包裹線粒體的融合脂質體作為治療骨關節(jié)炎有前景的遞送系統

       利用線粒體（MT）治療人類疾病已經進行了許多嘗試；然而，MT很大，因此很難有效傳遞。因此，建立了基于膜融合的轉移策略。設計并合成了融合線粒體膠囊（FMCs），其包含中性脂質（PE）、陽離子脂質（DOTAP）、芳香族脂質（Liss Rhod PE）和三種類型的脂質體（FMC0、FMC1和FMC2）。影響膜融合效率的DOTAP含量在不同的FMC制劑中有所不同。通過DLS、TEM和AFM分析這些FMC的特征，并分別通過FRET、mtDNA拷貝數和CLSM確認FMC-MT和FMC軟骨細胞之間的封裝和融合效率。與裸MT相比，FMCs向軟骨細胞的輸送速度更快、效率更高。此外，融合是一種比內吞作用更穩(wěn)定的遞送方式，這一點從減少了對線粒體自噬的誘導而得到了證明。體外和體內實驗表明，FMCs減少炎性細胞因子和MMP13的表達，增加細胞外基質成分的表達，促進軟骨再生。這些發(fā)現表明，FMCs是一種非常有效和有前途的MT遞送策略，以促進軟骨再生，并突出了它們作為MT轉移治療的新平臺的潛力。本研究于2023年10月發(fā)表在《Biomaterials》期刊上，IF=14.0。

主要技術路線

主要研究結果

1、FCs和FMCs的表征及MT包封評價

       在這項研究中，作者從干細胞裂解后獲得的核/MT/細胞質中分離出MT（裸（n）MT）。為了確認分離線粒體的純度，采用Western blot方法鑒定每個部分中的標記蛋白。核膜蛋白Lamin B1被鑒定為核分離標記，細胞骨架蛋白α-微管蛋白被鑒定為細胞質分離標記，線粒體外膜蛋白TOMM20被鑒定為線粒體分離標記。因此，可以確定在每個片段中都表達了相應的標記物，并以此驗證線粒體分離良好。為了證實分離的MT的功能，作者測量了裂解物中ATP的量，以及細胞色素C氧化酶（CCO）的表達；兩者都隨著MT數量的增加而增加。這表明從干細胞分離的MT在細胞外的功能是正常的。

       陽離子脂質體被用作運送核酸的載體，核酸是一種陰離子物質，其中一個典型的例子是lipofectamine。受此啟發(fā)，作者假設陽離子脂質體將有利于負離子線粒體的傳遞，并進行了這項研究。為了穩(wěn)定地包封陰離子MT，作者制造了融合越來越多的陽離子脂質DOTAP的促聚變膠囊（FC）。圖1A提供了該方法的簡要說明。脂質體包括PE、Liss Rhod PE和DOTAP。作者改變陽離子脂質DOTAP的比例為0、1和2。Liss Rhod PE發(fā)出紅色熒光，使作者能夠對脂質體進行詳細成像。

       首先，作者用CLSM從形態(tài)上證實了MTs被包裹在FCs中（圖1B）。用Mitotracker Green標記的MT被包裹在脂質體中，綠色熒光與羅丹明（脂質體）的紅色熒光重疊。這些重疊的（黃色）信號表明許多MT被包裹在脂質體中。此外，體素圖像顯示，脂質體中的MT是穩(wěn)定的。這些結果表明，FC和FMC的形狀沒有差異，表明FMC包裹線粒體保持了穩(wěn)定的結構。

       為了定量比較MT的包埋效率，進行了FRET（熒光共振能量轉移）分析（圖1C）。MT用綠色Mitotracker標記（λex=490/λem=516），脂質體用Liss Rhod PE標記（λex=560/λem=583）。利用488 nm激光激發(fā)并測量發(fā)射波長范圍為520~650 nm的曲線圖，計算了FRET效率。含DOTAP量最高的FMC2對MT的包封率最高，且隨DOTAP含量的增加而增加?？傮w而言，陽離子脂質體FMC1和FMC2的包封率高于陰離子脂質體FMC0。陽離子脂質體與陰離子線粒體相互作用的條件更有利，其效率與DOTAP的量成正比。因此，基于DOTAP的陽離子脂質體可以作為線粒體膠囊的假設得到了證實。

