PRMT3介導(dǎo)的METTL14精氨酸甲基化促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的惡性進(jìn)展和治療耐受性

        蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMT）在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，但其影響子宮內(nèi)膜癌（EC）治療敏感性的內(nèi)在機(jī)制仍不清楚，值得進(jìn)一步研究。本文對癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫和臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了全面分析，發(fā)現(xiàn)PRMT3在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮著重要作用。具體來說，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，PRMT3抑制會(huì)增強(qiáng)EC細(xì)胞對鐵死亡的敏感性。從機(jī)理上講，PRMT3與甲基轉(zhuǎn)移酶14（METTL14）相互作用，并參與其精氨酸甲基化。此外，PRMT3抑制介導(dǎo)的METTL14過表達(dá)會(huì)通過m6A-YTHDF2依賴性機(jī)制促進(jìn)甲基化修飾，降低谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）mRNA的穩(wěn)定性，增加脂質(zhì)過氧化水平，加速鐵死亡。值得注意的是，PRMT3阻斷和抗PD-1聯(lián)合療法通過加速細(xì)胞衍生的異種移植模型中的鐵死亡而顯示出更有效的抗腫瘤作用。特異性PRMT3抑制劑SGC707在患者來源的異種移植模型中也發(fā)揮了同樣的免疫治療增敏作用。值得注意的是，阻斷PRMT3能改善順鉑和放射治療對腫瘤的抑制作用。總之，這項(xiàng)研究表明，PRMT3是一種很有前景的EC靶點(diǎn)。本文于2023年11月發(fā)表于《Advanced Science》，IF=15.1。

技術(shù)路線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.    PRMT3是EC中一種關(guān)鍵的上調(diào)生物標(biāo)志物

        為了確定在EC中起關(guān)鍵作用的PRMTs，作者對來自TCGA數(shù)據(jù)庫和CPTAC數(shù)據(jù)庫的UCEC數(shù)據(jù)集進(jìn)行了差異分析，發(fā)現(xiàn)在重疊結(jié)果中，PRMT1和PRMT3在EC組織中升高（圖1A）。qRT-PCR檢測證實(shí)，在5個(gè)臨床EC組織樣本中，PRMT1和PRMT3的表達(dá)均高于匹配的癌旁組織（圖1B）。此外，與正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞相比，PRMT3在EC細(xì)胞中上調(diào)。在EC細(xì)胞系中，PRMT3在HEC-1A細(xì)胞中表達(dá)最高，在HEC-1B細(xì)胞中表達(dá)最低（圖1C-E）。

        為了進(jìn)一步確定PRMT3的作用，作者通過慢病毒轉(zhuǎn)染建立了穩(wěn)定的HEC-1B-Lv-PRMT3和HEC-1A-Lv-shPRMT3細(xì)胞。通過Western印跡和qRT-PCR驗(yàn)證了穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)移的有效性（圖1F-G）。與對照組相比，PRMT3的上調(diào)提高了HEC-1B細(xì)胞的存活率，而PRMT3缺陷的HEC-1A細(xì)胞的存活率則降低了（圖1H）。此外，與對照組相比，過表達(dá)PRMT3增加了HEC-1B細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞的集落形成能力。相比之下，在HEC-1B細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞中去除PRMT3則觀察到相反的趨勢（圖1I）。此外，過表達(dá)PRMT3會(huì)顯著降低細(xì)胞死亡的比例，而敲除PRMT3則會(huì)增加這一比例（圖1J）。上述發(fā)現(xiàn)意味著PRMT3在EC中表達(dá)上調(diào)，并可能在EC的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

2.    PRMT3耗竭導(dǎo)致EC中的鐵死亡易感性

        對細(xì)胞死亡不敏感是癌癥的關(guān)鍵特性之一，它使腫瘤對治療方法產(chǎn)生部分抗性。用不同濃度的鐵死亡誘導(dǎo)劑處理PRMT3下調(diào)或?qū)φ盏?span>EC細(xì)胞表明，PRMT3缺失抑制了對彈性蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抵抗力（圖2A）。PRMT3阻斷組和Erastin處理組的細(xì)胞都表現(xiàn)出一定程度的鐵死亡。此外，鐵死亡抑制劑liproxstatin-1挽救了這種由 PRMT3敲低促進(jìn)的Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但不能被細(xì)胞凋亡抑制劑（Z-VAD-FMK）、壞死抑制劑（壞死磺胺）或自噬抑制劑（3-甲基腺嘌呤）所挽救（圖2B、C）。這些結(jié)果表明，PRMT3的缺失通過增加細(xì)胞內(nèi)的鐵死亡而增強(qiáng)了Erastin治療的抑制作用。

