OIP5-AS1的m6A修飾介導(dǎo)hnRNPA1泛素化和降解，促進(jìn)胃癌的糖酵解、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移

       opa相互作用蛋白5反義轉(zhuǎn)錄物1 （OIP5-AS1）在胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。然而，OIP5-AS1的詳細(xì)分子機(jī)制尚未完全闡明。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1在胃癌組織和細(xì)胞系中特異性高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。OIP5-AS1的缺失抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和糖酵解，而OIP5-AS1的異位表達(dá)則產(chǎn)生相反的影響。同時(shí)，敲低OIP5-AS1抑制了患者來(lái)源的異種移植模型的腫瘤生長(zhǎng)，并抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移。機(jī)制上，IGF2BP3通過(guò)OIP5-AS1上的N6 -甲基腺苷（m6A）修飾位點(diǎn)與OIP5-AS1結(jié)合，從而穩(wěn)定OIP5-AS1。此外，OIP5-AS1阻止Trim21介導(dǎo)的hnRNPA1泛素化降解，穩(wěn)定hnRNPA1蛋白，并通過(guò)調(diào)控PKM2信號(hào)通路促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展。該研究于2023年10月發(fā)表在《Gastric Cancer》，IF：7.4。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. OIP5 - AS1的高表達(dá)與胃癌患者的臨床指標(biāo)密切相關(guān)

       初步分析GEPIA STAD數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)與癌旁非腫瘤組織相比，OIP5-AS1在胃癌組織中顯著升高（圖1A）。采用qRT-PCR檢測(cè)OIP5-AS1在90對(duì)胃癌及相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織（圖1B）。檢測(cè)OIP5-AS1表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1與TNM階段、T階段和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（圖1C-E）。在年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面未觀察到顯著差異（圖1E-G）。此外，Kaplan-Meier分析表明，與OIP5-AS1表達(dá)水平較低的患者相比，OIP5-AS1表達(dá)水平較高的患者總體生存率較差（圖1H）。與人正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1相比，OIP5-AS1在胃癌細(xì)胞株（MGC-803、BGC-823、SGC-7901和AGS）中的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖1I），與臨床結(jié)果一致。最后，使用FISH和亞細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證OIP5-AS1在胃癌細(xì)胞中是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)lncRNA（圖1J， K）。

圖1. OIP5-AS1的高表達(dá)水平與胃癌患者的臨床參數(shù)密切相關(guān)

2. OIP5 - AS1加速體外細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成以及體內(nèi)腫瘤形成

       為研究OIP5-AS1在GC細(xì)胞中的調(diào)控作用，使用慢病毒載體在MGC-803細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)OIP5-AS1，并在AGS細(xì)胞中使用兩個(gè)不同的shRNA序列穩(wěn)定沉默OIP5-AS1（圖2A）。CCK-8和EdU分析顯示，敲除OIP5-AS1顯著減弱細(xì)胞增殖能力，而過(guò)表達(dá)OIP5-AS1則促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖2B-D）。同樣，OIP5-AS1缺陷降低細(xì)胞的克隆形成能力，而OIP5-AS1過(guò)表達(dá)促進(jìn)GC細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖2E，F(xiàn)）。此外，下調(diào)OIP5-AS1顯著降低Cyclin D1和CDK2的表達(dá)，同時(shí)增加p21和p27的表達(dá)，這在OIP5-AS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中得到驗(yàn)證（圖2G）。為驗(yàn)證OIP5-AS1在體內(nèi)對(duì)胃癌腫瘤生長(zhǎng)的影響，利用新鮮胃癌組織建立患者來(lái)源的異種移植模型，尾靜脈接種sh-OIP5-AS1或shNC慢病毒。沉默OIP5-AS1組產(chǎn)生的腫瘤體積和重量均顯著低于對(duì)照組（圖2H-K）。此外，IHC分析顯示，sh- OIP5-AS1處理組中增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)降低（圖2L）。此外，與對(duì)照組相比，OIP5-AS1被阻斷后，移植瘤中OIP5-AS1的表達(dá)明顯下調(diào)（圖2M）。

圖2. OIP5-AS1在體外促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成，在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤形成

