hsa_circ_0007919增強胰腺導管腺癌DNA損傷應(yīng)答，促進吉西他濱耐藥

         circRNAs在癌癥和化療耐藥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。DNA損傷修復有助于癌細胞的增殖和對化療誘導的細胞凋亡的抵抗。然而，circRNA在DNA損傷修復調(diào)控中的作用需要澄清。我們在耐GEM的PDAC組織和細胞中發(fā)現(xiàn)了高表達的circRNA hsa_circ_0007919。hsa_circ_0007919的高表達與PDAC患者較差的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)相關(guān)。Hsa_circ_0007919以依賴LIG1的方式抑制GEM誘導的DNA損傷、DNA斷裂積累和細胞凋亡，維持細胞存活。機制上，hsa_circ_0007919招募FOXA1和TET1降低LIG1啟動子的甲基化并增加其轉(zhuǎn)錄，進一步促進堿基切除修復、錯配修復和核苷酸切除修復。最后，我們發(fā)現(xiàn)GEM增強了QKI與hsa_circ_0007919 pre-mRNA內(nèi)含子的結(jié)合以及該pre-mRNA的剪接和環(huán)狀化，從而生成hsa_circ_0007919。Hsa_circ_0007919通過以依賴LIG1的方式增強DNA損傷修復以維持細胞存活，從而促進GEM耐藥。靶向hsa_circ_0007919和DNA損傷修復途徑可能是PDAC的治療策略。本文于2023年12月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）hsa_circ_0007919在GEM耐藥PDAC中表達上調(diào)，預測預后不良

         我們進行了下一代測序，以鑒定導致GEM耐藥的環(huán)狀RNA。共有62個circRNA差異表達，與GEM敏感組織相比，hsa_circ_0007919在GEM耐藥PDAC組織中顯著上調(diào)(圖1A)。然后，我們測量了50對非GEM耐藥PDAC組織及鄰近組織和45對GEM耐藥PDAC組織及相關(guān)鄰近組織中hsa_circ_0007919的表達。結(jié)果顯示，與GEM敏感的PDAC組織相比，hsa_circ_0007919在GEM耐藥PDAC組織中的表達明顯上調(diào)(圖1B)。hsa_circ_0007919在PDAC細胞中表達增加，包括PANC-1、CFPAC-1、BxPC-3和MIA-Paca2，其表達水平在PANC-1和CFPAC-1細胞中相對較高(圖1C)。接下來，我們評估了hsa_circ_0007919的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)來源于ABR基因的外顯子3-16，并通過Sanger-seq驗證了hsa_circ_0007919的環(huán)狀位點(圖1D-1E)。我們還設(shè)計了發(fā)散型和收斂型引物來檢測hsa_circ_0007919在cDNA和gDNA中的表達。結(jié)果表明，hsa_circ_0007919可以從cDNA中擴增出來，但不能從gDNA中擴增出來(圖1F)， hsa_circ_0007919對RNase R外切酶酶切的抗性證實了它確實是環(huán)狀的(圖1G)。最后，我們利用臨床組織樣本數(shù)據(jù)分析hsa_circ_0007919表達與臨床病理特征的相關(guān)性。我們分析hsa_circ_0007919表達與GEM耐藥患者總生存期(OS)和無病生存期(DFS)的關(guān)系顯示，hsa_circ_0007919高表達預示較差的OS和DFS (圖1H-1I)。此外，我們將40例GEM治療的PDAC患者分為hsa_circ_0007919高表達和低表達兩組，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007919高表達同樣預測較差的OS和DFS(圖1J-1K)。

