教你四張圖搞定一篇nature communication

       編碼轉(zhuǎn)錄因子（TF）基因的致病突變可以影響TF與其同源DNA結(jié)合基序的相互作用。TF突變是否以及如何影響與TF復(fù)合元件（CE）的結(jié)合以及與其他TF的相互作用尚不清楚。在這里，作者報(bào)道了B細(xì)胞特異性紊亂的人類淋巴瘤中，特別是經(jīng)典的霍奇金淋巴瘤中TF改變的獨(dú)特機(jī)制。它是由一種復(fù)發(fā)性體細(xì)胞錯(cuò)義突變c.295 T>c（p.Cys99Arg；p.C99R）引起的，該突變靶向干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）的DNA結(jié)合域中心，IRF4是免疫細(xì)胞中一種關(guān)鍵TF。IRF4-C99R從根本上改變了IRF4-DNA的結(jié)合，失去了與經(jīng)典IRF基序的結(jié)合，并獲得了與經(jīng)典和非經(jīng)典IRF CE結(jié)合的新形態(tài)。IRF4-C99R通過阻斷IRF4依賴性漿細(xì)胞誘導(dǎo)徹底改變IRF4功能，并以非經(jīng)典激活蛋白-1（AP-1）-IRF-CE（AICE）依賴性方式上調(diào)疾病特異性基因。這些數(shù)據(jù)解釋了單個(gè)突變?nèi)绾螌?dǎo)致TF特異性和基因調(diào)控的復(fù)雜轉(zhuǎn)換，并為特異性阻斷突變TF的新形態(tài)DNA結(jié)合活性開辟了前景。該研究于2023年11月發(fā)表在《nature communication》，IF 16.6分。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. IRF4-C99R突變?cè)谌祟惲馨土鲋袕?fù)發(fā)

       通過挖掘和整合cHL細(xì)胞系的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，作者在7個(gè)HL細(xì)胞系中的2個(gè)細(xì)胞系，即Bcell衍生的HRS細(xì)胞系L428和U-HO1中，鑒定并驗(yàn)證了IRF4基因中相同的c.295 T>c（chr6:394899 T>c；hg38）突變體（圖1a）?；贏NNOVAR整合的各種計(jì)算機(jī)分析（包括SIFT、Polyphen2、MutationTaster、FATHMM、CADD評(píng)分），一致預(yù)測(cè)該變體是有害的。此外，除了在AA100中攜帶錯(cuò)義突變的單一等位基因（1/251478）外，在影響相鄰AA90-104的gnomAD中沒有發(fā)現(xiàn)種系非同義單核苷酸變體。在HL細(xì)胞系中，c.295 T>c突變等位基因伴有至少一個(gè)野生型（WT）IRF4基因拷貝，并且WT和突變IRF4 mRNA轉(zhuǎn)錄物都同等被檢測(cè)到（圖1a）。由于HRS細(xì)胞在受影響的淋巴結(jié)中很少見，通過激光顯微切割HRS細(xì)胞的DNA-PCR驗(yàn)證了IRF4 c.295 T>c在20個(gè)原發(fā)性cHL樣本中的4個(gè)樣本中存在。IRF4 c.295 T>c最近在原發(fā)性縱隔B細(xì)胞淋巴瘤（PMBCL）中被描述，該淋巴瘤實(shí)體與cHL具有不同的生物學(xué)特征。從486例PMBCL病例的不相關(guān)隊(duì)列中平行挖掘靶向基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，在486例病例中的29例（5.9%）中發(fā)現(xiàn)了相同的IRF4 c.295 T>c突變。相反，IRF4 c.295 T>c在其他淋巴瘤類型中很少被記錄，如DLBCL。此外，C99R c.295 T>c（chr6:394899 T>c；hg38）突變的基因組位置在外顯子3內(nèi)，因此位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TIS）下游>3kb。此外，它缺乏典型的熱點(diǎn)RGYW基序，表明這種突變不是由B細(xì)胞淋巴瘤的異常體細(xì)胞超突變引起的，該突變通常影響TIS下游約2-2.5kb的區(qū)域。

