SRSF2作為mRNA上m5C的讀取器發(fā)揮了意想不到的作用
一種常見的mRNA修飾是5-甲基胞嘧啶（m5C），其在基因轉(zhuǎn)錄加工和癌癥中的作用尚不清楚。在本研究中，作者確定了富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子2 （SRSF2）是m5C的讀者，而受損的SRSF2與m5C的結(jié)合是白血病發(fā)生的潛在因素。在結(jié)構(gòu)上，作者鑒定了參與m5C識(shí)別的殘基，以及流行的白血病相關(guān)突變SRSF2P95H的影響。作者發(fā)現(xiàn)SRSF2結(jié)合和m5C在轉(zhuǎn)錄本內(nèi)共定位。此外，敲低m5C的作者NSUN2會(huì)降低mRNA m5C，減少SRSF2的結(jié)合，并改變RNA的剪接。作者還表明，SRSF2P95H突變損害了該蛋白讀取m5C標(biāo)記mRNA的能力，顯著降低了其與白血病細(xì)胞中關(guān)鍵白血病相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合。在白血病患者中，NSUN2低表達(dá)導(dǎo)致mRNA m5C低甲基化，聯(lián)合SRSF2P95H預(yù)測不良預(yù)后?？傊髡邚?qiáng)調(diào)了表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)和一個(gè)關(guān)鍵的腫瘤發(fā)生驅(qū)動(dòng)因素之間尚未認(rèn)識(shí)到的機(jī)制聯(lián)系。本文于2023年7月發(fā)表于《Molecular Cell》，IF：14.5。
摘要圖
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. SRSF2優(yōu)先結(jié)合m5C修飾的RNA
鑒定m5C結(jié)合蛋白是更好地理解m5C對RNA的生物學(xué)影響的重要一步。為了找到m5C結(jié)合蛋白，作者進(jìn)行了RNA下拉分析，然后進(jìn)行了質(zhì)譜分析。作者發(fā)現(xiàn)只有一種蛋白對生物素化的m5CRNA寡核苷酸表現(xiàn)出顯著的結(jié)合偏好： SRSF2（圖1A）。然而，盡管SRSF2與m5CRNA寡核苷酸的結(jié)合明顯增加，但其他SR蛋白沒有明顯變化（圖1）。這證實(shí)了實(shí)驗(yàn)的可靠性和在C（m5C）GG背景下SRSF2對m5C的特異性。此外，與對照相比，m5C對內(nèi)源性和過表達(dá)的SRSF2的下拉混合物的富集程度更高（圖1C）。與此一致，重組SRSF2在無細(xì)胞環(huán)境中對m5C探針表現(xiàn)出強(qiáng)烈的偏好，表明直接結(jié)合（圖1D）。
圖1 SRSF2優(yōu)先與m5C修飾的RNAs結(jié)合
為了在活細(xì)胞上證實(shí)上述SRSF2-m5C相互作用并定量監(jiān)測這種相互作用，作者進(jìn)行了基于納米熒光素的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（NanoBRET）實(shí)驗(yàn)。首先，作者測試了m5C標(biāo)記和未標(biāo)記的RNA示蹤探針（稱為示蹤- m5C和示蹤-C）對NanoBRET的適用性。在所有濃度下，示蹤劑m5C都比示蹤劑C產(chǎn)生更強(qiáng)的BRET信號(hào)（圖1E）。然后，作者使用冷（未標(biāo)記）RNA進(jìn)行競爭性結(jié)合，發(fā)現(xiàn)冷RNA以濃度依賴的方式減弱BRET信號(hào)，這表明BRET信號(hào)是由示蹤劑與納米熒光素酶（NLUC）融合的SRSF2特異性可逆相互作用產(chǎn)生的（圖1F）。用冷RNA取代示蹤RNA，可以確定SRSF2與不同RNA序列結(jié)合的相對親和力利用SRSF2-N進(jìn)行的競爭實(shí)驗(yàn)表明，cold-m5C對示蹤劑C的競爭能力顯著高于cold-C（圖1G）。綜上所述，這些結(jié)果支持SRSF2在體外和活細(xì)胞中優(yōu)先結(jié)合攜帶m5C的RNA的觀點(diǎn)。
圖2 轉(zhuǎn)錄組SRSF2結(jié)合譜，mRNA m5C圖譜，以及SRSF2結(jié)合和m5C的共存
2. 轉(zhuǎn)錄組SRSF2結(jié)合譜
在6844個(gè)轉(zhuǎn)錄本中共鑒定出10928個(gè)SRSF2結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。SRSF2主要富集于外顯子區(qū)域（圖2B），這與已知的蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合一致。隨后的基序分析顯示，在峰中心存在CAG（C/G）CUGR基序（圖2C）和其他含有SSNG的基序，包含SSNG序列的典型SRSF2結(jié)合位點(diǎn)如圖2D所示，并通過RNA免疫沉淀- qPCR （RIP-qPCR）進(jìn)行驗(yàn)證（圖2E）?？偟膩碚f，作者發(fā)現(xiàn)SRSF2主要結(jié)合外顯子的CDS區(qū)域，優(yōu)先結(jié)合胞嘧-鳥嘌呤（CG）豐富的SSNG基序。
圖3 NSUN2的缺失降低了m5C水平，改變了SRSF2的mRNA結(jié)合親和力，并導(dǎo)致與SRSF2缺失相似的RNA剪接變化
3. 在轉(zhuǎn)錄組中，SRSF2結(jié)合攜帶m5C的mRNA
