骨髓祖細胞中NEK2的高表達抑制多發(fā)性骨髓瘤患者的T細胞免疫

       多發(fā)性骨髓瘤（MM）的生長是由免疫耐受骨髓微環(huán)境支持的。在這里，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境細胞中有絲分裂基因A（NIMA）相關激酶2（NEK2）中Never的缺失與MM生長抑制有關。NEK2的缺失導致腫瘤相關的巨噬細胞（TAMs）和抑制性T細胞的減少。髓系祖細胞中NEK2的表達在MM條件培養(yǎng)基刺激下促進功能性TAMs的產(chǎn)生。在臨床上，MM細胞中NEK2的高表達與CD8⁺ T效應記憶細胞的增加有關，而NEK2的低表達與IFN-γ基因標記和激活的T細胞反應有關。抑制NEK2可上調(diào)MM細胞和髓細胞中PD-L1的表達。在小鼠模型中，NEK2抑制劑INH154與PD-L1抑制劑聯(lián)合使用可有效消除MM細胞并延長生存期。作者的研究結果提供了強有力的證據(jù)，證明NEK2抑制可以克服腫瘤免疫逃逸，并支持其進一步的臨床開發(fā)。本文于2023.10發(fā)表于《Cell Reports Medicine》，IF:14.3;Q1。

技術路線

研究機制圖

主要實驗結果

1、敲除NEK2可提高Eμ-myc小鼠的存活率并誘導T細胞活化

       NEK2在B細胞譜系中的過表達影響B(tài)細胞的發(fā)育。為了確定NEK2缺乏是否會抑制B細胞惡性腫瘤，作者生成了NEK2^-/-小鼠。接下來，作者將NEK2^-/-小鼠與Eμ-myc轉基因小鼠雜交，Eμ-myc轉基因小鼠是一種成熟的Myc驅(qū)動的B細胞惡性嬰兒臨床前模型。Eμ-myc/Nek2^+/+和Eμ-myc/Nek2^+/-小鼠的存活率相似（圖1A）。然而，Eμ-myc/NEK2^+/-小鼠的存活時間顯著延長（圖1A），這表明NEK2的兩個等位基因的缺失延遲了B細胞淋巴瘤的進展。為了研究這些小鼠B細胞腫瘤發(fā)展的早期階段，作者在小鼠6-8周齡時采集了血液、骨髓和脾臟樣本。全血細胞計數(shù)分析顯示，與Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠相比，Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠的循環(huán)延遲淋巴細胞數(shù)量減少，血小板增加（圖1B）。脾臟和胸腺的重量也有所下降（圖1C）。BM和脾臟B細胞亞群的流量測定進一步發(fā)現(xiàn)，與Nek2^+/+小鼠相比，Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠的pre-B細胞和pro-B細胞增加，但成熟B細胞減少，而Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠的pre-B細胞和pro-B細胞減少，但成熟B細胞的損失不太明顯（圖1D）。因此，NEK2的缺失限制了Myc誘導的淋巴瘤發(fā)生。

       為了比較Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠與Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠的轉錄組特征，作者收集了癌前B細胞并進行了RNA測序（圖1E）。有趣的是，免疫相關通路顯著上調(diào)（圖1F），強烈提示缺乏NEK2與免疫激活有關。Cxcl9在抗腫瘤免疫中起關鍵作用，依賴于IFN-γ的產(chǎn)生，折疊變化最大（log2FC = 10.5）。一些抑制性免疫受體也上調(diào)，包括Cd274（編碼PD-L1）。為了驗證PD-L1的上調(diào)是否由于IFN-γ的激活，作者分析了小鼠B細胞中IFN-γ信號的下游靶點。與Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠相比，Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠中JAK/STAT1/IRF1信號顯著激活（圖1G和1H）。最后，為了確定荷瘤和非荷瘤小鼠Nek2^+/+和Nek2^-/-的T細胞激活狀態(tài)，作者進行了流式細胞術。與無腫瘤小鼠相比，Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠的CD8⁺原始T細胞（T_N）受到抑制，但Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠未觀察到這種損失（圖1I）。另一方面，CD8⁺T_EM顯示相反的情況（圖1I）。而PD1在T細胞上的表達無明顯變化。這些數(shù)據(jù)表明，在NEK2敲除的Eμ-myc小鼠中，T細胞反應較少被驅(qū)動為效應記憶表型，并且存在針對Myc誘導的B細胞惡性腫瘤的改善的T細胞免疫反應。