       IRF4在末端B細(xì)胞分化階段控制漿細(xì)胞基因表達(dá)程序，盡管在所有亞型中都有高水平的IRF4表達(dá)，但在HRS細(xì)胞中基本缺乏該程序。在IRF4 c.295 T>c突變中，堿性AA精氨酸取代AA 99位置的中性AA半胱氨酸（Cys；c）（p.Cys99Arg；C99R），其在從人類到斑馬魚的IRF4中高度保守，也在大多數(shù)其他IRF家族蛋白的DBD中高度保守（圖1a）。C99R位于IRF4 DBD的α3-識(shí)別螺旋的中心，并緊鄰Arg98，Arg98對(duì)特異性IRF4 DNA結(jié)合至關(guān)重要。這一發(fā)現(xiàn)表明C99R可能干擾IRF4:DNA復(fù)合物的形成，從而干擾IRF4的轉(zhuǎn)錄活性。

2. IRF4-C99R功能喪失ISRE，但被功能激活

       為表征IRF4-C99R，首先探索了其與干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）的DNA結(jié)合活性，該元件包含三個(gè)共有基序5’-GAA-3’（圖1b），這是IRFs識(shí)別的關(guān)鍵基序之一。與IRF4-WT不同，IRF4-C99R不與ISRE結(jié)合，如電泳遷移率偏移測(cè)定（EMSA）所示。然而，IRF4-C99R突變的復(fù)發(fā)性和在cHL中的高水平表達(dá)表明，這種突變可能不僅構(gòu)成功能喪失的異常，而且可能具有額外的從頭開始的功能。為了分析IRF4-C99R功能，作者產(chǎn)生了四環(huán)素（Tet）誘導(dǎo)的表達(dá)IRF4-C99和IRF4-WT的BJAB B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的大量培養(yǎng)，其僅在低水平下表達(dá)內(nèi)源性IRF4。時(shí)間進(jìn)程基因表達(dá)分析顯示，與IRF4-WT相比，IRF4-C99R改變了一組特殊但較少基因的表達(dá)（圖1c）。這與其失去的結(jié)合經(jīng)典ISRE基序的能力一致。IRF4-C99R與IRF4-WT一樣有效地挽救了HRS細(xì)胞，使其免于由shRNA介導(dǎo)的內(nèi)源性IRF4敲除誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而證實(shí)了其功能。

3. IRF4-C99R從根本上改變了IRF4的DNA結(jié)合特異性

       與在ISRE DNA基序上形成低親和力同源二聚體或多聚體復(fù)合物相反，有效的IRF4 DNA結(jié)合需要不同的伴侶，如CEs25-27的ETS和AP-1蛋白。鑒于cHL中普遍不存在ETS TF，作者認(rèn)為IRF4與HRS細(xì)胞中EICE的結(jié)合是不可能的。然而，具有高水平JUNB和BATF表達(dá)的組成型AP-1活性是HRS細(xì)胞的標(biāo)志。因此，作者推測(cè)IRF4-C99R通過DNA結(jié)合與最近鑒定的AICE來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，間距為4bp 的5’-IRF（TTTC）/nnnn/AP-1（TGASTCA）-3’ （AICE1），或無(wú)間距的5’-IFF（GAAA）/AP-1（TGASTCA-3’（AICE2），它們都調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄程序。為評(píng)估這一假設(shè)，作者監(jiān)測(cè)了在強(qiáng)親和力（標(biāo)記為“AICE1（Ctla4）”）、弱親和力（AICE1（IL12Rb））或中間親和力（AICE2（Bcl11b））AICE的基序條件下IRF4-JUNB/BATF-DNA復(fù)合物的形成（圖1d）。雖然觀察到AICE1（Ctla4）和AICE1的IRF4-C99R結(jié)合完全喪失（稱為AICE結(jié)合模式1（BP1）），但與IRF4-WT（BP2）相比，AICE2（Bcl11b）的IRF4-C99R結(jié)合增強(qiáng)（圖1d）。IRF4-C99RS104T的行為與IRF4-C992R相似（圖1b、d）。引人注目的是，從5’-GAAA-3’到5’-TTTC-3’的AICE2（Bcl11b）中IRF基序的反向互補(bǔ)（稱為AICE2^FLIP）揭示了僅突變體IRF4-C99R-JUNB/BATF-DNA復(fù)合物的形成（圖1e，AICE2^FLIP，BP3）。此外，AICE復(fù)合物的形成通常需要相對(duì)于AICE2位于?4 bp（-4T）的胸腺嘧啶（稱為AICE2^-4T）。IRF4-C99R克服了這種限制，因?yàn)樗诓淮嬖?4T的情況下形成強(qiáng)的DNA結(jié)合復(fù)合物，這導(dǎo)致IRF4-WT結(jié)合的損失（圖1f；AICE2^-4C；BP4）。類似地，與IRF4-WT相比，與c-JUN（JUN）/BATF異二聚體AP-1復(fù)合物一起觀察到IRF4-C99R結(jié)合模式的改變。

