子，在T細(xì)胞激活過(guò)程中上調(diào)，也是終末耗竭T細(xì)胞的標(biāo)志。我們發(fā)現(xiàn)Pglyrp1–/–小鼠的腫瘤、淋巴結(jié)和脾臟中CD8+ T細(xì)胞中TIM-3和PD-1的表達(dá)增加，TIM-3+ PD-1+ CD8+ T細(xì)胞的頻率也增加（圖2f,g）。我們?cè)贑D4+ T細(xì)胞的TIM-3和PD-1表達(dá)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異。結(jié)合我們的功能數(shù)據(jù)，這些發(fā)現(xiàn)表明Pglyrp1–/–小鼠的CD8+ TILs的激活和效應(yīng)表型增強(qiáng)。
為了全面描述Pglyrp1–/–小鼠中CD8+ T細(xì)胞的表型，我們對(duì)Pglyrp1–/–小鼠和相匹配的WT同窩對(duì)照中的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞進(jìn)行了bulk RNA測(cè)序。我們鑒定了在Pglyrp1–/– 與WT CD8+ T細(xì)胞中上調(diào)的330個(gè)基因和下調(diào)的35個(gè)基因（FDR<0.15和|log2(fold change)|>1；P值是用edgeR中的似然比檢驗(yàn)計(jì)算的，經(jīng)過(guò)Benjamini-Hochberg方法（FDR）進(jìn)行了多重比較調(diào)整；圖2h）。與我們的流式分析一致，Pglyrp1–/–與WT CD8+ T細(xì)胞中表達(dá)增加的基因包括參與T細(xì)胞激活、效應(yīng)功能和耗竭基因（Nr4a2、Prf1、Lag3、Irf8、Atf3、Ifng、Havcr2、Tigit和Maf；圖2h,i），并富集在T細(xì)胞效應(yīng)和耗竭標(biāo)志中（圖2j,k）。
4、Pglyrp1–/– CD8+ TILs 顯示向效應(yīng)細(xì)胞/耗竭細(xì)胞轉(zhuǎn)變
為了更好地理解Pglyrp1–/– CD8+ TILs中共抑制分子和效應(yīng)功能同時(shí)增加，我們對(duì)來(lái)自Pglyrp1–/–小鼠和相匹配的WT對(duì)照小鼠的CD45+ CD3+ TILs進(jìn)行了scRNA測(cè)序（圖3）。細(xì)胞聚類(lèi)成四個(gè)亞群（圖3a），我們根據(jù)標(biāo)記物表達(dá)將其注釋為T(mén)reg細(xì)胞、CD4+常規(guī)T（Tconv）細(xì)胞和兩個(gè)CD8+ T細(xì)胞簇。在其中一個(gè)CD8+ T細(xì)胞簇中，包括與WNT和TCF信號(hào)傳導(dǎo)以及干細(xì)胞和原始樣細(xì)胞相關(guān)的通路富集，表示這個(gè)簇為干細(xì)胞樣細(xì)胞。相反，另一個(gè)CD8+ T細(xì)胞簇富集了T細(xì)胞激活、效應(yīng)功能和耗竭標(biāo)志，表明一個(gè)簇為干細(xì)胞樣細(xì)胞，另一個(gè)簇為效應(yīng)器/耗竭細(xì)胞。RNA速度分析表明從干細(xì)胞樣細(xì)胞到效應(yīng)器/耗竭細(xì)胞的軌跡，進(jìn)一步支持這一模型。與我們?cè)缙诘姆治鲆恢拢▓D1），Pglyrp1的表達(dá)在效應(yīng)器/耗竭和Treg細(xì)胞簇中最高（圖3b）。
WT小鼠和Pglyrp1–/–小鼠的細(xì)胞特征在Treg細(xì)胞和CD4+ Tconv細(xì)胞簇中混合良好，只有少數(shù)差異表達(dá)的基因（在Treg細(xì)胞和CD4+ Tconv細(xì)胞中分別上調(diào)8和41個(gè)基因，下調(diào)4和7個(gè)基因；FDR<0.05和|log2(fold change)|≥0.25；P值是用edgeR中的經(jīng)驗(yàn)Bayes準(zhǔn)似然F檢驗(yàn)計(jì)算的，經(jīng)過(guò)Benjamini-Hochberg方法（FDR）進(jìn)行了多重比較調(diào)整；圖3c）。與我們的流式分析一致（圖2d），Pglyrp1–/–小鼠的腫瘤中Treg細(xì)胞的比例顯著減少（圖3d）。在WT小鼠和Pglyrp1–/–小鼠的Treg細(xì)胞之間差異表達(dá)的少數(shù)基因中，Itgae（編碼CD103）是Pglyrp1–/–小鼠中最高的下調(diào)基因（P=1.2×10?5，fold change=2.73；P值是用edgeR中的經(jīng)驗(yàn)Bayes準(zhǔn)似然F檢驗(yàn)計(jì)算的）。CD103通常高表達(dá)于腫瘤浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞上，并標(biāo)志著一種特別具有抑制作用的Treg細(xì)胞亞群。因此，CD103在Pglrp1-/-Treg細(xì)胞上的異常表達(dá)可能與其在腫瘤中的低表達(dá)有關(guān)。
