腫瘤內(nèi)皮細胞自噬是黑色素瘤的關鍵血管免疫檢查點

        使用免疫檢查點阻斷劑（ICBs）的免疫治療在多種實體瘤（包括黑色素瘤）的治療中顯著提高了CD8 T細胞介導的抗腫瘤免疫。然而仍有相當數(shù)量的黑色素瘤患者對免疫治療無效。黑色素瘤是一種典型的免疫原性腫瘤，可以通過多種癌細胞內(nèi)在和外在機制來維持深刻的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）。闡明促進免疫抑制TME的分子機制對于克服黑色素瘤免疫治療的耐藥性具有重要的臨床意義。與大多數(shù)處于靜止狀態(tài)的健康組織內(nèi)皮細胞（ECs）相比，TECs不斷暴露于導致功能和結(jié)構(gòu)異常的血管生成線索。晚期腫瘤中異常血管生成導致的血管重塑通過增強TECs的免疫抑制特性來對T細胞浸潤產(chǎn)生屏障。闡明能夠?qū)?span>TEC免疫抑制特性的關鍵機制，或闡明其炎癥狀態(tài)，對于充分釋放抗腫瘤免疫應答至關重要。自噬是腫瘤和其他炎癥狀態(tài)中免疫和炎癥微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子。在宿主組織中自噬的喪失會誘導系統(tǒng)性和組織特異性的代謝重編程，從而有利于抗腫瘤免疫。然而自噬如何調(diào)節(jié)與免疫細胞交界的血管的免疫調(diào)節(jié)功能尚不清楚。與TEC相關的自噬在何種程度上影響炎癥、免疫監(jiān)視和對ICBs的反應仍然未知。該研究發(fā)表在《EMBO Molecular Medicine》，IF：11.1。

技術路線：

主要研究結(jié)果：

1. 內(nèi)皮細胞自噬缺失可改善黑色素瘤的免疫監(jiān)視

        為了揭示內(nèi)皮細胞自噬在調(diào)節(jié)黑色素瘤免疫監(jiān)視中的作用，研究者將可誘導的PDGFb-creERT2Rosa26tdTomato/tdTomato細胞系與ATG5fl/fl小鼠雜交，在他莫昔芬給藥后從血液內(nèi)皮細胞中刪除必需的自噬基因Atg5（即ATG5BECKO）。研究者在WT和Atg5BECKO小鼠中比較了皮下移植的小鼠B16-F10黑色素瘤和免疫原性較高的Hcmel12黑色素瘤的生長情況，Hcmel12是在Hgf-Cdk4R24C小鼠中連續(xù)移植UV誘導的原發(fā)性黑色素瘤。在兩個同系模型中，在血液內(nèi)皮細胞中敲除ATG5使腫瘤負荷達到相似的降幅（圖1A-D）。

        由于典型自噬蛋白ATG5/ATG12是調(diào)節(jié)發(fā)育中的自噬體的多聚體泛素樣結(jié)合復合物的一部分，研究者推斷ATG12缺失應該是TEC中ATG5缺失導致的功能性上位性改變。ATG9是一種被ULK1磷酸化的跨膜蛋白，并被招募到PI3KC3自噬起始機制復合體，該復合體控制自噬體形成的第一步。此外，雖然Atg5和Atg12都參與了與LC3相關的吞噬作用，但ULK1復合體的成分似乎并未參與其中。在比較接種B16-F10或免疫原性YUMMER 1.7黑色素瘤細胞的野生型和Atg12ECKO或Atg9ECKO小鼠時，研究者觀察到腫瘤負荷的類似表型差異（圖1E-H）。

        在B16-F10和YUMMER 1.7腫瘤中，TEC-自噬缺失均增加了CD31+ TEC周圍CD3+ T淋巴細胞的存在，尤其是在血管化程度較高的腫瘤邊緣（圖1I，J），這提示無論使用的黑色素瘤模型的免疫原性如何，TEC-自噬的缺失均增加了吸引和募集T細胞的能力。