       此外，進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模分析以提供關(guān)于IRF4-C99R突變?nèi)绾斡绊懪cISRE和AICE1 DNA結(jié)合基序的相互作用（圖1g）。對(duì)于結(jié)構(gòu)模型，IRF4和DNA的初始結(jié)構(gòu)是從以前的晶體結(jié)構(gòu)（PDB:7JM4）中獲得，并且基于所得的對(duì)接參數(shù)（如HADDOCK評(píng)分、簇大小和去溶劑化能）來(lái)考慮最可行的模型。如圖1g所示，對(duì)于IRF4:ISRE相互作用，用Arg直接取代C99導(dǎo)致與DNA堿基的空間沖突。為了適應(yīng)C99R和ISRE之間的相互作用，dsDNA必須彎曲和/或扭結(jié)。對(duì)于IRF4-C99R:AICE1結(jié)合，較差的對(duì)接得分表明，如較差的能量最小化結(jié)構(gòu)所反映的那樣，極不可能發(fā)生顯著的相互作用。因此，盡管AICE1建?？赡苡捎贒NA畸變而受到限制，但它表明IRF4-C99R不與AICE1結(jié)合，這與作者的EMSA結(jié)果一致。

       在僅包含IRF4（AA 20–139）、JUNB（AA 269–329）和BATF（AA 28–87）的DBD重組蛋白中也觀察到了IRF4-C99R DNA結(jié)合特性的這些改變模式。此外，通過單分子熒光顯微鏡和交錯(cuò)延時(shí)照明觀察了IRF4-C99R或IRF4-WT的DNA結(jié)合片段， IRF4-C99R的長(zhǎng)結(jié)合DNA連接（>2s）的百分比與IRF4-WT相當(dāng)。

圖1：IRF4-C99R功能表征和基本的DNA結(jié)合改變

4. IRF4-C99R淋巴瘤細(xì)胞中IRF4 DNA結(jié)合模式和協(xié)同活性發(fā)生全局改變

       接下來(lái)，為詳細(xì)特異性地繪制HRS細(xì)胞中開放性染色質(zhì)，首先從HRS細(xì)胞系L428（攜帶IRF4-C99R和KM-H2，表達(dá)IRF4-WT）以及作為對(duì)照的非霍奇金、非IRF4表達(dá)REH細(xì)胞中生成高分辨率全基因組DNA酶I超敏位點(diǎn)（DHS）和數(shù)字足跡數(shù)據(jù)。DNaseI切割頻率的分析揭示了對(duì)DNaseI消化的保護(hù)作用，表明蛋白質(zhì)復(fù)合物的占據(jù)，以及僅在HRS細(xì)胞中AICE2（BP2）、AICE2FLIP（BP3）、AICE2?4T和AICE2-4C（BP4）側(cè)翼區(qū)域的可及性提高（圖2a）。值得注意的是，這些基序在L428IRF4-C99R中富集和保護(hù)程度最高（圖2a）。這些AICE2基序在L428IRF4-C99R細(xì)胞中的共定位分析揭示了與AP-1基序共定位的突變體特異性位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的特異性簇，但與通常參與B細(xì)胞和HL細(xì)胞基因調(diào)控的其他TF位點(diǎn)不一致。這些發(fā)現(xiàn)再次支持IRF4-C99R賦予了細(xì)胞不同的表達(dá)譜的。