2）hsa_circ_0007919抑制DNA損傷和吉西他濱敏感性

         由于hsa_circ_0007919在GEM耐藥PDAC組織中表達上調(diào)，我們研究了它在GEM耐藥細胞中的功能。首先，我們在PDAC細胞中沉默了hsa_circ_0007919，發(fā)現(xiàn)抑制hsa_circ_0007919增加了GEM的敏感性(圖2A-2B)。然后，我們構(gòu)建了GEM耐藥PDAC細胞系PANC-1/GEM和CFPAC-1/GEM(圖2C-2D)，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007919在這些GEM耐藥細胞中高表達(圖2E)。我們再次在這兩種GEM耐藥細胞系中沉默hsa_circ_0007919，并在GEM處理的正常PANC-1和CFPAC-1細胞中過表達hsa_circ_0007919 (圖2C-2D)。CCK-8實驗、FCM實驗和DNA Ladder實驗結(jié)果表明，沉默hsa_circ_0007919可降低細胞增殖，增加細胞凋亡，而過表達hsa_circ_0007919則相反(圖2F-2K)。與凋亡實驗結(jié)果一致，hsa_circ_0007919沉默增加了cleaved caspase 3和cleaved caspase 9的水平，降低了BCL2的表達，而hsa_circ_0007919過表達降低了cleaved caspase 3 and cleaved caspase 9的水平，增加了BCL2水平(圖2L-2O)。GEM作為一種嘧啶類抗代謝藥物，可誘導單基損傷并導致DNA斷裂，因此我們評估了hsa_circ_0007919對DNA損傷的影響，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007919沉默增加了單細胞凝膠電泳尾部和細胞核中γ-H2AX的積累，而hsa_circ_0007919過表達降低了這些參數(shù)(圖3A, 3B)。最后，我們在裸鼠身上建立異種移植模型，發(fā)現(xiàn)沉默hsa_circ_0007919的PANC-1/GEM和PANC-1/GEM細胞形成的腫瘤體積和重量比對照細胞形成的腫瘤體積和重量都減少(圖3C-3G)。IHC、TUNEL和qPCR結(jié)果顯示，沉默hsa_circ_0007919可降低Ki-67的表達，增加caspase3和γ-H2AX的表達和細胞凋亡(圖3H-3J)。這些結(jié)果表明，hsa_circ_0007919通過減少DNA損傷促進PDAC細胞增殖和減少細胞凋亡，從而增強PDAC細胞的GEM耐藥性。

3）hsa_circ_0007919通過LIG1介導的修復途徑抑制DNA損傷

         為了證實hsa_circ_0007919如何抑制DNA損傷并影響GEM敏感性，我們通過RNA-seq鑒定了hsa_circ_0007919沉默的PANC-1/GEM細胞與對照細胞的差異表達基因。有520個上調(diào)基因和219個下調(diào)基因(圖4A)， KEGG分析和GSEA顯示，這些基因在多種DNA損傷修復途徑中富集，包括堿基切除修復、錯配修復和核苷酸切除修復(圖4B-4E)。LIG1是所有這些通路中共有的下調(diào)幅度最大的基因(圖4F)。LIG1是DNA連接酶家族的一員，據(jù)報道，在幾乎所有DNA損傷修復途徑中，LIG1都在DNA重組中發(fā)揮重要作用。因此，我們測量了LIG1的表達，發(fā)現(xiàn)與正常PDAC組織相比，LIG1在GEM耐藥PDAC組織中也高表達，并且與hsa_ circ_0007919在PDAC組織中的表達呈正相關(guān)(圖4G–4I)。在hsa_circ_0007919沉默后，LIG1的mRNA和蛋白表達水平降低，而當hsa_circ_0007919過表達時，LIG1的mRNA和蛋白表達水平升高(圖4J-4M)。這些結(jié)果表明，hsa_circ_0007919誘導LIG1表達激活DNA損傷修復途徑，增強PDAC細胞對GEM的抗性。