圖1 內(nèi)皮細胞自噬的遺傳缺失會降低黑色素瘤的生長

        然后，研究者通過FACs分析來自B16-F10 WT和Atg5BECKO小鼠的TIL中CD8+和CD4+ T細胞的存在。與WT小鼠的黑色素瘤相比，Atg5BECKO小鼠的黑色素瘤顯示出CD8+ T和CD4+ T細胞數(shù)量增加（圖2A，B），并且含有關鍵效應分子顆粒酶B（GrzB）表達較高的CD8+ T細胞（圖2A）。攜帶黑色素瘤的Atg5BECKO小鼠也表現(xiàn)出免疫抑制性T調(diào)節(jié)性細胞與CD8+T細胞的比例下降，這是TME免疫抑制狀態(tài)減弱的一個指標（圖2C）。

        為了進一步了解活化的TIL群體，研究者分析了前體耗竭的CD8+ T細胞，其標志是TCF1和PD1的聯(lián)合表達，以及缺乏TIM3表達，以及其后代的終末耗竭效應因子PD1+ CD8+ T細胞，定義為GrzB增加和TIM3水平高，但缺乏TCF1表達。在WT和Atg5BECKO小鼠中，兩個種群保持相似（圖2D）。然而，與WT小鼠相比，來自Atg5BECKO的最終耗竭效應性CD8+ T細胞產(chǎn)生的GrzB量較高（圖2E）。

        然后，研究者詢問了在ATG5BECKO小鼠中，CD8+ T細胞增加和腫瘤生長減少之間是否存在因果關系。研究者通過注射αCD8+抗體去除CD8+ T細胞，并在WT和Atg5BECKO小鼠中檢測了腫瘤生長（圖2F）。去除CD8+ T細胞未顯著影響WT小鼠中的B16-F10生長，但逆轉(zhuǎn)了Atg5BECKO小鼠中對腫瘤負荷和生存期的有益作用（圖2G，H），因此在功能上提示CD8+T細胞參與延遲的腫瘤生長表型。

        總之，這些數(shù)據(jù)表明，TECs中典型自噬基因的缺失通過增加表達GrzB的效應性CD8+ T細胞的頻率來抑制黑色素瘤的生長和具有免疫抑制性的TME。

圖2 腫瘤內(nèi)皮細胞中Atg5的缺失促進CD8+ T細胞介導的抗腫瘤免疫反應

2. 自噬促進TEC的免疫耐受狀態(tài)

        接下來，研究者探討了自噬如何調(diào)節(jié)淋巴細胞內(nèi)流和活性，重點關注調(diào)節(jié)淋巴細胞的趨化因子、細胞因子和黏附分子。自噬不僅通過蛋白質(zhì)降解發(fā)揮直接作用，還調(diào)節(jié)細胞的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳程序，研究者首先對來自B16-F10腫瘤的FAC分選的Atg5精通和Atg5缺陷的CD45-Ter119-CD31+TEC進行了轉(zhuǎn)錄譜分析，使用Nanostring技術對涉及癌癥免疫調(diào)節(jié)的770個基因進行了分析（圖3A）。在研究者的數(shù)據(jù)集中，最主要的特征與炎癥反應相關（圖3B）。此外，對Log2FC≥0.7且P<0.05的差異表達（DE）基因所做的分析表明，在Atg5BECKO TEC中，編碼具有免疫細胞相互作用活性的表面炎癥蛋白和細胞因子/趨化因子的基因顯著表達，而這些是炎癥TEC表型的特征（圖3C）。與此同時，與NF-κB通路相關的因子和各種EC黏附分子的基因表達在Atg5BECKO小鼠TECs中顯著上調(diào)。后者包括VCAM1，ICAM1，SELE和SELP，它們在結(jié)合T細胞表面配體和增加T細胞受體信號傳導中具有確定的作用，以及在內(nèi)皮細胞中具有趨化和黏附功能的細胞因子和趨化因子，如IL6、CX3CL1/fractalkine、CXCL2、CXCL1和非經(jīng)典NF-κB通路的介質(zhì)RELB（圖3C）。另外一組用于抗病毒/1型干擾素（IFN）應答的DE基因包括IFIH1、IRF1、IRF7、TLR4以及抗原呈遞機制H2-K1、H2-T23和H2-D1的元件，這提示Atg5BECKO小鼠的TECs獲得了改善的免疫調(diào)節(jié)功能，包括維持T細胞功能的能力（圖3C）。基因集富集分析證實，與來自WT小鼠的TECs相比，來自Atg5BECKO小鼠的TECs在參與炎癥反應和IFN信號通路的基因集中表現(xiàn)出穩(wěn)健的富集（圖3B）。因此，ATG5敲除引起TEC中控制淋巴細胞黏附和功能的趨化因子和分子的表達。