        由于GPX4是鐵死亡過程的一個(gè)顯著標(biāo)志，因此進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。過表達(dá) PRMT3在蛋白和mRNA水平上都促進(jìn)了GPX4的表達(dá)（圖2D）。值得注意的是，GPX4的上調(diào)或抑制對PRMT3的表達(dá)沒有影響。PRMT3作為GPX4的上游因子發(fā)揮著調(diào)控作用（圖2E）。接下來，作者試圖研究PRMT3和GPX4對EC中鐵死亡敏感性的影響。CCK8測定顯示，PRMT3過表達(dá)細(xì)胞和GPX4過表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞活力增強(qiáng)，而PRMT3缺陷細(xì)胞和GPX4缺陷細(xì)胞的細(xì)胞活力則相反。GPX4的抑制或上調(diào)分別部分逆轉(zhuǎn)了PRMT3過表達(dá)或敲除誘導(dǎo)的細(xì)胞活性變化（圖2F）。隨后，PRMT3過表達(dá)細(xì)胞和GPX4過表達(dá)細(xì)胞中的丙二醛（MDA）和亞鐵（Fe2+）水平降低，而PRMT3缺失細(xì)胞和GPX4敲除細(xì)胞中的丙二醛和亞鐵水平升高。PRMT3過表達(dá)導(dǎo)致的MDA和Fe2+水平降低或PRMT3缺失導(dǎo)致的MDA和Fe2+水平升高趨勢可分別被GPX4抑制或過表達(dá)所挽救（圖2G,H）。具有代表性的透射電子顯微鏡圖像顯示，PRMT3缺失細(xì)胞和GPX4缺失細(xì)胞的線粒體變小，膜密度增加，這是鐵死亡的特征。GPX4的下調(diào)或上調(diào)分別部分改變了PRMT3的上調(diào)或下調(diào)所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鐵死亡的程度（圖2I）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，沉默PRMT3可以通過抑制EC中GPX4的表達(dá)來抑制癌細(xì)胞對鐵死亡的抵抗力。

3.    PRMT3精氨酸甲基化METTL14負(fù)調(diào)控其蛋白表達(dá)

        為了闡明PRMT3調(diào)節(jié)GPX4的機(jī)制，作者對PRMT3結(jié)合蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析，其中METTL14被認(rèn)為是可能與PRMT3相互作用的蛋白（圖3A）。隨后，證實(shí)PRMT3與METTL14的結(jié)合，并觀察到PRMT3催化了METTL14的ADMA（圖3B、C）。進(jìn)一步分析表明，PRMT3能放大METTL14的ADMA信號，而在PRMT3缺失的細(xì)胞中該信號被抑制（圖3D）。這一精氨酸殘基序列在不同物種間的高度保守性表明，這種甲基化可能具有生物學(xué)功能（圖3E）。此外，作者根據(jù)GPS-MSP分析估計(jì)了可能的精氨酸殘基位置（R418）（http://msp.biocuckoo.org/）。METTL14中R418的賴氨酸突變（418RK）導(dǎo)致METTL14的ADMA甲基化顯著消失，表明該位點(diǎn)可能是 PRMT3對METTL14進(jìn)行精氨酸甲基化的靶點(diǎn)（圖3F）。此外，該突變縮短了 METTL14的半衰期，PRMT3缺失阻止了METTL14蛋白的降解（圖3G、H）。拯救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了PRMT3-METTL14-GPX4上下游調(diào)控軸之間的蛋白表達(dá)和鐵死亡之間的調(diào)控關(guān)系（圖3I-K）?？傊?，PRMT3促進(jìn)了METTL14的精氨酸甲基化并對其進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控，從而介導(dǎo)了對細(xì)胞鐵死亡的抑制。

