SETD2-NR2F1-STAT1信號軸重塑腫瘤免疫微環(huán)境、增強免疫治療療效的新機制

        以免疫檢查點抑制劑（Immune Checkpoint Inhibitors，ICIs）為代表的免疫治療徹底改變了如腎細胞癌、非小細胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、乳腺癌等晚期癌癥患者的治療，但臨床實踐證明只有約20%的患者有效。SETD2突變與免疫檢查點抑制劑（ICIs）免疫治療的療效有關(guān)。SETD2失活的功能重要性以及如何調(diào)節(jié)免疫治療反應(yīng)仍不清楚。為了探討SETD2在免疫治療中的作用，通過RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、流式細胞術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡等方法確定SETD2在ICI治療中的作用，并闡明了對腫瘤免疫的機制影響，揭示了各種難治性癌癥的新潛在治療生物標(biāo)志物，為SETD2缺失患者的免疫治療策略提供了理論依據(jù)。該研究于2023年12月6日發(fā)表在《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》，IF：10.9

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. Setd2敲除基因小鼠模型中的腫瘤對ICI免疫治療敏感

        為了測試敲除SETD2是否會使腫瘤對免疫檢查點阻斷敏感，作者建立了一個同源小鼠腫瘤細胞系：來自Pdx1cre小鼠自發(fā)性胰腺癌的KC細胞。使用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)建立Setd2-KO的KC細胞（圖1A）。為了確定Setd2對免疫治療反應(yīng)的影響，同等數(shù)量的KC-sgSetd2和對照細胞皮下移植到C57BL/6免疫活性小鼠中，然后腹腔注射PD-L1抗體。與載體對照相比，PD-L1治療顯著減少了KC-sgSetd2腫瘤的生長，但對對照組腫瘤大小沒有影響（圖1B-E）。這些結(jié)果表明，Setd2基因敲除可使胰腺癌對PD-L1免疫治療敏感。為了驗證該結(jié)論，作者又驗證了Setd2（圖1F）在第二個小鼠腫瘤細胞系（B16F10，小鼠黑色素瘤）中的作用，發(fā)現(xiàn)B16F10細胞中完全抵抗免疫檢查點阻斷，但對免疫功能正常小鼠中抗PD-L1治療的有效性有顯著影響（圖1G-1 I）。相比之下，對照組B16F10腫瘤沒有抑制作用（圖1I和1J）。因此，敲除Setd2使KC胰腺癌和B16F10黑色素瘤對免疫檢查點阻斷敏感。

圖1：Setd2敲除使小鼠腫瘤對PD-L1免疫治療敏感

2. SETD2失活通過上調(diào)Stat1激活IFNγ通路

        為了確定由Setd2調(diào)節(jié)的全基因表達模式，作者在配對的KC-KO/KC-WT C57BL/6同種異體移植腫瘤體內(nèi)和KC-sgSetd2/KC對照細胞體外進行RNA-seq。GSEA顯示，在KC-KO腫瘤和KC-sgSetd2細胞中，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細胞因子產(chǎn)生、干擾素-γ（IFNγ）反應(yīng)、抗原加工和提呈的基因集顯著上調(diào)（圖2A）。IFNγ通路在腫瘤對免疫治療的反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。在KC-KO腫瘤和KC-sgSetd2細胞中，IFNγ通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT1 27顯著上調(diào)和激活（圖2B和2C）。在B16F10-sgSetd2細胞中，通過WB和RT-qPCR進一步證明了SETD2-STAT1調(diào)節(jié)（圖2D和2E）。此外，SETD2失活在體外（圖2F和2G）和體內(nèi)（圖2H）上調(diào)了IFNγ誘導(dǎo)的趨化因子基因Cxcl9，Cxcl10和Cxcl11。STAT1-IFNγ調(diào)節(jié)軸被報道通過招募CXCR3+CD8+T細胞和CXCR3+NK細胞來促進抗腫瘤免疫。綜上所述，這些結(jié)果表明敲除Setd2增加了STAT1的表達和激活，然后激活了IFNγ通路，從而促進免疫相關(guān)基因的表達和免疫相關(guān)通路的激活。