       接下來，進行了篩選實驗，以確定MT與FC的最佳包封率。作者發(fā)現1：2的比例是最有效的。這一結果得到了異質性分析的驗證，結果表明，以此MT與脂質體的比例制備的FMCs中，大鼠線粒體DNA在細胞中的表達最高。因此，在隨后的所有實驗中，作者都使用了這個比率，并將得到的被包裹的線粒體膠囊稱為FMC2。

       接下來，利用原子力顯微鏡（AFM）（圖1D）研究了不同DOTAP比率的FCs的物理性質。FCs的直徑相似（600-700 nm），但高度不同：FC0測量130 nm，FC1測量50 nm，FC2測量18 nm。相應的RQ值分別為49.85、17.31和7.56。這些結果證實了FCs的柔性與DOTAP的量成正比，而其剛性與DOTAP的量成反比。這些發(fā)現突出了DOTAP含量和靈活性對于優(yōu)化脂質體MT包封率的重要性。綜上所述，這些結果表明FMC2是最佳制劑。

       FCs和FMCs用透射電子顯微鏡（TEM）成像（圖1E）。在形態(tài)上，FCs和FMCs的形態(tài)沒有差異，表明包裹線粒體的FMCs保持了穩(wěn)定的結構。

       此外，作者通過動態(tài)光散射（DLS）測量脂質體大小的變化，間接證實了這些MT被包裹到FCs中。不含MT的FCs（MT非囊化，僅脂質體）小于含有線粒體（MT囊化）的FMCs（圖1F）。約25 ~ 80nm的大小變化表明脂質體隨著MT的包封而變大。

       接下來，作者研究了DOTAP的量如何影響MT包裹后脂質體的Zeta電位（ZP）（圖1G）。MT本身具有約38 mV的負電荷；然而，脂質體中帶正電荷的脂類攜帶+40 mV或更多的高電荷。當帶正電的DOTAP的比例增大時，ZP增大。使用含有DOTAP的陽離子脂質體（FC1和2）有利于包裹MT，因為它比陰離子脂質體（FC0）更容易通過靜電作用與MT的陰離子膜結構反應。此外，與陰離子NMT或FMC0相比，陽離子FMC1和2有望與細胞膜更有利地相互作用。

圖1 FCs和FMCs的表征，以及FCs的NMT封裝

2、FMCs及其內部線粒體的穩(wěn)定性與NMT的比較

       接下來，作者研究了FCs和FMCs隨時間的結構穩(wěn)定性，并與nMT進行了比較（圖2）。將制備的FCs和FMCs分別在緩沖溶液中保存12周和5天，并用DLS測量包膜形成的保留程度（圖2A）。結果證實，無論DOTAP比率如何，FCS在長達12周的時間內保持其原始大?。ㄗ髨D）。通過這些結果，作者強調，作者生產的融合蛋白膠囊結構穩(wěn)定，可以長期儲存。然而，nMT的大小從第3天開始顯著增加（右圖）。作者確定，這種結構不穩(wěn)定的現象可能是線粒體分解的開始，也可能是生理/生理功能障礙的跡象。換句話說，從第3天開始就確定了nMT的生存能力。因此，確定長期檢查FMC的穩(wěn)定性是沒有意義的，并對穩(wěn)定性進行了長達5天的評估。結果表明，脂質體在包裹MT后的第5天內，其大小基本保持不變，說明脂質體的穩(wěn)定性在5天內沒有明顯變化，這是因為脂質體的陽離子性質阻止了靜電斥力的融合。

       為了直觀地證實這些結果，作者用CLSM觀察了第0天和第3天nMT和FMCs的形態(tài)（圖2B）。在第0天，nMT和FMCs分布均勻；特別是體素成像證實MT被很好地包裹在FMCs中。體素圖像是指對z堆疊圖像中的每個像素進行三維重建，從而創(chuàng)建3D表示。在第3天，由于MT之間的聚集，溶液中的nMT大小增加。相比之下，FMCs的分布保持穩(wěn)定，包埋形式保持良好。進行了透射電子顯微鏡檢查，以進一步澄清在第3天觀察到的變化（圖2C）。對于以前的結果，FMCs保持了它們的形態(tài)和分布，但nMT形成了聚集體，有些已經被破壞。