4.    m6A通過METTL14-YTHDF2依賴性途徑對GPX4 mRNA進(jìn)行甲基化

        METTL14作為甲基轉(zhuǎn)移酶的核心成分，可以參與m6A修飾的動(dòng)態(tài)過程，因此作者進(jìn)一步研究了METTL14對GPX4的m6A修飾。本節(jié)的實(shí)驗(yàn)選擇了HEC-1A和 Ishikawa細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兎謩e被鑒定為METTL14表達(dá)較低和較高的細(xì)胞（圖4A）。Western印跡和免疫熒光檢測顯示，METTL14高表達(dá)細(xì)胞中GPX4表達(dá)減少，而 METTL14缺失細(xì)胞中GPX4表達(dá)增加（圖4B）。如結(jié)果所示，過表達(dá)METTL14顯著提高了細(xì)胞的全局m6A水平和GPX4 mRNA的m6A富集（圖4C、D）。接下來，SRAMP程序（http://www.cuilab.cn/sramp）確定了GPX4 mRNA上潛在的m6A修飾位點(diǎn)。生成包含野生型（WT）或突變型（Mut）GPX4 的熒光素酶報(bào)告基因，用于后續(xù)檢測。在突變型GPX4中，m6A共序中的腺苷核苷酸被胸苷取代（圖4E）。含有GPX4-WT的構(gòu)建體的熒光素酶活性在METTL14過表達(dá)時(shí)顯著降低，而在METTL14缺失時(shí)則增強(qiáng)，而GPX4-MUT的熒光素酶活性似乎不受影響（圖4F）。這些結(jié)果表明 GPX4的表達(dá)受METTL14介導(dǎo)的m6A修飾控制。

        考慮到m6A甲基化過程涉及m6A閱讀蛋白的識別，研究人員調(diào)查了YTHDF1/2/3作為經(jīng)典的m6A閱讀蛋白家族對GPX4 mRNA穩(wěn)定性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2缺失后，GPX4的表達(dá)升高；然而，在YTHDF1/3缺失的細(xì)胞中，GPX4沒有發(fā)生變化（圖4G,H）。YTHDF2缺乏消除了METTL14過表達(dá)對GPX4的抑制作用（圖4I）。RIP-qPCR證實(shí)了YTHDF2和GPX4 mRNA之間的相互作用（圖4J）。此外，與使用放線菌素D處理后的對照細(xì)胞相比，METTL14基因缺失和YTHDF2基因缺失都顯著延長了GPX4 mRNA的半衰期（圖4K）。因此，METTL14介導(dǎo)的GPX4 m6A修飾可通過YTHDF2依賴性識別促進(jìn)mRNA降解。

5.    PRMT3表達(dá)與EC患者METTL14表達(dá)及預(yù)后良好呈負(fù)相關(guān)

        在臨床患者組織中進(jìn)行了進(jìn)一步的研究和證實(shí)。Western印跡結(jié)果顯示，腫瘤組織中PRMT3的表達(dá)高于鄰近的正常組織（圖5A）。如圖5B的代表性圖像所示，腫瘤組織中PRMT3高表達(dá)，METTL14低表達(dá)（圖5B）。值得注意的是，在PRMT3低表達(dá)的患者中，約有2/3（64.52%）的患者METTL14水平相對較高，而在PRMT3高表達(dá)組中，72.04%的組織METTL14水平較弱（圖5C）。此外，Kaplan-Meier曲線顯示，PRMT3表達(dá)較低的EC患者預(yù)后良好（圖5D）。同樣，qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，新鮮EC腫瘤組織中的PRMT3 mRNA水平相對高于相應(yīng)的鄰近正常組織（圖5E）。PRMT3的高表達(dá)與晚期病理分級、T分期、N分期和FIGO分期密切相關(guān)（圖5F-I）。質(zhì)譜鑒定出的與PRMT3相互作用蛋白在鐵死亡途徑中富集，進(jìn)一步證實(shí)了作者的結(jié)論（圖5J）。此外，作者還探討了PRMT3、METTL14和GPX4聯(lián)合作用的預(yù)后潛力。低PRMT3表達(dá)、高METTL14表達(dá)和低GPX4表達(dá)的患者預(yù)后最好。這些數(shù)據(jù)表明，由PRMT3、METTL14和GPX4組成的模型可用作EC患者的預(yù)后因素。總之，PRMT3在EC中表達(dá)上調(diào)，可能與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。

6.    PRMT3抑制通過提高腫瘤對鐵死亡的敏感性，增強(qiáng)了抗PD-1治療對EC的抗腫瘤作用

        從成年雌性NOG-dKO小鼠的尾靜脈輸入人外周血單核細(xì)胞（Hu-PBMCs），用于構(gòu)建免疫重建模型。流式細(xì)胞術(shù)用于監(jiān)測2-3周后小鼠外周血中人源T淋巴細(xì)胞的重建水平（圖6A）。結(jié)果表明，人源化小鼠模型已成功建立，可用于后續(xù)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑研究。