圖2：敲除Setd2誘導(dǎo)STAT1表達和激活

3. 敲除SETD2促進PD-L1表達和抗原遞呈

        眾所周知，IFNγ-JAK-STAT1軸是促進PD-L1表達和MHC-I抗原加工和呈遞的主要途徑。在作者的Setd2缺陷小鼠模型中，除了趨化因子基因之外，還發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達和抗原遞呈增強。在Setd2敲除細胞和同種異體移植腫瘤中，通過RT-qPCR在轉(zhuǎn)錄水平證實了Pdl1的上調(diào)（圖3A和3B）。如圖3C和3D所示，細胞膜上的PD-L1蛋白表達增加。據(jù)報道，PD-L1的上調(diào)導(dǎo)致有效的免疫抑制和腫瘤免疫逃逸，這解釋了Setd2缺陷腫瘤發(fā)生免疫抑制的潛在原因。RT-qPCR還顯示Setd2敲除細胞中MHC-I復(fù)合物核心基因H2K1的上調(diào)（圖3E），細胞表面的H-2Kb /Db蛋白表達水平持續(xù)增加（圖3F）。體內(nèi)進一步證實了H2-K1的上調(diào)（圖3B）。GSEA結(jié)果顯示敲除Setd2促進MHC-I抗原加工和提呈。此外，細胞中SIINFEKL-H-2Kb水平上調(diào)（圖3G），體外和體內(nèi)試驗表明敲除Setd2使KC細胞對CD8+OT-1細胞介導(dǎo)的殺傷更敏感（圖3H）。

圖3： 敲除Setd2促進IFNγ-STAT1誘導(dǎo)的PD-L1表達和MHC-I抗原遞呈

4.失活SETD2通過下調(diào)Nr2f1促進Stat1表達

        SETD2的大部分功能由H3K36me3介導(dǎo)，進行ChIP-seq繪制H3K36me3在KC-WT和KC-KO中的分布，觀察失活SETD2通過H3K36me3缺失誘導(dǎo)染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄輸出的改變。通過ATAT-seq評估敲除Setd2后對Stat1表達的染色質(zhì)可及性的影響。ChIP-seq和ATAC-seq顯示H3K36me3沉積和Stat1染色質(zhì)可及性沒有顯著差異，表明Stat1可能表達間接受Setd2調(diào)控。轉(zhuǎn)錄水平上Stat1的減少使作者確定了敲除Setd2可能調(diào)節(jié)增加Stat1轉(zhuǎn)錄的潛在轉(zhuǎn)錄因子的表達。Nr2f1是差異表達基因中最顯著的下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，且敲除Setd2的細胞中ChIP-seq的H3K36me3富集和ATAC-seq的染色質(zhì)可及性的下降（圖4A和4B）。為了通過實驗研究Stat1轉(zhuǎn)錄是否由NR2F1調(diào)節(jié)，將Nr2f1慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到Setd2敲除和對照細胞中（圖4C），并通過RT-qPCR和WB（圖4D）證實Stat1表達的降低，且一系列IFNγ誘導(dǎo)的基因下調(diào)（圖4E）。此外，為了評估NR2F1是否直接與Stat1啟動子結(jié)合，作者構(gòu)建了Flag-Nr2f1慢病毒載體，并確定了其抑制STAT1表達和激活的能力。通過ChIP-qPCR檢測證實了直接結(jié)合（圖4F）。此外，GFP報告基因檢測顯示NR2F1顯著抑制了Stat1啟動子驅(qū)動的GFP表達（圖4G和4H）。這些結(jié)果表明了敲除Setd2是通過降低Nr2f1基因體上的H3K36me3沉積和減少Nr2f1啟動子區(qū)域近端的染色質(zhì)可及性，從而進一步增加了STAT1的表達和激活。