圖1 敲除NEK2可提高Em-myc小鼠的存活率并誘導T細胞活化

2、NEK2缺失可減少腫瘤相關巨噬細胞和Tregs

       為了確定腫瘤微環(huán)境細胞中NEK2的缺乏如何促進腫瘤抑制和免疫調(diào)節(jié)，作者測試了NEK2^-/-小鼠中5TGM1 MM細胞的生長情況，并將其與NEK2^+/+窩鼠進行了比較（圖2A）。在Nek2^-/-小鼠中接種5TGM1 MM細胞可降低血清IgG2b水平，延長存活時間（圖2B和2C）。采用單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術研究BM細胞的細胞多樣性和轉錄組。使用標準數(shù)量控制，作者共分析了30284個BM細胞。將細胞投射到二維均勻流形近似和投影（UMAP）圖上，作者發(fā)現(xiàn)了17個不同的細胞簇（圖2D）。5TGM1 MM細胞通過高表達Sdc1（編碼CD138）被鑒定，并且只出現(xiàn)在5TGM1注射小鼠中。通過小鼠血清IgG2b水平測量，scRNA-seq顯示5TGM1/Nek2^-/-組（40%）與5TGM1/Nek2^+/+組（60%）相比，BM中MM細胞的百分比較低（圖2D）。在5TGM1 MM細胞注射小鼠中，正常漿細胞和pro-B細胞簇顯著減少，表明MM存在正常B細胞發(fā)育缺陷。這與最近的一篇報道一致，MM患者顯示正常漿細胞百分比降低。骨髓細胞是骨髓中最豐富的免疫細胞。與Nek2^+/+小鼠相比，荷瘤Nek2^+/+小鼠的巨噬細胞簇增加了3.6倍。

       一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，除了MM細胞和pro-B細胞外，NEK2在骨髓細胞和單細胞簇中表達最豐富（圖2E）。為了鑒定巨噬細胞集群中5TGM1/Nek2^+/+和5TGM1/Nek2^-/-組之間的差異表達基因，共鑒定出56個上調(diào)基因和43個下調(diào)基因（圖2F）。KEGG通路分析顯示，5TGM1/Nek2^-/-巨噬細胞中的鐵凋亡、破骨細胞分化和細胞周期減少（圖2G）。作者觀察到，與5TGM1/Nek2^+/+小鼠相比，5TGM1/Nek2^-/-小鼠的微計算機斷層掃描（μCT）顯示骨病變減少（圖2H），TRAP染色顯示5TGM1/Nek2^-/-小鼠的脛骨破骨細胞數(shù)量減少（圖2I）。5TGM1/Nek2^-/-巨噬細胞在抗原進程和呈遞、Fc γ R介導的吞噬、NOD樣受體信號通路和趨化因子信號通路中表現(xiàn)出陽性富集（圖2J）。為了進一步分析各組間巨噬細胞的表型差異，根據(jù)高可變基因的表達，共將740個巨噬細胞投影到UMAP圖上，并鑒定出四個巨噬細胞亞群（圖2K）。M-1亞群（Cirbp、Nfil3、Mt1、Apoe）、M-2亞群（CD36、Bcl2a1b）、M-3亞群（S100a9、S100a8、Lcn2）主要出現(xiàn)在荷瘤組，而這些基因在5TGM1/Nek2^-/-組中被抑制，其特征是被免疫抑制（Apoe、S100a9、S100a8）、巨噬細胞失活（Lcn2）、抗凋亡（Bcl2a1b）相關基因所控制（圖1K）。以抗原呈遞（Cd74）、巨噬細胞活化（Adgre4、Adgre5）和化療趨向性（Ccr2、Csf1r、Cx3cr1）相關基因為特征的M-0（Cd74、Ace、Adgre4）亞群在所有組中保持不變（圖2K）。NK/T細胞群比較（共627個細胞）顯示T-1（CD4, Foxp3, Ctla4）亞群顯著增加，其特征是與衰竭相關的基因（Foxp3, Ctla4）和T細胞激活標志物（CD27, Gzmk, Gzma）的缺失（圖2L），表明T調(diào)節(jié)細胞（Tregs）在5TGM1/Nek2^+/+組中增加。作者得出結論，抑制NEK2可以減少TAMs和Tregs的積累。