3. OIP5-AS1在體外促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，在體內(nèi)促進(jìn)胃癌移植瘤的轉(zhuǎn)移

       隨后，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)研究OIP5-AS1在胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為中的作用。如圖3A所示，沉默OIP5-AS1的表達(dá)被顯著抑制，而強(qiáng)制OIP5-AS1的表達(dá)增強(qiáng)GC細(xì)胞的遷移能力。同樣，OIP5-AS1沉默細(xì)胞的侵襲速度明顯較慢，而OIP5-AS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的侵襲速度比相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞快（圖3B）。western blot結(jié)果顯示，沉默OIP5-AS1上調(diào)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白e -鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)，下調(diào)n-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和slug表達(dá)，但過(guò)表達(dá)OIP5-AS1具有相反的作用（圖3C）。為研究OIP5-AS1在體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，作者將熒光素酶標(biāo)記的Ctrl-、OIP5-AS1-、sh-OIP5-AS1-或shNC轉(zhuǎn)染細(xì)胞注射到NOD-SCID小鼠的尾靜脈中。圖3D， E 顯示OIP5-AS1沉默組小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)顯著減少，而OIP5-AS1過(guò)表達(dá)組小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)顯著增加。

圖3. OIP5-AS1在體外促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，在體內(nèi)促進(jìn)移植瘤的轉(zhuǎn)移

4. OIP5 - AS1調(diào)控胃癌細(xì)胞中的Warburg效應(yīng)

       進(jìn)行葡萄糖攝取、乳酸和海馬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OIP5-AS1是否影響有氧糖酵解。正如預(yù)期的那樣，沉默OIP5-AS1的細(xì)胞顯示出葡萄糖攝取和乳酸生成的顯著下降。然而，過(guò)表達(dá)OIP5-AS1的細(xì)胞增加葡萄糖攝取和乳酸生成（圖4A，B）。此外，敲低OIP5-AS1抑制糖酵解和糖酵解能力，而OIP5-AS1過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)GC細(xì)胞的糖酵解和糖酵解能力（圖4C）。OIP5-AS1敲低顯著增加ATP生成和最大呼吸，而強(qiáng)制表達(dá)OIP5-AS1可降低這些因子（圖4D）。采用糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖（2-DG）評(píng)估OIP5-AS1是否通過(guò)調(diào)節(jié)有氧糖酵解影響細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。在CCK-8和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，2-DG處理抑制OIP5-AS1敲除和OIP5-AS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移（圖4E，F(xiàn)）。

圖4. OIP5-AS1調(diào)控GC細(xì)胞的Warburg效應(yīng)

5. IGF2BP3以依賴m6A的方式調(diào)控OIP5 - AS1的表達(dá)

       在AGS細(xì)胞中，IGF2BP3直接與OIP5-AS1結(jié)合，如RNA下拉實(shí)驗(yàn)所示（圖5A）。隨后的RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IGF2BP3抗體在AGS細(xì)胞中對(duì)OIP5-AS1的富集，證實(shí)IGF2BP3與OIP5-AS1之間的相互作用（圖5B）。利用SRAMP（m6A修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)因子）預(yù)測(cè)OIP5-AS1序列中的經(jīng)典m6A基序（GAACT），從而推測(cè)OIP5-AS1在AGS細(xì)胞中可能存在m6A修飾。采用MeRIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OIP5-AS1中m6A修飾（圖5C）。此外，RNA pull-down實(shí)驗(yàn)顯示，突變OIP5-AS1中的m6A基序后，IGF2BP3與OIP5-AS1的結(jié)合顯著下降，表明IGF2BP3與OIP5-AS1的結(jié)合依賴于m6A修飾（圖5D）。METTL3是一種重要的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，被稱為m6A writer，在胃癌組織中高表達(dá)，與患者的不良預(yù)后相關(guān)。因此，在GC細(xì)胞中敲低IGF2BP3或METTL3，以研究IGF2BP3是否調(diào)節(jié)OIP5-AS1的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)IGF2BP3的表達(dá)顯著降低（圖5E）。然后，使用轉(zhuǎn)錄抑制劑Actinomycin D處理來(lái)研究OIP5-AS1隨時(shí)間的穩(wěn)定性。IGF2BP3的沉默導(dǎo)致OIP5-AS1的穩(wěn)定性和半衰期明顯降低（圖5F）。同樣，METTL3的缺失顯著縮短OIP5-AS1的半衰期（圖5F）。與對(duì)照組相比，在使用IGF2BP3或m6A特異性抗體進(jìn)行RIP檢測(cè)時(shí)，METTL3敲低顯著影響OIP5-AS1的富集（圖5G，H）。