圖4： Setd2失活通過下調(diào)Nr2f1表達誘導(dǎo)STAT1表達和激活

5. SETD2失活重編程腫瘤免疫微環(huán)境

        為了系統(tǒng)地闡明SETD2-NR2F1-STAT1軸對腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)，作者建立了Setd2-敲除（KC-KO）和Setd2-野生型（KC-WT）細胞系，并在C57BL/6同種異體移植腫瘤中進行RNA-seq。通過單樣本基因集富集（ssGSEA）和ESTIMATE分析，KC-KO腫瘤的免疫細胞浸潤顯著高于KC-WT腫瘤（圖5A）。許多免疫相關(guān)基因，包括免疫抑制基因Cd274、Ctla4、Lag3和Ido1，在KO腫瘤中上調(diào)。此外，一些免疫刺激基因和趨化因子如Ccl5和Cxcl10基因的表達，在KO腫瘤中也上調(diào)（圖5B）。PBS治療的C57BL/6免疫活性小鼠分離的敲除Setd2和對照中分選CD45+免疫細胞的單細胞RNA-seq（scRNA-seq）分析顯示，浸潤T細胞、中性粒細胞、NK細胞和樹突狀細胞的比例顯著增加，而與對照相比，Setd2缺陷腫瘤中浸潤巨噬細胞的比例顯著降低（圖5C和5D）。鑒于腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）的雙重功能，作者們將巨噬細胞重新聚集到M1樣和M2樣巨噬細胞中，發(fā)現(xiàn)這兩種類型的巨噬細胞比例都有所下降，而在Setd2缺陷腫瘤中，M2樣巨噬細胞急劇減少（圖5E和5F）。鑒于T細胞在抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵作用，作者又根據(jù)其功能和標(biāo)記基因注釋了T細胞亞群（圖5G）。在Setd2敲除的同種異體移植物中，初始和效應(yīng)T細胞亞群（包括初始CD4+T細胞、調(diào)節(jié)性CD4+T細胞（Treg）、CD4+輔助T細胞、初始CD8+T細胞和效應(yīng)CD8+T細胞）的浸潤顯著增強，主要表現(xiàn)為效應(yīng)CD8+T細胞和Treg的增加（圖5H）。這些結(jié)果表明Setd2下降是通過減少M2巨噬細胞浸潤和增加效應(yīng)T細胞浸潤來加劇腫瘤微環(huán)。為了進一步探索CD8+T細胞在PD-L1治療中的作用，評估了CD8+T細胞的狀態(tài)。結(jié)果表明，在PD-L1免疫治療的KC-sgSetd2腫瘤中，細胞毒性CD8+T細胞的比例顯著增加（圖5I和5J），PD-L1免疫治療調(diào)節(jié)CD8+T細胞的分化，使其在Setd2表達和Setd2敲除腫瘤中從耗盡狀態(tài)轉(zhuǎn)為細胞毒性狀態(tài)。流式細胞術(shù)分析進一步證實， PD-L1治療顯著增加了Setd2敲除的皮下同種異體移植體中CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的浸潤（圖5K和5L）。綜上可知，一方面，Setd2缺乏促趨化因子的產(chǎn)生，通過增加T細胞的浸潤來刺激免疫微環(huán)境，增強抗原遞呈，激活CD8+T細胞介導(dǎo)的殺傷。另一方面，STAT1的激活促進免疫抑制檢查點分子如PD-L1的表達，與抗腫瘤免疫相競爭。所有這些機制都有助于ICI免疫治療。