4）LIG1逆轉(zhuǎn)了hsa_circ_0007919對細胞增殖、凋亡和DNA損傷的影響

         為了證實LIG1是hsa_circ_0007919的下游靶點，我們研究了LIG1在GEM耐藥PDAC細胞中的作用，發(fā)現(xiàn)沉默LIG1導致增殖減少，細胞凋亡和DNA損傷增加(圖5A-5G)。此外，我們進一步在hsa_circ_0007919沉默穩(wěn)定的PANC-1/GEM和PANC-1/GEM細胞中過表達LIG1，發(fā)現(xiàn)LIG1過表達逆轉(zhuǎn)了hsa_circ_0007919沉默影響的細胞增殖、凋亡和DNA損傷(圖5H-5N)。這些結(jié)果表明，hsa_circ_0007919通過增加LIG1的表達，促進細胞增殖，減少細胞凋亡和DNA損傷。

5）hsa_circ_0007919結(jié)合FOXA1和TET1促進LIG1轉(zhuǎn)錄

         為了研究hsa_circ_0007919如何增加LIG1的表達，我們進行了FISH和核細胞質(zhì)RNA分離實驗，結(jié)果顯示hsa_circ_0007919主要分布在細胞核中(圖6A-6B)。我們使用circAtlas 2.0和ENCORI數(shù)據(jù)庫確定了與hsa_circ_0007919結(jié)合的蛋白和與LIG1 mRNA結(jié)合的蛋白之間的重疊，但無法識別任何重疊蛋白。然后，我們使用circAtlas 2.0和SPP數(shù)據(jù)庫確定了與hsa_circ_0007919結(jié)合的蛋白質(zhì)和與LIG1啟動子結(jié)合的蛋白質(zhì)之間的重疊，FOXA1被確認為蛋白質(zhì)最重要的重疊(圖6C)。我們進一步預測，可能還有其他蛋白質(zhì)與FOXA1一起起作用，并鑒定出與FOXA1結(jié)合的TET1 (圖6D)。由于FOXA1在多種癌癥中作為轉(zhuǎn)錄啟動子，而TET1作為DNA甲基化酶降低各種基因啟動子的甲基化水平并增強其轉(zhuǎn)錄，我們預測hsa_circ_0007919結(jié)合FOXA1和TET1促進LIG1的轉(zhuǎn)錄。我們首先沉默FOXA1和TET1，發(fā)現(xiàn)LIG1的表達降低(圖6E-6H)，co-IP實驗的結(jié)果證實了FOXA1和TET1在GEM耐藥細胞中的相互作用(圖6I-6J)。同時，我們在FOXA1沉默的GEM耐藥細胞中沉默TET1，發(fā)現(xiàn)TET1可以增強FOXA1沉默對LIG1的抑制能力，而過表達TET1可以部分逆轉(zhuǎn)FOXA1沉默對LIG1的抑制能力，這表明FOXA1和TET1在調(diào)節(jié)LIG1中發(fā)揮協(xié)同作用(圖6K-6L)。然后，我們進行了ChIRP分析，發(fā)現(xiàn)hsa_ circ_0007919可以結(jié)合FOXA1和TET1(圖6M, 6N)。此外，我們使用RIP實驗證實FOXA1和TET1可以與hsa_circ_0007919相互作用，且這種相互作用在GEM耐藥細胞中得到增強(圖6O-6P)。