圖2 NEK2的缺失會降低腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)和Tregs

3、NEK2缺乏降低了TAMs和MDSCs的免疫抑制活性

       為了證實作者的scRNA-seq發(fā)現(xiàn)，通過流式細胞術定量了小鼠BM和脾臟的免疫細胞群（圖3A、3B、S3A和S3B）。與5TGM1/Nek2^+/+小鼠相比，作者觀察到5TGM1/Nek2^-/-小鼠BM和脾臟中注射5TGM1 MM細胞的異常漿細胞（aPCs, CD19 ^- CD138⁺）受到抑制（圖3A）。與5TGM1/Nek2^+/+小鼠相比，5TGM1/Nek2^-/-小鼠脾臟中Ly6C^hi巨噬細胞（CD11b⁺ CD11c ^- F4/80⁺ Ly6C^hi）、MoMDSCs（CD11b⁺ CD11c ^- F4/80 ^- Ly6C^hiLy6G ^-）和G-MDSCs（CD11b⁺ CD11c ^- F4/80 ^- Ly6C^intLy6G⁺）減少（圖3A）。然而，在骨髓中沒有觀察到這些發(fā)現(xiàn)，因為原始小鼠骨髓可能含有大量的正常骨髓細胞，這些細胞在表型上與MDSCs無法區(qū)分。對于T細胞群，雖然在總T細胞中沒有觀察到明顯的變化，但與5TGM1/Nek2^-/-小鼠相比，5TGM1/Nek2^+/+小鼠的BM中CD4/CD8細胞比例增加（圖3B）。正如預期的那樣，與5TGM1/Nek2^-/-小鼠相比，CD4和CD8 T細胞在5TGM1/Nek2^+/+中PD-1的表達均增加，這表明T細胞具有更強的抑制性（圖3B）。與非5TGM1注射組相比，荷瘤組IFN-γ⁺或顆粒酶B⁺ CD8 T細胞的百分比均無顯著增加，但Nek2^+/+和Nek2^-/-之間的差異很小或沒有（圖3B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，微環(huán)境細胞中缺乏NEK2傾向于抑制功能性TAMs和MDSCs的產(chǎn)生，并減少抑制性T細胞群。

       鑒于TAMs和MDSCs可以通過細胞因子從原始BM細胞誘導，作者首先在體外測試了NEK2對細胞因子誘導的TAMs和MDSCs生成的影響（圖3C）。5TGM1條件培養(yǎng)基（CM）提高了Nek2^+/+小鼠來源的巨噬細胞的細胞存活率，而Nek2^-/-的巨噬細胞存活率較低（圖3D）。已知NEK2調(diào)節(jié)細胞有絲分裂。作者在巨噬細胞的細胞周期中觀察到類似的結果;即5TGM1 CM處理的Nek2^+/+巨噬細胞與5TGM1 CM處理的Nek2^-/-巨噬細胞相比，具有更高的S和G2/M群（圖3E）。與未處理的巨噬細胞相比，5TGM1 CM促進了CD206的表達，而NEK2缺乏則降低了CD206的表達（圖3F），表明NEK2促進了TAMs的分化。此外，與Nek2^+/+小鼠誘導的TAMs相比，由Nek2^-/-小鼠誘導的TAMs促進了T細胞增殖和IFN-γ的產(chǎn)生（圖3G）。作者假設NEK2在響應腫瘤分泌因子時影響TAMs的激活。5TGM1 MM細胞與漿細胞差異表達基因的scRNA-seq分析顯示Mif和Hmgb1在MM細胞中高表達（圖3H）。為了研究NEK2是否能促進宏觀噬菌體對MIF-PI3K-AKT30和HMGB1-STAT3信號的反應，作者進行了western blot，結果顯示，與未刺激的相關巨噬細胞相比，NEK2 ^+/+ TAMs中p110α、p110γ、PI3K III類、p-AKT（S473）和p-STAT3 （Y705）水平升高，而這些水平在NEK2^-/-TAMs中被阻斷（圖3I）。Nek2^+/+和Nek2^-/-小鼠的MDSCs中也觀察到類似的結果（圖3J - 3L）。這些發(fā)現(xiàn)表明NEK2增強了TAMs和MDSCs的免疫抑制功能。