        然后，研究者在選定的免疫調(diào)節(jié)標志物的蛋白質(zhì)水平上驗證了轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。與WT相比，來自Atg5BECKO小鼠的TECs顯示VCAM1、ICAM1和STING（抗病毒/1型干擾素應答的主要調(diào)節(jié)因子）水平顯著增加（圖3D）。與此同時，Atg5BECKO小鼠TECs的VCAM1、ICAM1、MHCⅰ類和MHCⅱ類的表面表達以及IFNβ（STING通路的下游效應因子）的胞內(nèi)表達均升高（圖3E）。因此，在各種黑色素瘤模型中，自噬阻斷可促進TEC炎癥。

        接下來，研究者試圖通過分析公開獲得的單細胞RNA-seq癌癥圖譜中的ECs表型特征，將研究者的小鼠mRNA譜與人類TECs（huTECs）進行更廣泛的背景分析。為了增加罕見huTEC亞型的覆蓋率，研究者匯總了來自不同活檢部位（原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移和鄰近非腫瘤組織樣本）的非小細胞肺癌、乳腺癌、高級別漿液性卵巢癌和結(jié)直腸癌的EC scRNAseq數(shù)據(jù)。從總共7573個高質(zhì)量TEC開始，研究者對這些腫瘤進行了聚類分析。研究者驗證了來自納米串分析的“炎癥”基因標簽包含在小鼠和人類之間保守的基因，并使用該內(nèi)部生成的標簽（稱為muTEC-DE）和反應組-巨自噬標簽進行進一步分析。值得注意的是，以muTEC-DE標簽表達最高為標志的IFN huTEC亞群在自噬標簽中的富集程度最低（圖3F），這提示，特別是免疫調(diào)節(jié)功能更明顯的亞型同時顯示出自噬基因的低表達水平。

        研究者進一步在各種癌癥類型的原發(fā)腫瘤huTEC內(nèi)檢驗了muTEC-DE和自噬標簽之間的關聯(lián)。值得注意的是，除了非小細胞肺癌之外，研究者在分析的所有其他癌癥類型中觀察到這些標簽之間存在顯著的負相關，盡管在乳腺癌中這種負相關程度有所降低（圖3G）。此外，huTECs中muTEC-DE標簽的富集與T細胞內(nèi)測定的CD8+反應性T細胞標簽的表達呈正相關（圖3H）。

        綜上所述，這些觀察結(jié)果提示，無論物種或腫瘤類型，自噬能力低的TECs均具有增強的免疫支持功能。

圖3 自噬抑制腫瘤內(nèi)皮細胞的炎性表型

3. 自噬可減弱內(nèi)皮細胞中NF-κB和cGAS的炎癥軸

        接下來，研究者的目標是確定自噬抑制支持EC炎癥表型的潛在機制。研究者評估了培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞是否可以重現(xiàn)在小鼠中觀察到的自噬遺傳缺失的影響。與對照內(nèi)皮（Ctr）相比，Atg5KO內(nèi)皮中一組基本相似的炎癥基因（例如SELE、VCAM1和ICAM1）和趨化因子（例如CX3CL1、CXCL10）的表達增強，這是在對從Atg5BECKO小鼠分離出的muTEC進行的納米串分析中觀察到的結(jié)果（圖4A-E）。炎癥基因表達譜程度的差異（圖4A-E）可能可以通過這些細胞中ULK1/2的急性抑制而非ATG5的慢性缺失來解釋。Atg5KO細胞中VCAM1的表面表達增加通過FACs進一步驗證（圖4F）。