圖5. IGF2BP3以依賴m6A的方式調(diào)控OIP5-AS1的表達(dá)

6. IGF2BP3通過(guò)OIP5?AS1調(diào)節(jié)GC細(xì)胞的生物活性

       將siIGF2BP3和OIP5-AS1慢病毒共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，探討IGF2BP3是否參與OIP5-AS1介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能。qRT-PCR結(jié)果表明，在GC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OIP5-AS1后，si-IGF2BP3轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的OIP5-AS1表達(dá)水平部分升高（圖6A）。IGF2BP3敲低顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而這些作用可被OIP5-AS1上調(diào)逆轉(zhuǎn)（圖6B-G、7A、B）。此外，IGF2BP3沉默細(xì)胞中葡萄糖攝取、乳酸生成、糖酵解、糖酵解能力下降、ATP生成增加和最大呼吸作用可被OIP5-AS1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)（圖7C-E）。這些結(jié)果表明，OIP5-AS1抑制劑部分介導(dǎo)IGF2BP3的癌基因效應(yīng)。

圖6. IGF2BP3通過(guò)OIP5- AS1調(diào)節(jié)GC細(xì)胞的生物活性

圖7. IGF2BP3通過(guò)OIP5-AS1調(diào)控GC細(xì)胞侵襲、EMT和葡萄糖代謝

7. OIP5 - AS1通過(guò)阻斷Trim21介導(dǎo)的hnRNPA1泛素化和降解來(lái)增強(qiáng)hnRNPA1的穩(wěn)定性

       RNA pull-down和RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)OIP5-AS1可能與hnRNPA1相互作用（圖8A，B）。根據(jù)截?cái)鄬?shí)驗(yàn)，hnRNPA1與OIP5-AS1的0 ~ 500 nt片段結(jié)合（圖8C）。檢測(cè)敲低OIP5-AS1的AGS細(xì)胞和過(guò)表達(dá)OIP5-AS1的MGC-803細(xì)胞中hnRNPA1的表達(dá)水平，進(jìn)一步闡明OIP5-AS1與hnRNPA1相互作用的分子機(jī)制。觀察到，在OIP5-AS1沉默和OIP5-AS1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，hnRNPA1 mRNA水平保持不變（圖8D）。然而，在OIP5-AS1下調(diào)的細(xì)胞中，hnRNPA1蛋白水平顯著降低，而在OIP5-AS1上調(diào)的細(xì)胞中，hnRNPA1蛋白水平顯著升高（圖8E）。蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，敲低OIP5-AS1可以顯著縮短GC細(xì)胞中hnRNPA1蛋白的半衰期，而過(guò)表達(dá)OIP5-AS1則顯著增加hnRNPA1蛋白的半衰期（圖8F，G）。此外，當(dāng)使用蛋白酶體抑制劑MG132處理GC細(xì)胞時(shí)，OIP5-AS1沉默后hnRNPA1蛋白水平的下降被減弱，而OIP5-AS1過(guò)表達(dá)則有相反的效果（圖8H）。此外，OIP5-AS1敲低細(xì)胞的hnRNPA1泛素化水平增加，而OIP5-AS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的hnRNPA1泛素化水平降低（圖8I），表明OIP5-AS1參與胃癌細(xì)胞中hnRNPA1的蛋白酶體依賴性降解。此外，OIP5-AS1敲低增強(qiáng)PKM1的表達(dá)，同時(shí)降低PKM2的表達(dá)（圖8J）。相反，強(qiáng)制表達(dá)OIP5-AS1降低PKM1的表達(dá)，增加PKM2的表達(dá)（圖8J）。如圖8K所示，與GES-1細(xì)胞相比，GC細(xì)胞系中Trim21的表達(dá)水平低，hnRNPA1的表達(dá)水平高。此外，盡管OIP5-AS1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，但在Trim21過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，hnRNPA1的表達(dá)水平被下調(diào)（圖8L，M）。進(jìn)行CO-IP檢測(cè)，觀察到在AGS細(xì)胞中，Trim21與hnRNPA1結(jié)合（圖8N）。此外，當(dāng)OIP5-AS1被沉默或過(guò)表達(dá)時(shí)，檢測(cè)Trim21和hnRNPA1之間的關(guān)聯(lián)。OIP5-AS1的下調(diào)顯著改善，而OIP5-AS1的上調(diào)降低Trim21和hnRNPA1的相互作用（圖8O）。