        作者在Hu-NOG-dKO小鼠模型中異種移植了HEC-1A-shPRMT3和HEC-1A-載體細(xì)胞，小鼠在注射后第11天開始在規(guī)定時(shí)間接受PD-1阻斷或IgG治療（圖6B）。與其他小鼠相比，PRMT3下調(diào)和抗PD-1聯(lián)合治療組小鼠的腫瘤體積和重量進(jìn)一步減少（圖6C-E）。聯(lián)合處理組的脂質(zhì)過氧化物、MDA和Fe2+水平明顯更高。Liproxstatin-1逆轉(zhuǎn)了聯(lián)合治療組的療效和細(xì)胞死亡程度（圖6F-H）。此外，還觀察到聯(lián)合治療組小鼠的GPX4表達(dá)最弱，4-HNE（一種脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物）表達(dá)最強(qiáng)，PRMT3表達(dá)較低，METTL14表達(dá)較高（圖6I）。PRMT3下調(diào)的癌細(xì)胞更容易被T細(xì)胞殺死（圖6J）。與其他組相比，聯(lián)合治療組的腫瘤生長速度更慢，腫瘤重量更輕，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、MDA和Fe2+水平更高（圖6K-N）。因此，阻斷PRMT3表達(dá)或PRMT3抑制劑可能會(huì)通過抑制細(xì)胞對鐵死亡的耐藥性來提高抗PD-1療法的療效。

7.    PRMT3下調(diào)增強(qiáng)EC放化療的抗腫瘤療效

        考慮到PRMT3基因敲除在增強(qiáng)免疫療法方面的顯著療效，作者隨后研究了它是否會(huì)對化療和放療等其他治療方式產(chǎn)生類似的影響。事實(shí)證明，順鉑和放射治療都會(huì)在細(xì)胞水平上加速鐵死亡。此外，與其他對照組相比，順鉑和放射治療在PRMT3缺陷組中都能產(chǎn)生更大的鐵死亡誘導(dǎo)和治療增敏作用，而且這種作用可被Liproxstatin-1部分消除（圖7A-L）。鑒于腫瘤控制機(jī)制存在于輻射部位之外，作者進(jìn)一步探討了沉默PRMT3與放療聯(lián)合治療是否有可能產(chǎn)生更大的遠(yuǎn)隔效應(yīng)。在雙側(cè)腫瘤模型中，與未治療的對照側(cè)相比，治療側(cè)的腫瘤生長明顯減慢，未治療側(cè)的腫瘤體積略有縮小，兩側(cè)的鐵死亡水平均升高。與其他三組相比，雙側(cè) PRMT3基因敲除腫瘤聯(lián)合左側(cè)放療組的雙側(cè)腫瘤顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤效果和更大的鐵死亡（圖7M-P）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，阻斷PRMT3改善了順鉑和放療對腫瘤的抑制作用，并能更大程度地激活脫落效應(yīng)。

結(jié)論：

        總之，作者發(fā)現(xiàn)PRMT3可能是預(yù)測EC患者不良預(yù)后和不利臨床進(jìn)展的生物標(biāo)記物。作者還闡明了PRMT3在EC細(xì)胞鐵死亡抵抗中的潛在機(jī)制。PRMT3缺失導(dǎo)致METTL14結(jié)合和精氨酸甲基化失敗，METTL14高表達(dá)并以m6A依賴性方式下調(diào)GPX4，最終抑制細(xì)胞對鐵死亡的抗性并導(dǎo)致EC的治療敏感性（圖8）。作者的工作提出了一種很有前景的方法，即消耗PRMT3可通過促進(jìn)EC中的鐵死亡抑制對抗PD-1、化療和放療的耐藥性。

實(shí)驗(yàn)方法：

        生物信息分析、蛋白質(zhì)印跡分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、鐵檢測、免疫共沉淀測定、m6 斑點(diǎn)印跡測定、MeRIP-qPCR、熒光素酶報(bào)告基因檢測、RNA穩(wěn)定性測定、免疫組化、轉(zhuǎn)染、CCK8檢測、菌落形成檢測、脂質(zhì)過氧化評估和細(xì)胞死亡分析、透射電子顯微鏡成像、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、T 細(xì)胞介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷、Hu-NOG-dKO 模型的建立和體內(nèi)療效實(shí)驗(yàn)、建立 PDX

參考文獻(xiàn)：

        Wang, Y., Wang, C., Guan, X., Ma, Y., Zhang, S., Li, F., Yin, Y., Sun, Z., Chen, X., Yin, H., PRMT3-Mediated Arginine Methylation of METTL14 Promotes Malignant Progression and Treatment Resistance in Endometrial Carcinoma. Adv. Sci. 2023, 2303812.