        考慮到體內(nèi)和體外表型的相似性，研究者使用培養(yǎng)的自噬缺失的內(nèi)皮細胞來研究加劇炎癥信號傳導的分子通路。研究者專注于STING和NF-κB信號通路，因為已知STING激活可通過協(xié)同調(diào)節(jié)I型IFN和NF-κB激活來促進抗腫瘤免疫，而在攜帶黑色素瘤的Atg5BECKO小鼠的muTEC中增強（圖3C，D）。此外，雖然已知自噬可調(diào)節(jié)STING和NF-κB通路，但在內(nèi)皮細胞中，去除STING可改善T細胞在TNF誘導的炎癥反應中的募集。

        在經(jīng)典的STING激活途徑中，cGAS與胞質(zhì)內(nèi)的dsDNA結(jié)合并催化cGAMP的合成。cGAMP與ER相關STING的結(jié)合觸發(fā)其寡聚化，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）出口/釋放到ER-高爾基中間室，其中寡聚化的STING介導了TBK1的激活/磷酸化。這進而導致干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄和NF-κB的激活。信號停止是通過將STING從后高爾基體販運到溶酶體來協(xié)調(diào)的，在溶酶體中，STING被降解。

        研究者首先測量了自噬/溶酶體降解途徑的干擾對STING運輸和信號傳導的影響。在靜息條件下，通過ATG5KO阻斷自噬（圖4G）導致STING的單體和二聚體/寡聚體形式逐漸增加，這是通過在非變性條件下的免疫印跡發(fā)現(xiàn)的。同樣，在ATG5KO ECs中，STING與LMAN1的共定位增加，這與TBK1磷酸化相關（圖4H），提示其激活。與此同時，向ECs中添加cGAS酶活性的產(chǎn)物cGAMP，會輕微但不顯著地提高Ctr ECs中的p-TBK1和VCAM1，而對ATG5KO ECs沒有額外的影響（圖4H）。

        研究者進一步探索了自噬可以刺激清除cGAS激活因子的可能性，例如來自線粒體的胞質(zhì)雙鏈DNA（dsDNA），這是STING信號通路的一個已確定的內(nèi)源性觸發(fā)因素。在真正凋亡信號驅(qū)動的線粒體外膜通透化的細胞中，自噬可以抑制I型IFN。使用TOMM20對線粒體網(wǎng)絡進行染色的超分辨率顯微鏡檢查和抗dsDNA抗體顯示，與顯示在線粒體網(wǎng)絡內(nèi)包裹的dsDNA的Ctr ec相比，ATG5-KO EC中的dsDNA主要位于線粒體網(wǎng)絡附近，部分位于細胞質(zhì)中（圖4I），這表明其通過線粒體源性囊泡流出。雖然與Ctr ECs相比，ECs中的ATG5 KO未引起關鍵線粒體形態(tài)測量參數(shù)的明顯變化（圖4J）。此外，鑒于STING含有一個LC3相互作用區(qū)域，因此可以作為自噬降解的靶點，研究者不能排除這一機制導致了在ATG5缺失的內(nèi)皮細胞中觀察到的STING信號。盡管如此，這些結(jié)果表明，在內(nèi)皮細胞中自噬的缺失介導了cGAS-STING和NF-κB的激活，導致了一系列炎癥/免疫調(diào)節(jié)靶基因的表達。同樣，內(nèi)皮細胞中ATG5的消融，伴隨著VCAM1的上調(diào)，導致了經(jīng)典NF-κB通路的抑制性IκBα蛋白的磷酸化，并增加了替代NF-κB信號通路的介質(zhì)積累；前體蛋白p100、其降解產(chǎn)物p52和RelB，提示NF-κB通路的激活（圖4K）。