圖5：腫瘤內(nèi)免疫浸潤的Bulk RNA-seq和scRNA-seq

6. 人類癌癥中的SETD2-NR2F1-STAT1軸

        為了證實小鼠腫瘤中SETD2失活抑制STAT1表達且以NR2F1依賴性方式激活的發(fā)現(xiàn)，作者在人胰腺導(dǎo)管腺癌細胞系YAPC中用單個SETD2 sgRNA敲除SETD2（圖6A）。在mRNA和蛋白水平上證實STAT1表達升高，在YAPC-sgSETD2細胞中也證實了STAT1激活介導(dǎo)CXCL10和PDL1的上調(diào)（圖6A和6B）。接下來，作者進行了GSEA分析，以獲得SETD2敲除和對照YAPC細胞轉(zhuǎn)錄組差異的全局視圖。SETD2敲除的YAPC細胞中富集了幾種途徑，類似于KC-sgSetd2細胞中的基因特征（圖6C），免疫相關(guān)基因的表達也像KC-KO細胞一樣增加（圖6D）。對胰腺癌隊列公共數(shù)據(jù)集的分析顯示，SETD2和STAT1表達、NR2F1和STAT1表達以及SETD2和PDL1表達之間存在負(fù)相關(guān)（圖6E和6F）。根據(jù)SETD2和NR2F1的表達水平進一步完善了隊列。非配對比較顯示，在SETD2高表達的腫瘤中STAT1和PDL1的表達較低（圖6G），在NR2F1低表達的腫瘤中STAT1的表達顯著增加（圖6G），這與小鼠腫瘤中的發(fā)現(xiàn)一致。接下來，基于SETD2表達水平的人類胰腺癌隊列中差異表達基因的GSEA也顯示了與SETD2敲除的YAPC細胞中鑒定的相同的富集基因特征。最后，用經(jīng)過驗證的SETD2和NR2F1抗體對75例胰腺導(dǎo)管腺癌患者組成的人體組織芯片進行免疫組化，并證明SETD2和NR2F1表達顯著正相關(guān)（圖6H和6I）。接下來，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集，SETD2在透明腎細胞癌中以高患病率（16%）發(fā)生突變，這些突變中的大多數(shù)是失活突變，并導(dǎo)致完整蛋白質(zhì)表達的喪失。通過TCGA和RECA-歐盟（ICGC）隊列中ccRCC腫瘤的基因組分析顯示，NR2F1和STAT1、SETD2的表達與免疫抑制基因CTLA-4、IDO1、HAVCR2和LAG3呈負(fù)相關(guān)（圖6J），SETD2和NR2F1的表達呈正相關(guān)（圖6K）。SETD2高表達腫瘤中NR2F1的mRNA水平顯著高于SETD2低表達和SETD2失活腫瘤（圖6L）?？傮w而言，這些結(jié)果表明SETD2-NR2F1-STAT1調(diào)節(jié)的機制在人類癌細胞系和患者樣本中高度保守，突出了SETD2失活在ICI免疫治療人類癌癥療效中的作用。

圖6： 人類腎透明細胞癌和胰腺癌中的SETD2-NR2F1-STAT1軸

7. 攜帶SETD2突變的癌癥患者可從ICI免疫治療中獲益

        檢索并分析了1662例接受ICI免疫治療的晚期癌癥患者的基因組和臨床結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)。在476個癌癥基因中，127個基因與免疫治療的有益效果相關(guān)。排名靠前的基有已知的ICI治療預(yù)測生物標(biāo)志物，包括TP53、PAK7、TET1、PTPRD/PTPRT和STK11。SETD2在476個基因中排名前三。SETD2失活突變的患者免疫治療的效果更好（圖7A和7B）。這一結(jié)果在額外的黑色素瘤（圖7C，D）和非小細胞肺癌隊列中得到了外部驗證。

圖7： SETD2突變的患癌患者的ICI免疫治療療效更好

結(jié)論

        總體而言，作者從細胞系、基因小鼠模型和患者標(biāo)本中獲得的數(shù)據(jù)揭示了SETD2失活通過NR2F1-STAT1信號通路增強腫瘤免疫原性和激活腫瘤免疫微環(huán)境的重要意義。這項工作不僅為SETD2腫瘤抑制生物學(xué)提供了見解，還提供了SETD2突變癌癥可以從ICI免疫治療中受益的證據(jù)，突出了SETD2突變體在指導(dǎo)免疫治療中的預(yù)測價值。

實驗方法

        蛋白質(zhì)印跡分析，細胞培養(yǎng)，小鼠實驗，基因集富集分析（GSEA），流式細胞術(shù)，ChIP-seq，ATAC-seq，RNA-seq，ChIP-qPCR，批量RNA-seq和單細胞RNA-seq分析，軌跡分析，免疫組織化學(xué)染色

參考文獻

        Zheng Xufen, Luo Yuxiang, Xiong Yangjie et al. Tumor cell-intrinsic SETD2 inactivation sensitizes cancer cells to immune checkpoint blockade through the NR2F1-STAT1 pathway. [J]. J Immunother Cancer, 2023, 11: undefined.