       上述結果表明，在體外條件下，FMC提高了MT的物理穩(wěn)定性。然而，由于這些結果不能顯示包裹在FMC內的MT的活性，作者檢查了線粒體細胞色素C（CytoC）的表達水平，以評估MTs的活性（圖2D）。眾所周知，當細胞從MT內部泄漏到外部時，細胞凋亡就開始發(fā)生，當MT處于不健康狀態(tài)時，就會發(fā)生細胞C泄漏。制備nMT和FMC2，在4?C培養(yǎng)一天，第二天（第1天）裂解標本并進行分析。由于TOMM20的表達類似于nMT和FMC2，因此可以看出它含有相同數量的MT。然而，已證實FMC2的線粒體CytoC表達水平大約是nMT的兩倍。由于這意味著在nMT中發(fā)生了大量的CytoC滲漏，因此可以判斷存活的可能性很低。基于這些結果，證實了FMC2在體外一天的狀態(tài)下能夠增加MT的結構穩(wěn)定性和活性。

圖2 與nMT比較，評價FMCs的穩(wěn)定性及其內部線粒體的穩(wěn)定性

3、應用FMC對線粒體遞送方法的評價

3.1.FMCS轉導脂多糖處理的C28/I2細胞

       接下來，作者使用WST-1試驗評估脂質體遞送系統的細胞毒性（圖3A）。通過處理高達75μg的細胞來評估三種類型的FC；在這個劑量下，FC1沒有顯示出細胞毒性。30μg的FC0和FC2對細胞的存活率>80%，7.5、15和30μg的FC2對細胞的存活率最高可達4h，但沒有明顯的細胞毒性。此外，作者還將細胞暴露于FCs（4和8 μg）0.5h和1h，以觀察融合效率。融合后1h的融合效率高于0.5h，8 μg的FCs融合效率高于4μg的FCs，在此基礎上，作者進一步實驗采用8μg的FC劑量。

       CLSM驗證融合基因MT的傳遞（圖3B）。受體C28/I2細胞中的MT被染成藍色，來自供體MSCs的MT被染成綠色，FMCs被標記為紅色。受體MTs(藍色)的熒光強度相似，但來自FMC1和FMC2的供體MTs(綠色)的信號比來自nMTs和FMC0的信號強得多。紅色熒光強度(代表融合效率)也被測量，結果證實FMC2表現出最有效的融合MT遞送。

       最后，為了定量地驗證這一現象，分析了異種MT（圖3C）交付后的mtDNA拷貝數。由于受體細胞（C28/I2）是人類來源的，供體（異種）MT是從大鼠來源的成肌細胞L6細胞系中分離出來的。4μg MTs給藥后1h，FMC1和FMC2給藥的大鼠細胞內MT比nMT多，4h后以FMC2給藥最多。相比之下，nMT和FMC0遞送的數量要少得多，1h和4h的水平相似。因此，FMC2是在最短時間內遞送最大數量MT的平臺。

       通過監(jiān)測與脂多糖處理的C28/I2細胞的膜融合，作者確認FMC2是最有效的MT遞送平臺（圖3D）。在圖3D中，綠色信號表示質膜（PM），青色信號表示傳送的MT，紅色信號表示FMC2。與未經處理的（NT）細胞不同，暴露于nMT和FMC2的細胞胞漿中含有MT。

       此外，暴露于FMC2的細胞中的綠色和紅色信號重疊，表示膜融合（黃色）。同樣，即使細胞暴露在空的（無MT）FC2膠囊中，也會發(fā)生膜融合。綜上所述，這些結果表明，nMT和FMC0通過內吞途徑傳遞，FMC1和FMC2通過膜融合途徑傳遞，提示后一種方法是更有利的策略。

圖3 FMCs的細胞膜融合比NMT的內吞作用提供線粒體的速度更快，數量更多

3.2 MT的胞內和膜融合傳遞途徑的差異

       如上所述，有兩種途徑可以將MT通過NMT和FMC2輸送到細胞中（圖4A）。內吞作用是將外來物質輸送到細胞內的一種常見機制；然而，當外來物質通過內吞作用輸送時，它必須從內吞體內逃逸，因為剩下的任何物質都會被溶酶體移走并降解。因此，通過內吞作用進入細胞質的MT有被降解的風險。相比之下，由FMCs交付的MT不會經歷這一過程。相反，FMCs與細胞膜融合，形成一個通道，允許將包裹的MT直接輸送到細胞質。