Pglyrp1–/–和WT小鼠之間的CD8+ T細(xì)胞特征更加不同，有更多的差異表達(dá)基因（239個(gè)上調(diào)和226個(gè)下調(diào)；圖3c），在主成分（PC）空間中距離更大（最明顯在干細(xì)胞簇中；圖3c），并且有一個(gè)明顯的全局偏移（圖3e）。此外，效應(yīng)器/耗竭細(xì)胞的比例在Pglyrp1–/– TILs中顯著增加（圖3d），與先前的流式分析一致（圖2e–g）。這些數(shù)據(jù)表明干細(xì)胞簇中存在重大表達(dá)變化，以及Pglyrp1–/–小鼠中效應(yīng)器/耗竭細(xì)胞比例的增加，表明干細(xì)胞樣細(xì)胞向效應(yīng)器/耗竭細(xì)胞的分化軌跡發(fā)生了變化。事實(shí)上，Pglyrp1–/–小鼠的干細(xì)胞樣細(xì)胞顯示出更高的基因（Stat1、Cd69、Jak2、Tbx21、Irf1和Prf1）和通路（IFN信號(hào)傳導(dǎo)、白細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和耗竭）的表達(dá)水平，這些基因和通路參與了T細(xì)胞激活和效應(yīng)T細(xì)胞的生成（圖3f,g）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明了CD8+ TILs中干細(xì)胞樣細(xì)胞向激活/耗竭細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。
為了檢查PGLYRP1在CD8+ T細(xì)胞中是否具有細(xì)胞內(nèi)功能，我們生成了有條件的Pglyrp1敲除小鼠（Pglyrp1fl/fl）并將它們與E8iCre小鼠交配，以生成CD8+ T細(xì)胞中特異性刪除Pglyrp1的小鼠（E8iCrePglyrp1fl/fl）。我們將MC38-OVA腫瘤植入E8iCrePglyrp1fl/fl小鼠和野生型同窩對(duì)照動(dòng)物，并發(fā)現(xiàn)E8iCrePglyrp1fl/fl小鼠的腫瘤生長(zhǎng)控制更好，并且CD8+ TILs中PD-1和TIGIT表達(dá)水平更高的細(xì)胞比例增加（圖3h,i）。相比之下，特異性在髓系細(xì)胞中刪除Pglyrp1表達(dá)（LysMCrePglyrp1fl/fl小鼠）并沒(méi)有改變腫瘤生長(zhǎng)，這表明Pglyrp1在髓系細(xì)胞上的表達(dá)對(duì)抗腫瘤免疫是不必要的。
總之，我們的數(shù)據(jù)表明，在CD8+ TILs中刪除Pglyrp1導(dǎo)致干細(xì)胞樣細(xì)胞向激活/耗竭細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，表明PGLYRP1可能是一個(gè)調(diào)節(jié)CD8+ TILs中從干細(xì)胞樣細(xì)胞到效應(yīng)器的過(guò)渡的抑制分子。
5、PGLYRP1缺陷小鼠可免受EAE的侵襲
阻斷共抑制分子用于癌癥治療的一個(gè)主要障礙是誘導(dǎo)自身免疫樣副作用，這些副作用是由于免疫抑制分子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和恢復(fù)體內(nèi)平衡方面的重要作用而產(chǎn)生的。類(lèi)似地，在小鼠模型中，阻斷和刪除T細(xì)胞抑制分子，如CTLA-4、PD-1、TIM-3和TIGIT，會(huì)導(dǎo)致加重的自身免疫疾病，包括EAE。由于小鼠的腫瘤模型持續(xù)時(shí)間較短，不允許我們研究自發(fā)性自身免疫，因此我們測(cè)試了Pglyrp1喪失對(duì)自身免疫模型的影響。
為了確定PGLYRP1缺乏是否也會(huì)加重自身免疫疾病，我們?cè)赑glyrp1–/–小鼠和匹配的野生型同窩對(duì)照小鼠中誘導(dǎo)了EAE。令人驚訝的是，Pglyrp1–/–小鼠在EAE中獲得了高度的保護(hù)，發(fā)病率減少（Pglyrp1–/–：62%；WT：100%），最大臨床EAE評(píng)分（Pglyrp1–/–：2.3；WT：2.9）和平均臨床EAE評(píng)分（Pglyrp1–/–：1.6；WT：2.3；圖4a–c）。組織學(xué)分析進(jìn)一步顯示，Pglyrp1–/–小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變和視神經(jīng)炎減少（圖4d,e）。