       為定義L428或KM-H2-特異性DHS組，作者研究了L428IRF4-C99R和KM-H2IRF4-WT細(xì)胞之間的標(biāo)簽計(jì)數(shù)比，并根據(jù)它們?cè)贒NaseI-seq信號(hào)中的倍數(shù)變化對(duì)它們進(jìn)行排序（圖2b）。L428IRF4-C99R-特異性DHS（即第3組）與這些細(xì)胞中上調(diào)的基因表達(dá)相關(guān)（圖2b）。然后確定了AICE2（BP2）、AICE2FLIP（BP3）、AP-1和ISRE基序在不同DHS組中的富集情況。L428IRF4-C99R-特異性DHS富集AICE2、AICE2FLIP和AP-1基序，但缺失ISRE基序，而KM-H2IRF4-WT特異性DHs缺失AICE2，AICE2FLIP和AP--1基序，卻富集ISRE（圖2c）。使用HOMER對(duì)細(xì)胞系特異性DHS中TF基序的搜索結(jié)果顯示，AICE2和AICE2FLIP是L428IRF4-C99R-特異性DHSs中富集度最高的兩個(gè)基序，而不是KM-H2IRF4-WT-特異性DHSs位點(diǎn)（圖2d）。相反，ISRE基序在KMH2IRF4-WT-而不是L428IRF4-C99R-特異性DHS中富集，這再次表明IRF4-C9R轉(zhuǎn)移結(jié)合位點(diǎn)至AICE2基序（圖2d）。L428IRF4-C99R與KM-H2IRF4-WT細(xì)胞DHSs的基因集富集分析（GSEA）顯示，在上調(diào)的基因中，AICE2基序足跡增加，論證了該基序在AICE2 L428IRF4-C99R細(xì)胞中的功能相關(guān)性。

       最后，作者在L428^IRF4-C99R和KM-H2^IRF4-WT細(xì)胞中進(jìn)行了全基因組范圍的JUNB和IRF4 chip-seq分析（圖2e-i）。IRF4-JUNB-ChIP峰內(nèi)的序列緊密聚集（圖2e），并且與KM-H2^IRF4-WT和GM12878細(xì)胞相比，L428^IRF4-C99R細(xì)胞中的序列顯示出更大的重疊（圖2f），這與IRF4-C99 R與IRF和AP-1 CE的強(qiáng)制結(jié)合一致。盡管與GM12878相比，兩個(gè)HRS細(xì)胞系中的IRF4 ChIP峰值頻率更高（圖2f），但在KM-H2^IRF4-WT細(xì)胞中與JUNB的重疊要低得多。當(dāng)單獨(dú)排序時(shí)，IRF4和JUNB在L428^IRF4-C99R中顯示出高度相似的結(jié)合模式，但在KM-H2^IRF4-WT細(xì)胞中沒有，這對(duì)應(yīng)于開放的染色質(zhì)區(qū)域，并與基因表達(dá)增加有關(guān)（圖2g）。與這些分析和DHS數(shù)據(jù)集的基序發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致（圖2h），在L428^IRF4-C99R-特異性IRF4-CIP峰中，AICE2（BP2）和AICE2^FLIP（BP3）基序頻率增加，相反地，與KM-H2^IRF4-WT特異性ChIP峰相比，ISRE基序頻率較低。當(dāng)將L428的IRF4和JUNB染色質(zhì)結(jié)合模式與GM12878細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，也觀察到了這些發(fā)現(xiàn)。重要的是，GSEA揭示了IRF4和JUNB-CIP峰與L428^IRF4-C99R細(xì)胞中基因表達(dá)增加有關(guān)，但與KM-H2^IRF4-WT細(xì)胞中的基因表達(dá)無(wú)關(guān)。