       用CLSM（圖4B）觀察了用這兩種方法運送到細胞的線粒體的命運。線粒體用MitoTracker染成藍色，早期內體（EE）染成綠色，FMC2染成紅色。未觀察到nMT的脂質體信號。僅觀察到EE和MT信號。圖4B中的裁剪圖像顯示了EE和MT信號的重疊（青色；由紅色箭頭表示）。此外，直線剖面圖顯示綠色峰和藍色峰重疊（紅色突出顯示）。相反，FMC2脂質體信號遍布細胞膜，證實融合發(fā)生，EE和MT信號是分開的（黃色箭頭）。同樣，線條輪廓也不重疊（黃色突出顯示）。這些結果證實了NMT通過內吞作用進入細胞，FMC2通過膜融合傳遞MT。

       nMT和FMC2的關鍵區(qū)別在于它們通過內小體進入細胞，而FMC2通過膜融合傳遞MT。因此，作者接下來檢查了內體pH的影響。作為MT膜電位指標的JC-1染色證實，與pH 7.4相比，在pH 5.5（晚期內吞體內的pH）時，MT膜電位降低。這意味著MT可能暴露在酸性條件下，導致功能不佳。因此，內吞作用并不是MT傳遞的最佳方式。

       通常情況下，如果溶酶體中的外來物質沒有逃逸，它們會被溶酶體清除。因此，為了確認傳遞的MTs是否被消化在細胞質中，作者將溶酶體染色為綠色，并用CLSM觀察細胞（圖4C）。對于nMT，大量的MT與溶酶體重疊，形成青色信號（紅色箭頭）；這種重疊被線條輪廓（紅色突出顯示）證實。這意味著傳遞的MT被溶酶消化。相反，成像和線條輪廓結果顯示，FMC2信號與MT和溶酶體信號（黃色突出顯示）明顯分開。

       線粒體自噬是啟動線粒體消化過程的消化器官。基于此，作者認為評估線粒體自噬標志物的表達水平將確定轉移到細胞中的線粒體的命運（圖4D）。因此，Parkin和LC3B在FMC2中的表達水平均低于nMT，這是一個顯著的結果。這顯示了與圖4C中的結果相同的圖案?；谶@些結果，證實了當線粒體通過內吞作用遞送時，相當數量的線粒體被溶酶體或線粒體自噬消化。另一方面，由于FMC2避免了這一過程，可以假設轉移的線粒體有更高的存活機會。因此，FMC2作為運送線粒體的轉運體，確保了一條安全的運送路線。

       通過在低溫（4?C）下抑制細胞膜活性，作者比較了nMT和FMC2傳遞MT的效率（圖4e）。數據顯示，在4?C時，nMT的效率是37?C的一半。然而，FMC2在這兩種溫度下的效率是一樣的。因此，即使細胞膜活性降低，FMC2也能傳遞MT。此外，作者比較了內吞抑制條件下線粒體的傳遞效率，以證實FMC通過膜融合傳遞到細胞的說法。

       抑制條件如下：4?C（細胞膜彈性和三磷酸腺苷合成抑制）、阿米洛利（阿米洛利、巨噬細胞吞噬抑制）、CPM（氯丙嗪、網織蛋白介導的內吞抑制）和FLP（非線菌素、小窩介導的內吞抑制）。抑制內吞作用減少了NMT對C28/I2細胞的輸送。然而，FMC2的交付沒有受到影響。這表明FMC2可以將貨物運送到細胞膜活性較低的細胞。這些數據再次表明，與細胞膜融合是一種比內吞作用更有利的策略。