         為了研究FOXA1、TET1與LIG1啟動子之間的相互作用，我們使用JASPAR數(shù)據(jù)庫分析了FOXA1與LIG1啟動子之間的結(jié)合位點，并使用MethPrimer 2.0數(shù)據(jù)庫預測了LIG1啟動子中的CpG島。在JASPAR鑒定的6個位點和4個預測的CpG島中，我們發(fā)現(xiàn)LIG1啟動子的位點6富集程度最高，因此我們選擇了- 1411至-1273區(qū)域(P1)進行進一步研究(圖7A-7B)，我們發(fā)現(xiàn)5-AzaC處理增加了GEM耐藥細胞中LIG1的表達(圖7C)。ChIP實驗結(jié)果顯示FOXA1和TET1結(jié)合到LIG1啟動子區(qū)域P1。抑制hsa_circ_0007919降低了這種結(jié)合能力(圖7D)。MS-PCR檢測結(jié)果顯示，沉默hsa_circ_0007919或TET1會增加LIG1啟動子中的DNA甲基化水平(圖7F)，而過表達hsa_circ_0007919或TET1具有相反的效果(圖7E和7G)。此外，我們建立了一個熒光素酶報告基因?qū)嶒?，發(fā)現(xiàn)沉默hsa_circ_0007919、FOXA1或TET1會降低LIG1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，而過表達hsa_circ_0007919、FOXA1或TET1會增強LIG1的轉(zhuǎn)錄活性(圖7H -7I)。這些結(jié)果表明hsa_circ_0007919通過結(jié)合FOXA1和TET1增強了LIG1的轉(zhuǎn)錄。

6）吉西他濱通過增強QKI介導的反向剪接誘導hsa_circ_0007919表達

         研究表明，在circRNA合成過程中，有多種蛋白質(zhì)參與了反向剪接過程。在幾個公認的調(diào)控因子中，有報道稱QKI和FUS可以促進環(huán)狀RNA的形成，而ADAR1則起到相反的作用。為了探究hsa_circ_0007919高表達的原因，我們分析了上述蛋白與hsa_circ_0007919在耐藥PDAC組織中的表達相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)QKI與hsa_circ_0007919表達呈正相關(guān)，FUS與hsa_circ_0007919表達相關(guān)性較低，ADAR1與hsa_circ_0007919表達呈負相關(guān)(圖8A)。因此，我們預測QKI可以促進hsa_circ_0007919的形成。我們在GEM耐藥PDAC細胞中沉默QKI，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007919的表達下調(diào)，但hsa_circ_0007919宿主基因ABR的表達不受影響(圖8B-8C)；此外，QKI的表達在正常PDAC細胞和抗GEM PDAC細胞之間沒有差異(圖8D-E8)。據(jù)報道，QKI在其pre-mRNA中與環(huán)狀RNA外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子相互作用。我們設(shè)計了ABR內(nèi)含子2和16的引物，發(fā)現(xiàn)QKI可以在PDAC細胞中與這兩個內(nèi)含子結(jié)合，并且這種相互作用在耐GEM的PDAC細胞中得到增強(圖8F-8G)。綜上所述，本研究表明GEM增強QKI介導的hsa_circ_0007919剪接和循環(huán)化，以及hsa_circ_0007919招募FOXA1和TET1來調(diào)節(jié)LIG1轉(zhuǎn)錄和DNA損傷修復途徑，從而有助于抵抗GEM誘導的PDAC細胞DNA損傷和凋亡(圖8H)。

結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明hsa_circ_0007919可以促進DNA損傷修復以對抗GEM治療。機制上，hsa_circ_0007919招募FOXA1和TET1促進LIG1轉(zhuǎn)錄，激活堿基切除修復、錯配修復和核苷酸切除修復途徑，改善DNA損傷，抑制GEM誘導的細胞凋亡。此外，GEM處理增強了QKI和ABR pre-mRNA之間的相互作用，以反向剪接依賴的方式導致hsa_circ_0007919增加生物發(fā)生。我們的發(fā)現(xiàn)可能有助于了解GEM耐藥的機制，并制定化療耐藥PDAC的治療策略。

實驗方法：qRT-PCR，CCK-8，流式，WB，免疫熒光，IHC，動物實驗，TUNEL，GSEA，FISH，ChIRP，Co-IP，RIP，ChIP，MS-PCR，熒光素酶報告試驗。

參考文獻：Xu L, Ma X, Zhang X, Zhang C, Zhang Y, Gong S, Wu N, Zhang P, Feng X, Guo J, Zhao M, Ren Z, Zhang P. hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma. Mol Cancer. 2023 Dec 4;22(1):195. doi: 10.1186/s12943-023-01887-8.