       在ChIP-seq數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)AICE1（BP1）是KM-H2^IRF4-WT細(xì)胞中最重要的基序，但在L428^IRF4-C99R細(xì)胞中未被鑒定到（圖2i）。AICE2（BP2）出現(xiàn)在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中最重要的基序中，在L428^IRF4-C99R細(xì)胞中更為重要，其中共鑒定了五種基序類型（圖2i）。分析還揭示了AICE2FLIP（BP3）在L428^IRF4-C99R細(xì)胞中的獨(dú)特重要性。這些結(jié)果與DNA結(jié)合研究一致（圖1），并進(jìn)一步支持IRF4-C99R從根本上改變了淋巴瘤細(xì)胞中IRF4全基因組DNA結(jié)合模式，并在不同的新AICE上加強(qiáng)與AP-1/JUN TF協(xié)同結(jié)合。

圖2：IRF4-C99R與C99R突變陽(yáng)性淋巴瘤細(xì)胞中規(guī)范和非規(guī)范AICE2位點(diǎn)的全基因組增加和不同的DNA結(jié)合模式有關(guān)

5. IRF4-C99R破壞原代B細(xì)胞中IRF4的功能并重新編程基因表達(dá)

       為進(jìn)一步探索IRF4-C99R在B細(xì)胞中表達(dá)的功能，用IRF4-WT、IRF4-C998R或功能喪失（LOF）突變體IRF4-R98AC99A作為對(duì)照，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)原代小鼠C57BL/6脾臟B細(xì)胞（圖3a）。在已知的IRF4-R98AC99A LOF突變體中，與IRF4:DNA復(fù)合物形成密切相關(guān)的殘基R98和C99都被丙氨酸（A）取代，從而消除IRF（4）的DNA結(jié)合和功能。用LPS和IL?4培養(yǎng)的B細(xì)胞導(dǎo)致強(qiáng)大的內(nèi)源性IRF4表達(dá)，并誘導(dǎo)約30%的漿母細(xì)胞，其特征是CD138高和B220低表型。在非功能性IRF4-R98AC99A變體異位表達(dá)后獲得相同的結(jié)果（圖3a）。IRF4-WT異位表達(dá)后，約70%的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞表型。相反，IRF4-C99R減少了發(fā)育中的漿細(xì)胞數(shù)量，即阻斷了固有漿細(xì)胞形成，這表明IRF4-C99在B細(xì)胞終末分化方面具有主要的負(fù)向調(diào)節(jié)功能（圖3a）。為檢測(cè)基因表達(dá)的變化，作者分離了用不同IRF4變體轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠C57BL/6脾臟B細(xì)胞，然后進(jìn)行RNA-seq分析（圖3b–f）?？傮w而言， IRF4-C99R顯示出與R98AC99A LOF變體相比更類似于IRF4-WT的轉(zhuǎn)錄譜（圖第3b段）。IRF4-C99R調(diào)節(jié)減少的基因集（圖3c），包括IRF4-WT靶基因表達(dá)的廣泛損失以及新靶點(diǎn)的增加（圖3d）。修飾的脾 B 細(xì)胞的 mRNA 表達(dá)譜與來(lái)自各種造血細(xì)胞類型的 mRNA 表達(dá)譜的集成顯示 IRF4-C99R 調(diào)節(jié)整體 IRF4-WT 誘導(dǎo)和漿細(xì)胞特異性基因表達(dá)的阻斷（圖 3e），證實(shí) IRF4-C99R 無(wú)法指導(dǎo) IRF4 定向漿細(xì)胞進(jìn)程。同時(shí)，IRF4-C99R 上調(diào)髓系相關(guān)基因（圖 3e、f）?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了與IRF4-WT相比，IRF4-C99R依賴性基因調(diào)控和功能的根本變化。

圖3：與IRF4-WT相比，IRF4-C99R阻斷IRF4依賴性漿細(xì)胞誘導(dǎo)并調(diào)節(jié)數(shù)量較少但不同的基因

6. IRF4-C99R通過非經(jīng)典AICE激活淋巴瘤特異性基因表達(dá)

       為將IRF4-C99R調(diào)節(jié)的基因與cHL的HRS細(xì)胞特異性固有基因直接聯(lián)系起來(lái)，作者整合了來(lái)自脾臟B細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)與HRS細(xì)胞特異性基因表達(dá)譜（圖4a）。在 IRF4-C99R 僅上調(diào)而非 IRF4-WT 上調(diào)的 HRS 細(xì)胞特異性表達(dá)基因中，GATA3、CCL5（也稱為 RANTES）和 TNFRSF8 （CD30），這三種基因都是最突出的 cHL 標(biāo)志性基因，以及 CD80、PDE4D 和 CASP6（圖 4a）。