與WT相比，在Pglyrp1–/–小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，我們發(fā)現(xiàn)造血浸潤(rùn)物（CD45+）以及CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、Treg細(xì)胞和B細(xì)胞浸潤(rùn)物普遍減少，這些細(xì)胞類(lèi)型已知在EAE疾病中發(fā)揮重要作用（圖4f）。滲透到Pglyrp1–/–小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的CD4+ T細(xì)胞表達(dá)的炎癥因子IL-17A、IFNγ和GM-CSF的水平以及抗炎因子IL-10顯著降低（圖4g）。滲入的CD8+ T細(xì)胞表達(dá)的IL-17A和IFNγ水平顯著降低。總之，這些數(shù)據(jù)表明在EAE期間沒(méi)有PGLYRP1的T細(xì)胞啟動(dòng)缺陷。
總之，與其他已知的T細(xì)胞抑制分子缺陷的小鼠不同，Pglyrp1–/–小鼠對(duì)EAE獲得了保護(hù)，PGLYRP1似乎對(duì)EAE疾病病理起作用。
6、PGLYRP1在髓系細(xì)胞中作為促炎分子發(fā)揮作用
為了揭示全局Pglyrp1敲除小鼠（Pglyrp1–/–）中減少的EAE表型是由哪種細(xì)胞類(lèi)型負(fù)責(zé)的，我們使用E8iCrePglyrp1fl/fl小鼠，并將有條件的Pglyrp1敲除小鼠（Pglyrp1fl/fl）與Cd4Cre小鼠交配，以生成CD4+ Tconv細(xì)胞、Treg細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞中Pglyrp1特異性刪除的小鼠（Cd4CrePglyrp1fl/fl）。與WT同窩小鼠相比，我們?cè)谶@兩個(gè)模型中都沒(méi)有觀察到EAE的發(fā)展有明顯差異，這表明T細(xì)胞中PGLYRP1表達(dá)的喪失并不是Pglyrp1–/–小鼠中保護(hù)性EAE表型的原因（圖5a,b）。
基于在EAE期間Pglyrp1–/–小鼠中T細(xì)胞啟動(dòng)缺陷（圖4f,g）和在EAE期間調(diào)節(jié)自反應(yīng)T細(xì)胞啟動(dòng)的髓系細(xì)胞的重要功能，我們假設(shè)破壞髓系細(xì)胞上PGLYRP1的表達(dá)可能有助于Pglyrp1–/–小鼠中EAE表型的減少。因此，我們將Pglyrp1fl/fl小鼠與LysMCre小鼠交配，以生成具有髓系細(xì)胞特異性Pglyrp1刪除的小鼠，包括單核細(xì)胞、成熟巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和一些樹(shù)突細(xì)胞（DCs；LysMCrePglyrp1fl/fl）。有趣的是，與WT同窩對(duì)照小鼠相比，LysMCrePglyrp1fl/fl小鼠對(duì)EAE獲得了保護(hù)（圖5c,d），體內(nèi)的炎癥因子IL-6水平較低（圖5e）。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)浸潤(rùn)的髓系細(xì)胞表現(xiàn)較不活化，如主要組織相容性復(fù)合體II類(lèi)（MHC II類(lèi)）的表達(dá)（圖5f）。與減少的髓系細(xì)胞活化相一致，dLNs中的CD4+ T細(xì)胞似乎啟動(dòng)較少，CD44激活標(biāo)記物和細(xì)胞因子GM-CSF、IL-2和TNF的表達(dá)減少（圖5g），這表明LysMCrePglyrp1fl/fl小鼠在EAE期間T細(xì)胞啟動(dòng)存在缺陷。此外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中檢測(cè)到較低頻率的致病性產(chǎn)生IL-17的輔助T（TH17）細(xì)胞（IL-17A+ IFNγ+；圖5h）。這些數(shù)據(jù)共同表明，在EAE期間，髓系細(xì)胞中的PGLYRP1表達(dá)是足夠的抗原呈遞和T細(xì)胞啟動(dòng)所必需的。
為了檢驗(yàn)PGLYRP1在髓系細(xì)胞中在抗原呈遞給CD4+ T細(xì)胞中的潛在作用，我們進(jìn)行了抗原呈遞實(shí)驗(yàn)。我們將來(lái)自LysMCrePglyrp1fl/fl小鼠或WT同窩的脾細(xì)胞與具有特異于髓鞘膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）的T細(xì)胞抗原受體（TCR）的2D2 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠的初級(jí)CD4+ T細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)，其中包含MOG肽或不包含MOG肽。在具有LysMCrePglyrp1fl/fl脾細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，2D2細(xì)胞的增殖率較低，并且較低水平的促炎細(xì)胞因子IL-1α、IL-6、MCP-1和TNF分泌到培養(yǎng)基中，表明PGLYRP1在髓系細(xì)胞中在抗原呈遞和CD4+ T細(xì)胞啟動(dòng)中起作用。