圖3 NEK2缺乏降低了TAMs和MDSCs的免疫抑制活性

4、NEK2高表達的MM患者表現(xiàn)出T細胞反應受損

       作者研究了來自堪薩斯大學醫(yī)學科學（UAMS）檔案（UAMS- MM）的324個MGUS、303個SMM、1049個NDMM和1066個RRMM的BM衍生的CD138選擇漿細胞中NEK2基因的表達模式。與SMM和MGUS相比，NDMM中的NEK2 mRNA水平升高（圖4A），RRMM中的NEK2 mRNA水平相對于NDMM進一步升高（圖4A）。此外，與GEP70評分定義的低風險（LR）MM相比，HR MM中的NEK2更高（圖4A）。根據(jù)基因表達模式，MM可分為7個分子亞型，其中NEK2在增殖（PR）亞型中表達最高，在超二倍體（HY）亞型中表達最低（圖4B）。在多發(fā)性骨髓瘤研究基金會（MMRF）的CoMMpass數(shù)據(jù)集中，包括606個NDMM樣本，證實了不同MM亞型的NEK2差異（圖4B）。對UAMS-MM和MMRF CoMMpass數(shù)據(jù)的Kaplan-Meier分析顯示，NEK2高表達的MM患者總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）較差（圖4C）。

       為了確定NEK2表達水平與免疫效應細胞的相關性，作者使用免疫細胞面板進行了細胞計數(shù)（CyTOF）。根據(jù)NEK2在CD138選擇的漿細胞中的表達情況，將BM抽吸樣品分為NEK2^high組（n = 6）和NEK2^low組（n = 6）。為了分析免疫細胞亞型和免疫檢查點表達，作者對門控CD45⁺細胞進行了FlowSOM分析。由于T細胞是MM患者中最豐富的細胞群，并且已報道與患者預后相關，作者進一步分析了T細胞亞群和T細胞激活狀態(tài)。結果顯示，大多數(shù)T細胞處于終末活化狀態(tài)。其中，T_EM和T_EMRA細胞在CD8⁺ T細胞中最多，而T_EM和T_CM （T central memory）細胞在CD4⁺ T細胞中最多;CD4⁺和CD8⁺ T細胞中T_N的表達最少（圖4D）。NEK2^low組CD8⁺ T_EM細胞減少（圖4D）。此外，PD1⁺ CD8⁺ T細胞的百分比與NEK2表達顯著相關（圖4E和4F）。在NEK2高表達的MM樣品中觀察到CD8⁺ T細胞增殖能力降低（圖4G）。此外，CD8⁺ T細胞產(chǎn)生IFNγ與NEK2表達水平呈負相關，但未觀察到TNFα和IL-6的變化（圖4H）。這些結果表明NEK2是MM的預后標志物，腫瘤細胞中高NEK2與T細胞功能受損有關。

圖4 NEK2高表達的MM患者表現(xiàn)出T細胞反應受損

5、NEK2抑制MM患者的IFN-γ/PD-L1信號通路

       作者觀察到IFN-γ基因特征與CIN基因特征之間呈負相關（圖5A）。與作者的動物研究一致（圖1G），作者還觀察到，在UAMS-MM和MMRF CoMMpass數(shù)據(jù)集中，IFN-γ誘導基因CD274與NDMM樣品中的NEK2表達呈負相關（圖5B）。CD274在HY亞型中表達最高，在PR亞型中表達最低（圖5C），這與其他研究一致，基于流式細胞檢測數(shù)據(jù)顯示PD-L1在超二倍體患者中增加。為了確定NEK2和CD274聯(lián)合表達是否能更好地預測患者預后，作者將患者分為四組，NEK2^highCD274^high、NEK2^highCD274^low、NEK2^lowCD274^high和NEK2^lowCD274^low。Kaplan-Meier分析顯示NEK2^lowCD274^high患者的OS和PFS最佳（圖5D）。為了驗證NEK2和PD-L1表達在蛋白水平上的相關性，作者對50例NDMM活檢樣本進行了NEK2和PD-L1的免疫組織化學（IHC）分析。繪制PD L1陽性與NEK2陽性細胞的百分比顯示，NEK2和PD- L1的蛋白水平呈負相關（圖5E）。這些結果表明，IFN-γ/PD-L1信號軸在高NEK2的MM細胞中受到壓迫。