        然后，研究者評估了在自噬缺失的內(nèi)皮細胞中，是否需要cGAS-STING來激活NF-κB。為此，研究者利用CRISPR-Cas9在Ctr和ATG5KO細胞中刪除了STING。然而，ATG5和STING的伴隨和慢性抑制的效應在不同的人類EC供體中不同，這使得結(jié)果不可靠。因此，研究者測試了抑制ULK1/2在STING去除細胞中的作用。與ATG5KO類似，抑制ULK1/總之，這些數(shù)據(jù)假設STING促進了NF-κb依賴的免疫支持Atg5BECKO表型的加重，但不是必需的。

圖4 在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中，自噬通過清除胞質(zhì)內(nèi)的雙鏈DNA，通過CGAS-STING-介導的NF-κB通路抑制炎癥反應

4. 腫瘤內(nèi)皮細胞自噬限制黑色素瘤對抗PD1治療的反應

        鑒于阻斷自噬具有免疫刺激作用，同時CD8 T細胞浸潤和活性增強，因此研究者研究了破壞TEC中的自噬可否通過免疫檢查點阻斷（ICB）的形式促進免疫治療（圖6A）。雖然抗PD1單藥治療顯著降低了WT小鼠中的B16-F10腫瘤生長，但免疫治療對攜帶B16-F10的Atg5BECKO小鼠的效果是遞增的，但不顯著（圖6B，C）。這些結(jié)果提示，在攜帶黑色素瘤小鼠的TEC中，阻斷自噬有利于TILs的募集和活性（圖2D-G），因此并未進一步增強抗PD1 ICB治療的療效，但可能進一步維持其療效。

        研究者之前的分析特別表明，treatment-na?ve癌癥患者的huTEC干擾素亞型在muTEC-DE High和自噬low基因標簽的表達之間表現(xiàn)出不同的關聯(lián)（圖3F）。為了進一步闡明這些TEC特異性標簽的意義，以及它們與黑色素瘤患者對ICBs的臨床應答之間的關聯(lián)，研究者隨后使用來自一項獨特的前瞻性縱向研究的scRNAseq數(shù)據(jù)研究了huTEC的單細胞轉(zhuǎn)錄組。在治療前和第一個治療周期后收集腫瘤活檢組織并進行scRNAseq分析。

        數(shù)據(jù)包括來自22個樣本的TEC，N=12有反應（R），N=10無反應（NR）（圖6D）。總體而言，研究者使用已建立的無偏倚EC識別方法對1541個EC進行了注釋。與無應答者相比，應答者的huTEC在治療前顯著富集了核心炎癥基因集（圖6E），而自噬基因核心標簽的富集較低。有趣的是，無應答者在一個治療周期后也顯示出muTEC-DE標簽的富集（圖6E）。這可能提示TEC炎癥表型與TME的初始變化相關，這一變化是由抗PD1的首次應答驅(qū)動。然而，在同一組患者中，較高的自噬評分無變化（圖6E），這提示只有muTEC High / autophagy Low狀態(tài)與臨床獲益相關。

        然后，研究者研究了應答者和無應答者之間的muTEC-DE標簽是否僅在huTECs亞型中存在差異。為此，研究者將所有huTECs聚類，并獲得了11種亞型，這些亞型反映了在原發(fā)泛癌數(shù)據(jù)中觀察到的huTECs異質(zhì)性。與無應答的黑色素瘤患者相比，對抗PD1有應答的黑色素瘤患者在干擾素、Tip/Stalk和靜脈EC簇中有顯著富集的muTEC-DE特征，這一趨勢在干擾素亞型的ON治療時間點穩(wěn)定維持。值得注意的是，應答者中的這些相同簇在ON治療時間點顯示自噬標記的表達顯著降低（圖6F）。此外，利用這些scRNAseq數(shù)據(jù)集，研究者發(fā)現(xiàn)所有TECs中的muTEC-DE標簽表達水平與CD8+T細胞的瘤內(nèi)浸潤呈正相關（圖6G）。