圖8. OIP5-AS1通過(guò)阻斷Trim21介導(dǎo)的hnRNPA1泛素化和降解增強(qiáng)hnRNPA1的穩(wěn)定性

8. hnRNPA1介導(dǎo)胃癌細(xì)胞中OIP5-AS1的調(diào)控 

       為驗(yàn)證OIP5-AS1是否影響HNRNPA1調(diào)控的胃癌細(xì)胞功能，進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，sh-OIP5- AS1下調(diào)的hnRNPA1和PKM2蛋白表達(dá)以及上調(diào)的PKM1蛋白表達(dá)可以被hnRNPA1過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn)（圖9A），但在hnRNPA1沉默后，OIP5-AS1過(guò)表達(dá)所誘導(dǎo)的hnRNPA1和PKM2蛋白表達(dá)增加以及PKM1蛋白表達(dá)降低被消除（圖11A）。hnRNPA1的強(qiáng)制表達(dá)部分恢復(fù)OIP5-AS1敲低介導(dǎo)的GC細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的抑制（圖9B-G，10A，B），而hnRNPA1的抑制部分逆轉(zhuǎn)OIP5-AS1上調(diào)誘導(dǎo)的GC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用（圖11B-G，12A，B）。此外，hnRNPA1的刺激恢復(fù)降低的葡萄糖攝取、乳酸生成、糖酵解和糖酵解能力。同時(shí)增強(qiáng)OIP5-AS1沉默引起的ATP生成和最大呼吸（圖10C-F）。然而，hnRNPA1下調(diào)消除OIP5-AS1過(guò)表達(dá)引起的葡萄糖攝取、乳酸生成、糖酵解和糖酵解能力升高，并降低ATP生成和最大呼吸（圖12C-F）。綜上所述，OIP5-AS1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hnRNPA1發(fā)揮致癌作用。

圖9. hnRNPA1介導(dǎo)GC細(xì)胞中OIP5-AS1的調(diào)控

圖10. hnRNPA1介導(dǎo)OIP5-AS1對(duì)GC細(xì)胞侵襲、EMT和糖代謝的調(diào)節(jié)

圖11. 沉默hnRNPA1抑制OIP5- AS1對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的促進(jìn)作用

圖12. 敲低hnRNPA1可逆轉(zhuǎn)OIP5-AS1對(duì)MGC823細(xì)胞侵襲、EMT和糖酵解的促進(jìn)作用

結(jié)論

       綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)m6A修飾穩(wěn)定的OIP5-AS1通過(guò)抑制Trim21介導(dǎo)的HNRNPA1泛素化和降解促進(jìn)胃癌進(jìn)展，導(dǎo)致PKM2形成。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們對(duì)胃癌中IGF2BP3/OIP5-AS1/Trim21/hnRNPA1/PKM2軸的理解，并提示OIP5-AS1可能為胃癌的診斷和治療開辟一個(gè)潛在的新視角。

實(shí)驗(yàn)方法

質(zhì)粒，慢病毒和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞培養(yǎng)，qRT?PCR，WB，IHC和HE染色，CCK-8，EdU實(shí)驗(yàn)，菌落形成，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，傷口愈合實(shí)驗(yàn)，RIP，Co?IP，RNA pulldown和截?cái)鄬?shí)驗(yàn)，RNA穩(wěn)定性測(cè)定，泛素化分析，MeRIP，葡萄糖攝取和乳酸測(cè)定，亞細(xì)胞RNA分離，細(xì)胞外酸化速率和耗氧量測(cè)定，患者來(lái)源的異種移植模型，體內(nèi)動(dòng)物模型轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定

參考文獻(xiàn)

Xie R, Liu L, Lu X, He C, Yao H, Li G. N6-methyladenosine modification of OIP5-AS1 promotes glycolysis, tumorigenesis, and metastasis of gastric cancer by inhibiting Trim21-mediated hnRNPA1 ubiquitination and degradation. Gastric Cancer. 2023 Oct 28. doi: 10.1007/s10120-023-01437-7. Epub ahead of print. PMID: 37897508.