圖5 NEK2抑制MM患者的IFN-g/PD-L1信號通路

6、NEK2抑制與抗PD - L1單抗聯(lián)合治療可提供治療益處

       基于NEK2抑制損害TAMs和MDSCs功能，同時上調(diào)MM細胞中PD-L1表達的發(fā)現(xiàn)，作者假設NEK2抑制劑INH154與抗PD-L1單抗聯(lián)合使用將具有額外的治療益處。為了驗證這一假設，作者對BM-MNCs進行了體外處理（圖6A）。INH154處理顯著降低了CD138⁺ MM細胞的百分比（圖6B），提示INH154選擇性靶向MM細胞可能是由于其相對較高的增殖能力。PD-L1單抗對MM細胞沒有明顯的殺傷作用，這可能是由于抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用有限。PD-L1單抗可有效阻斷INH154處理后MM細胞和髓細胞中PD-L1表達的增加（圖6C和6D）。此外，INH154和聯(lián)合治療后，總T細胞增加，而CD8⁺和CD4⁺ T細胞占總T細胞的百分比無明顯變化（圖6E）。此外，在INH154和聯(lián)合治療后，PD1⁺ CD8⁺和CD4⁺ T細胞的百分比均下降（圖6F）。這些數(shù)據(jù)表明，NEK2阻斷選擇性地抑制原發(fā)性骨髓瘤樣本中MM細胞的生長并減少PD1⁺ T細胞，并且通過阻斷MM和單核細胞上的PD-L1表達（NEK2抑制后PD-L1表達增加），與PD-L1單抗聯(lián)合使用可提供更好的治療效果。

圖6 NEK2抑制可提高抗pd - l1單克隆抗體(mAb)抗MM的效力

       為了測試聯(lián)合治療對well-es-建立的臨床前V_k*MYC MM小鼠模型的療效，在V_k12653 MM細胞注射前1天單獨或聯(lián)合給藥INH154和PD-L1 mAb，隨后每周兩次給藥，持續(xù)5周（圖7A）。單獨治療時，IHN154和PD-L1單抗均可降低V_k12653 MM細胞注射后第35天的血清γ-球蛋白水平，聯(lián)合治療時觀察到進一步降低（圖7B）。此外，Kaplan-Meier生存分析顯示，聯(lián)合治療組的生存期顯著延長（圖7C）。INH154和PD-L1單抗處理小鼠的脾臟重量均較低，聯(lián)合治療進一步降低（圖7D）。流式細胞術分析BM和脾臟中CD138⁺ B220 ^- MM細胞百分比及其PD-L1表達水平顯示，聯(lián)合治療組MM細胞百分比顯著降低（圖7E、7F）。此外，在INH154處理后，MM細胞上PD-L1的表達略有增加，而在PD-L1單抗處理后，PD-L1的表達幾乎完全被阻斷（圖7E、7F）。這些數(shù)據(jù)表明抑制劑INH154中的NEK2通過提高PD-L1水平和增強CD8⁺ T細胞活性，顯著增強抗PD-L1單抗的抗腫瘤功效。

圖7 聯(lián)合NEK2抑制與抗pd - l1單抗治療在MM小鼠模型中提供治療效果

結論

       研究強烈表明，在環(huán)境中阻斷NEK2可以通過增強抗腫瘤免疫來延緩MM腫瘤的進展。具體來說，髓系祖細胞中NEK2的缺乏減少了功能性TAMs和MDSCs的產(chǎn)生，從而增強了T細胞的抗腫瘤功能。通過評估NEK2在MM免疫中的臨床意義發(fā)現(xiàn)較高的NEK2表達與CD8⁺ T_EM細胞頻率增加有關，而較低水平的NEK2富集與PD-L1表達升高相關的IFN-γ基因特征。NEK2抑制劑INH154通過提高PD-L1水平和增強CD8⁺ T細胞活性，顯著增強抗PD-L1單抗的抗腫瘤療效。

實驗方法

體內(nèi)治療；小鼠血清蛋白電泳；流式細胞術；Bulk RNA序列；單細胞RNA序列（scRNA-seq）；生物信息學分析；微計算機斷層掃描（μCT）；骨組織形態(tài)計量學；體外TAMs和MDSCs生成；T細胞與TAMs或MDSCs共培養(yǎng)的功能測定；細胞活力和細胞周期；Western Blot；人骨髓瘤細胞的分離純化；基因表達譜分析；實時定量PCT；人T細胞功能測定；免疫組化；細胞計數(shù)術（CyTOF）；原代BM-MNCs的體外處理。

參考文獻

Cheng Y, Sun F, Alapat DV, Wanchai V, Mery D, Guo W, Cao H, Zhu Y, Ashby C, Bauer MA, Nookaew I, Siegel ER, Ying J, Chen JR, Gai D, Peng B, Xu H, Bailey C, Al Hadidi S, Schinke C, Thanendrarajan S, Zangari M, Chesi M, Bergsagel PL, van Rhee F, Janz S, Tricot G, Shaughnessy JD Jr, Zhan F. High NEK2 expression in myeloid progenitors suppresses T cell immunity in multiple myeloma. Cell Rep Med. 2023 Oct 17;4(10):101214. doi: 10.1016/j.xcrm.2023.101214. Epub 2023 Oct 3. PMID: 37794587; PMCID: PMC10591052.