為了檢驗(yàn)PGLYRP1在髓系細(xì)胞中是否在EAE期間的T細(xì)胞啟動(dòng)中發(fā)揮作用，我們?cè)谡T導(dǎo)EAE的背景下在LysMCrePglyrp1fl/fl小鼠和WT同窩對(duì)照小鼠中進(jìn)行了一次召回實(shí)驗(yàn)。在免疫后的第10天，我們收集脾臟并將脾細(xì)胞與或不與MOG肽一同培養(yǎng)。在具有LysMCrePglyrp1fl/fl脾細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)基中檢測(cè)到較低濃度的促炎細(xì)胞因子（IFNβ、IL-6、MCP-1和TNF），這表明PGLYRP1在髓系細(xì)胞中在EAE期間CD4+ T細(xì)胞啟動(dòng)中起作用。
綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在EAE期間，髓系細(xì)胞需要PGLYRP1進(jìn)行最佳的抗原呈遞和CD4+ T細(xì)胞的啟動(dòng)。
7、Plyrp1-/-單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的表達(dá)變化
為了揭示在EAE期間PGLYRP1缺陷影響哪些髓系細(xì)胞群，我們首先分析了在EAE發(fā)作初期的淋巴結(jié)內(nèi)的免疫群體中Pglyrp1的表達(dá)情況（圖6a）。我們檢測(cè)到單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá)最高。這種高Pglyrp1表達(dá)是由EAE誘導(dǎo)的，因?yàn)閬?lái)自天然小鼠的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯示出較低的Pglyrp1表達(dá)。
為了檢驗(yàn)PGLYRP1缺陷如何改變髓系細(xì)胞組分，我們對(duì)來(lái)自Pglyrp1–/–小鼠和WT對(duì)照小鼠的EAE初發(fā)時(shí)的CD45+中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序，并分析了B細(xì)胞和髓系細(xì)胞（CD3–細(xì)胞）。3698個(gè)主要是髓系細(xì)胞的細(xì)胞譜被分為14個(gè)簇（圖6b），具有明顯的表達(dá)特征（圖6c）。我們使用細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)記和差異基因簽名將這14個(gè)亞群進(jìn)行了注釋?zhuān)▎魏思?xì)胞/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、B細(xì)胞、DC1s/DC2s、漿細(xì)胞樣DC、DC3s、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞（圖6c）。
在每個(gè)簇中，Pglyrp1–/–和WT細(xì)胞之間的差異（主成分空間中的距離）最大（圖6d）。在Pglyrp1–/–和WT小鼠之間的不同基因表達(dá)分析中，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（44個(gè)基因上調(diào)和119個(gè)基因下調(diào)）和中性粒細(xì)胞（163個(gè)基因上調(diào)和54個(gè)基因下調(diào)）之間的差異最大（FDR < 0.05且|log2(fold change)| > 0.25；FDR是通過(guò)與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞相同的方法計(jì)算的；圖6e）。在Pglyrp1–/–小鼠中，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中減少的基因包括互補(bǔ)系統(tǒng)成員（Cfb和C1qb）和促炎趨化因子CXCL10（Cxcl10）的編碼基因。Pglyrp1–/–中性粒細(xì)胞中Cd74的表達(dá)，該基因編碼HLA-DR抗原相關(guān)不變鏈（CD74），較低。有趣的是，Pglyrp1–/–單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中有九個(gè)基因下調(diào)，包括Apoe和Lgals3。