       為了進(jìn)一步剖析這些基因的IRF4-C99R特異性誘導(dǎo)機(jī)制，重新分析了L428^IRF4-C99R細(xì)胞特異性IRF4-JUNB ChIP峰的ChIP-Seq數(shù)據(jù)，但在KMH2^IRF4-WT細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)。作者專注于調(diào)控GATA3表達(dá)的區(qū)域，在L428^IRF4-C99R特異性IRF4-JUNB ChIP峰中鑒定了幾個(gè)AICE2樣CE，分別為GATA3Peak_1（5’-TGAGTCAGAGA-3’）、GATA3Peak_2（5’-TAAATGAGTCA-3’）和GATA3Peak_3（5’-GGAATGAGTCA-3’）（圖4b，左）。DNA結(jié)合研究表明，IRF4-C99R在這些位點(diǎn)形成IRF-AP-1復(fù)合復(fù)合物，而IRF4-WT不與這些串行結(jié)合（圖4b，右，AP-1由JUNB/BATF異二聚體組成）。值得注意的是，這些位點(diǎn)均不包含經(jīng)典的5’-GAAA-3’IRF基序，而是包含其非經(jīng)典簡(jiǎn)并變體。這些結(jié)果表明，與C99相比，IRF4 R99在這些基序上的靈活性更高，類似于對(duì)圖1e-g中描述的AICE2變體的觀察。與KM-H2IRF4-WT細(xì)胞相比，在使用ExplaiNN的ChIP-seq數(shù)據(jù)中鑒定的含有IRF基序在L428^IRF4-C99R細(xì)胞中退化得更多，這反映了IRF4-C99 R對(duì)退化的半含ISRE基序的結(jié)合能力的增加（圖 4c），這在 AICE 基序中最為明顯（圖 4c）。通過分析熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體證實(shí)了 IRF4-C99R 介導(dǎo)的 GATA3Peak_1 組件的轉(zhuǎn)錄活性（圖 4d）。在這里，IRF4-C99R 與 AP-1 TFs JUNB 和 BATF 聯(lián)合使用特異性增強(qiáng)了熒光素酶活性，而 IRF4-WT 則沒有。最后，攜帶IRF4-C99R突變的HRS細(xì)胞系與缺乏IRF4-C99 R的HRS的表達(dá)譜與cHL特異性基因關(guān)系的比較表明，cHL標(biāo)志性基因GATA3、CCL5和TNFRSF8的表達(dá)在IRF4-C99R細(xì)胞系中特別高（圖4e）。

圖4：IRF4-C99R以非經(jīng)典AICE2依賴的方式上調(diào)包含cHL標(biāo)志性的基因

結(jié)論

       在這里，作者描述了人類淋巴瘤，特別是cHL中TF改變的獨(dú)特機(jī)制，涉及靶向IRF4的DNA結(jié)合域中心的復(fù)發(fā)性體細(xì)胞錯(cuò)義突變c.295 T>c（p.Cys99Arg；p.C99R）。他們發(fā)現(xiàn)，IRF4-C99R導(dǎo)致IRF4的DNA結(jié)合特性發(fā)生根本性變化，結(jié)合到經(jīng)典IRF基序的結(jié)合損失和結(jié)合到經(jīng)典和非經(jīng)典IRF CE的新形態(tài)獲得。在功能上，證明IRF4-C99R阻斷了IRF4依賴性漿細(xì)胞誘導(dǎo)，并以非經(jīng)典激活蛋白-1（AP-1）-IRF-CE（AICE）依賴的方式上調(diào)疾病特異性基因。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，電泳遷移率變化分析（EMSA），免疫印跡，桑格測(cè)序，PCR，免疫組化，重組蛋白的克隆與純化，ChIP-seq，DNase-seq，RNA-seq，流式細(xì)胞術(shù)

參考文獻(xiàn)

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