圖4 nMT和FMC2使用的線粒體傳遞途徑的差異，以及傳遞的線粒體的命運

4、2D OA模型（內毒素處理的C28/I2細胞）線粒體交付后細胞功能的恢復

       以軟骨細胞系C28/I2為研究對象，采用體外培養(yǎng)的方法建立骨性關節(jié)炎模型。用內毒素作為損傷誘導劑，誘導OA樣細胞的形成。已知脂多糖可誘導病理反應，如核因子-κB的磷酸化和細胞內炎性細胞因子的產生。首先，作者建立了一個二維OA模型，以確定C28/I2細胞是否受到內毒素的損傷。結果證實，內毒素刺激后，Ⅱ型膠原（Col II）表達減少，基質金屬蛋白酶-13（MMP13）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達增加。研究還證實，線粒體功能障礙是由ATP含量下降引起的。接下來，作者檢查了MT交付到2D OA模型后細胞恢復的程度（圖5A）。nMT和FMC2作用于細胞后，Col II的表達增加，而FMC2則降低了MMP13的表達。這一作用是通過抑制傳遞的MT對NF-κB的磷酸化而實現的。

       用qRT-PCR檢測MT交付后編碼IL-6和TNF-α的mRNA的表達變化（圖5C），這是已知的OA相關炎癥因子。結果表明，MT介導的C28/I2細胞可減少這些炎癥因子的表達，表明MT恢復了最佳的細胞功能。FMC2的這種影響更加明顯，證實了FMC2在傳遞MT和減少炎癥方面更有效。

       此外，作者還用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測了分泌性炎癥因子的表達（圖5D）。注射MT后，經內毒素處理的C28/I2細胞分泌炎癥因子的能力下降。與上述結果一致，FMC2比NMT更有效地恢復受損軟骨細胞的正常功能。綜上所述，這些數據表明MT轉移術是治療骨性關節(jié)炎的一種有前途的方法。此外，經FMC2途徑給藥的細胞修復效果好于nMT，提示FMC2是修復受損軟骨細胞功能的更有效的方法。

圖5 FMC2介導的線粒體對脂多糖處理的C28/I2細胞的治療效果的2D模型

5、內毒素誘導的軟骨細胞移植后三維培養(yǎng)功能恢復的實驗研究

       將脂多糖處理的C28/I2細胞進行三維培養(yǎng)，檢測細胞的聚集和分化能力。如圖6A所示，內毒素處理的C28/I2在三維培養(yǎng)皿中難以形成聚集體。相反，與NT組（未處理組、對照組）相似，nMT和FMC2處理的細胞能夠形成聚集體，并可以進行三維培養(yǎng)。這一趨勢在播種后持續(xù)了10天以上，表明MT不僅能防止脫分化或炎癥，而且還能促進細胞團的生長。此外，細胞聚集體大小的增加表明細胞增殖或細胞外基質的產生可能已被促進。聚集體形成的定量分析表明，MT的存在對細胞聚集體的數量有很大的影響，表明MT對脂多糖造成的損傷具有修復作用。

       在3D培養(yǎng)的8天中，作者檢測了編碼Aggrecan（細胞外基質的軟骨成分）、SOX9（轉錄因子）、COLX（肥大標記）、細胞外基質降解酶MMP3和MMP13以及腫瘤壞死因子α（圖6B）的基因的表達。在FMC2處理的細胞中，AGG的表達水平最高，SOX9的表達水平與NT相似。此外，脂多糖組和正常對照組均表達高水平的COLX、MMP3、MMP13和腫瘤壞死因子α，經FMC2治療后均顯著下降。

       免疫熒光染色顯示，FMC2處理的細胞SOX9（粉紅色）和Col II（綠色，ECM）的表達增加，表明脂多糖造成的損傷已被傳遞的MT修復（圖6C）。此外，FMC2誘導的恢復比NMT誘導的恢復更明顯。相反，脂多糖抑制了SOX9和Col II的表達。這些結果表明，經FMC2注射MT后，受損軟骨細胞可以恢復正常功能。

       總體而言，這些數據表明，MT可以實現受損軟骨細胞的功能恢復，不僅可以緩解炎癥，促進組織生成，還可以促進細胞的生長和分化。這些發(fā)現對開發(fā)新的軟骨再生治療方法具有重要意義。

圖6 3D模型（脂多糖處理的C28/I2球體）評估人工組織形成的程度和FMC2運送的線粒體的治療效果

6、骨性關節(jié)炎動物模型注射FMC的實驗研究

       通過關節(jié)腔內注射MIA建立小鼠骨性關節(jié)炎模型，觀察IA注射nMT和FMC2后的組織修復情況。FMC2注射兩次（Inj.#2）小劑量（LD）每5天注射一次，nMT注射2次（Inj.#2）低劑量或高劑量（HD）和五次（Inj.#5）低劑量（LD）（圖7A）。