特別是，在Pglyrp1–/–單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（變化排名第1）和中性粒細(xì)胞（變化排名第3）中，Apoe顯著下調(diào)。Apoe編碼載脂蛋白E，最近已經(jīng)顯示它在髓系細(xì)胞抗原呈遞和T細(xì)胞啟動(dòng)中具有關(guān)鍵作用，與我們?cè)贓AE期間的Pglyrp1–/–小鼠中發(fā)現(xiàn)的抗原呈遞和T細(xì)胞啟動(dòng)的缺陷一致（圖4g和圖5g、i）。Lgals3編碼加凝集素-3，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的遷移。在Pglyrp1–/–單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，多個(gè)與髓系細(xì)胞激活有關(guān)的基因上調(diào)，包括Jun和Lilra6，它們都參與髓系細(xì)胞激活。Pglyrp1–/–中性粒細(xì)胞中上調(diào)的多個(gè)干擾素刺激基因（Ifit3、Ifit3b、Ifit1、Ifi204、Ifi27l2a、Oasl2和Irf7）表明了IFN信號(hào)的增加。WT單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中不同上調(diào)的基因富集了互補(bǔ)級(jí)聯(lián)、炎癥反應(yīng)和抗原呈遞通路，而Pglyrp1–/–單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上調(diào)的基因富集了DNA修復(fù)和細(xì)胞分裂通路（圖6f）。WT中性粒細(xì)胞富集了涉及殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞顆粒釋放和抗原呈遞的通路，而Pglyrp1–/–中性粒細(xì)胞中富集了與干擾素信號(hào)有關(guān)的通路。綜上所述，這些分析表明，在Pglyrp1–/–單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中減少的促炎通路和激活，以及巨噬細(xì)胞的抗原呈遞。
PGN與PGLYRP1結(jié)合是其通過(guò)TREM-1激活髓系細(xì)胞的能力所必需的。為了測(cè)試PGLYRP1本身是否也能激活髓系細(xì)胞，我們?cè)隗w外用PGN、重組PGLYRP1或PGN + 重組PGLYRP1處理單核細(xì)胞，并測(cè)量促炎細(xì)胞因子TNF分泌到培養(yǎng)基中。我們發(fā)現(xiàn)只有經(jīng)過(guò)PGN和PGLYRP1處理的單核細(xì)胞顯著分泌TNF，這表明與PGN結(jié)合的PGLYRP1介導(dǎo)髓系細(xì)胞的激活，在沒(méi)有PGLYRP1的情況下，髓系細(xì)胞不能有效地被激活，從而無(wú)法在EAE期間進(jìn)行最佳的抗原呈遞。
總之，我們發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中Pglyrp1的高表達(dá)以及在EAE期間Pglyrp1–/–小鼠中這些細(xì)胞群體中出現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)錄變化。這些數(shù)據(jù)支持這樣一個(gè)模型，即在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中PGLYRP1的表達(dá)對(duì)于EAE中致病反應(yīng)的最佳啟動(dòng)是必需的。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的抗原呈遞所需功能的缺陷進(jìn)一步導(dǎo)致了Pglyrp1–/–小鼠和LysMCrePglyrp1fl/fl小鼠EAE疾病的減輕。
實(shí)驗(yàn)方法
初代CD4+T細(xì)胞的分離與分化、主動(dòng)誘導(dǎo)EAE、CNS 組織學(xué)、腫瘤實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選、抗原呈遞試驗(yàn)、召回實(shí)驗(yàn)、基于微珠的免疫分析、qPCR、Bulk RNA-seq、scRNA-seq、細(xì)胞類(lèi)型注釋、RNA速度分析、GSEA。
參考文獻(xiàn)
Schnell, A., Huang, L., Regan, B.M.L. et al. Targeting PGLYRP1 promotes antitumor immunity while inhibiting autoimmune neuroinflammation. Nat Immunol (2023).