        總之，這些數(shù)據(jù)提示，muTEC-DE High/自噬低表型在臨床上與抗PD1治療的良好應答相關。

圖5 TECs中Sting和Atg5的雙重基因缺失促進了替代NF-κB通路的激活

5. 炎癥血管和CD8+ T細胞的空間接近與抗PD1治療的反應相關

        然后，研究者試圖描述炎癥huTEC與黑色素瘤樣本中CD8+T細胞和VCAM1或VCAM1/STING蛋白表達增強的空間關系。研究者采用多重迭代標記抗體新沉積技術進行了多重免疫組織化學，研究者使用了接受抗PD1單藥治療的黑色素瘤患者的一組真實生活活檢。黑色素瘤活檢組包括6例有反應者和6例無反應者。研究者在活檢的三個不同空間區(qū)室（即腫瘤區(qū)、腫瘤-間質(zhì)界面和非腫瘤區(qū)域）評估了CD31/AQP1雙陽性（識別huTECs）、CD8+ PD1-GrzB-T細胞（識別na?ve CD8+ T細胞）和CD8+ PD1+GrzB+（識別活化/效應性CD8+ T細胞）。在腫瘤體積和腫瘤-間質(zhì)界面，無反應和有反應的EC數(shù)量沒有差異（圖7A，B）。然后，研究者通過鄰域分析研究了這些細胞類型在這些空間區(qū)室中的鄰近性。與無應答患者相比，緩解患者的VCAM1+和VCAM1+STING+TECs分別在腫瘤區(qū)域和腫瘤-間質(zhì)界面顯著富集（圖7C，D）。進一步的鄰域分析表明，在CD8+ PD1-GrZB-和CD8+ PD1+GrZB+T細胞附近，緩解患者的VCAM1+STING+TECs數(shù)量顯著較高（圖7E，F）。在腫瘤-間質(zhì)界面和腫瘤區(qū)域，這一觀察結(jié)果是正確的。尤其是在腫瘤體積內(nèi)，即使數(shù)量較低，VCAM1+血管仍然顯著接近CD8+ T細胞的兩個亞群，這提示即使在沒有STING的情況下，炎癥血管表型與浸潤的TILs保持更良好的交互作用（圖7G，H）。研究者也在MILAN分析中使用了LC3抗體，但由于TECs中LC3染色的細胞內(nèi)顆粒狀和彌散型的分辨率有限，研究者無法可靠地評估其相關的自噬狀態(tài)。

        總之，這些結(jié)果表明，炎癥血管與浸潤的CD8+ T細胞之間的空間接近是黑色素瘤患者對抗PD1治療產(chǎn)生應答的TME的標志。

圖6 黑色素瘤中TEC‐自噬與抗‐PD1治療的反應呈負相關

結(jié)論：

        該研究提高了對自噬作為血管固有的抗炎/免疫抑制機制的作用的認識，限制了黑色素瘤的抗腫瘤免疫。該研究還為利用血管歸巢工具確定針對腫瘤血管的自噬抑制劑或NF-κB調(diào)節(jié)劑的適當聯(lián)合治療提供了理論基礎。

實驗方法：

        細胞培養(yǎng)，小鼠實驗，免疫表型分析，免疫熒光成像，RNA分離，定量RT-PCR，蛋白質(zhì)印跡，單細胞RNA測序

參考文獻：

        Verhoeven J, Jacobs KA, Rizzollo F, Lodi F, Hua Y, Po?niak J, et al. Tumor endothelial cell autophagy is a key vascular-immune checkpoint in melanoma. EMBO Mol Med. 2023 Nov 27:e18028. doi: 10.15252/emmm.202318028.