       在IA注射后第1天，用激光共聚焦顯微鏡觀察nMT和FMC2的定位，以確定它們是否被輸送到軟骨組織（圖7B）。將被輸送到軟骨的MT被標記為Mitotracker Deep Red，并進行了兩次劑量的測試。在nMT組，在低劑量時很少觀察到MT信號（綠色），而在高劑量時僅在一個狹窄的區(qū)域內傳遞。相比之下，在FMC2組中，即使在低劑量時也能觀察到FMC（紅色）和MT（綠色）信號，而在高劑量時它們均勻分布在更大的區(qū)域內。這些數據表明，通過FMC2在體內傳遞MT是更好的。

       通過檢測血液中炎癥因子的含量，證實MT的抗炎作用。MIA致炎小鼠血液中的干擾素-γ含量高于野生型（WT）小鼠（圖7C）。然而，當MT通過FMC2給藥時，干擾素-γ的量下降到與WT小鼠相似的水平。這些結果表明，線粒體通過恢復受損炎癥組織的正常功能來減輕炎癥。

       軟骨組織用藏紅花素-O和阿爾新藍染色顯示受損的軟骨組織已修復，如硫酸甘氨酸（橙色）和酸性多糖（藍色）的表達增加（圖7D）。組織學分析注射生理鹽水組（生理鹽水），未見炎性軟骨組織恢復。然而，通過FMC2傳遞的MT使軟骨組織得以恢復。這比相同注射次數的相同劑量的#2 NMT LD恢復得更好，甚至比注射高劑量MT的#2 NMT HD組更有效。在注射相同劑量的NMT比FMC2更頻繁的NMT組（#5 NMT LD），也觀察到一些軟骨的恢復。然而，與FMC2相比，多糖（藍色）和GAGs（橙色）的染色區(qū)域顯得更窄和更弱。這些結果以量化圖表的形式呈現。

       接下來，作者使用Mankin評分評估了MIA誘導的骨性關節(jié)炎模型中軟骨組織損傷的嚴重程度（圖7E）。Mankin評分系統考慮了軟骨結構和蛋白多糖含量，是評估骨性關節(jié)炎嚴重程度的可靠而有效的方法。FMC2組動物的得分與WT組動物相似（約2分），但#2 NMT LD組和#2 nMTHD組的得分為11-13分（與生理鹽水對照組相似）。#5 NMT LD的分數約為6分，相當于中等嚴重程度。這些結果在顯微CT掃描和軟骨下骨體積分析中也得到了證實。損傷軟骨和軟骨下骨的恢復率以FMCs最高。綜上所述，這些數據表明，通過FMC2傳遞的MT在低劑量和低治療頻率下促進有效的軟骨組織再生。

圖7 線粒體導入MIA誘導的骨性關節(jié)炎模型小鼠的軟骨穿透與修復

       在這里，作者描述了一種膜融合方法，作為一種通過含有陽離子脂質的融合脂質體（DOTAP）將MT遞送到靶細胞的策略。根據DOTAP比率分析了FMCs的形態(tài)和特性，并對其包封率、穩(wěn)定性和膜融合效率進行了評價。結果表明，PE：DOTAP比為1：2的FMC2效果最好。作者還進行了體外和體內實驗，以表明膜融合方法比內吞途徑更安全和更快地輸送更多的MT。此外，二維和三維培養(yǎng)系統證實，在MT交付后，ECM成分的軟骨化表達增加，炎性細胞因子的表達減少。MIA誘導的骨性關節(jié)炎模型證實，在低劑量和低頻率的治療條件下，FMC2比nMT更有效。因此，穩(wěn)定的MT膜融合遞送系統在恢復骨關節(jié)炎受損細胞或組織的功能方面具有巨大的潛力。

實驗方法

細胞培養(yǎng)、FC細胞毒性評價、nMT和FMC穩(wěn)定性評價、從供體細胞分離MT

參考文獻

[1] Kim HR, Cho HB, Lee S, Park JI, Kim HJ, Park KH. Fusogenic liposomes encapsulating mitochondria as a promising delivery system for osteoarthritis therapy. Biomaterials. 2023;302:122350.