然后，作者評(píng)估了轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m5C景觀。在4，684個(gè)轉(zhuǎn)錄本中共鑒定出6，913個(gè)m5C峰（圖2F）。在mRNA中，最豐富的m5C峰出現(xiàn)在CDSs中，聚集在翻譯起始位點(diǎn)的下游區(qū)域（圖2G）。有趣的是，通過整合內(nèi)部SRSF2 PAR-CLIP-seq和RNA m5C MeRIP-seq數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)SRSF2結(jié)合位點(diǎn)非常頻繁地出現(xiàn)在m5C峰中心（圖2H）?？傊?，這些結(jié)果提供了SRSF2直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄組中m5C標(biāo)記序列子集的證據(jù)。
4. NSUN2缺失會(huì)降低m5C水平并改變SRSF2的RNA結(jié)合親和力
由于SRSF2優(yōu)先結(jié)合m5C修飾的RNA，作者接下來想知道減少m5C標(biāo)記如何影響轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的SRSF2結(jié)合。為了研究這一點(diǎn)，作者首先通過m5C質(zhì)譜和m5C MeRIP-seq驗(yàn)證了NSUN2敲低（KD） HeLa細(xì)胞中mRNA m5C水平顯著降低（圖3A、3B）。然后，作者在對照和NSUN2 KD細(xì)胞上進(jìn)行SRSF2 PAR-CLIP，然后進(jìn)行RNA生物素標(biāo)記試驗(yàn)或高通量測序NSUN2 KD與對照組的差異結(jié)合分析顯示，共有3，426個(gè)SRSF2差異結(jié)合位點(diǎn)，其中約65%顯示NSUN2 KD后的結(jié)合喪失，35%顯示結(jié)合增強(qiáng)（圖3C）。因此，這并不支持SRSF2結(jié)合的增加是由于NSUN2低時(shí)其他m5C調(diào)節(jié)因子表達(dá)的代償性改變的假設(shè)。接下來，作者想知道當(dāng)m5C水平較低時(shí)，SRSF2與SSNG基序的結(jié)合如何改變。雖然觀察到相同基序的富集，但作者發(fā)現(xiàn)含C基序（GCAG）在增益位點(diǎn)的排名低于損失位點(diǎn)，而不含C基序（GGGG）的排名更高（圖3）。這一發(fā)現(xiàn)表明，當(dāng)NSUN2減少時(shí)，SRSF2向不含C的結(jié)合位點(diǎn)重定向。
圖3E顯示了失去SRSF2結(jié)合和在NSUN2 KD上顯示較低m5C水平的位點(diǎn)的代表性覆蓋軌跡。含有siNSUN2缺失位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞生物學(xué)類別（如RNA剪接）和腫瘤發(fā)生相關(guān)類別（如“AML”）中富集。這表明在NSUN2缺失的細(xì)胞中觀察到的SRSF2結(jié)合譜的改變不影響翻譯。
5. NSUN2和SRSF2的缺失同樣會(huì)改變RNA剪接，剪接事件附近的m5C位點(diǎn)和SRSF2結(jié)合位點(diǎn)富集
考慮到SRSF2在RNA剪接中的眾所周知的功能，以及在顯示siNSUN2相關(guān)的結(jié)合缺失的SRSF2結(jié)合靶標(biāo)中，RNA剪接類別被過度代表，作者假設(shè)NSUN2通過在RNA中添加m5C標(biāo)記，影響SRSF2驅(qū)動(dòng)的選擇性剪接。如果是這樣的話，NSUN2缺失應(yīng)該會(huì)導(dǎo)致類似于SRSF2缺失所導(dǎo)致的剪接模式改變。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者進(jìn)行了RNA測序（RNA-seq）并分析了RNA剪接（圖3F）同樣，在NSUN2 KD中鑒定的73.3%的DS基因也在SRSF2 KD細(xì)胞中鑒定出來（圖3G），典型的剪接事件如圖3H所示?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明NSUN2缺失對選擇性剪接的影響類似于SRSF2缺失。
圖4 SRSF2P95H突變降低了SRSF2的m5C結(jié)合親和力
鑒于這一觀察結(jié)果，作者接下來研究了m5C修飾和SRSF2結(jié)合是否可能發(fā)生在NSUN2-和SRSF2相關(guān)的剪接事件中。作者使用內(nèi)部m5C MeRIP-seq數(shù)據(jù)和公開的RNA-BisSeq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，一致顯示SRSF2結(jié)合位點(diǎn)和m5C位點(diǎn)與剪接事件非常接近（圖3I）。這有力地支持了作者的發(fā)現(xiàn)，即SRSF2作為m5C結(jié)合蛋白，并提示m5C、SRSF2和RNA剪接之間存在關(guān)聯(lián)。
作者進(jìn)一步將共發(fā)生的差異剪接基因（2367個(gè)基因）與SRSF2結(jié)合靶點(diǎn)重疊。1058個(gè)SRSF2結(jié)合靶點(diǎn)的一個(gè)重要子集也被差異拼接（圖3J）。這些觀察結(jié)果，以及作者關(guān)于SRSF2結(jié)合m5C標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，表明SRSF2通過其讀取器功能參與了NSUN2介導(dǎo)的m5C的選擇性剪接作用。
6. 流行疾病相關(guān)的P95H突變降低了SRSF2對RNA m5C的結(jié)合親和力
白血病中經(jīng)常報(bào)道各種體細(xì)胞SRSF2突變，這些突變對發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。發(fā)現(xiàn)SRSF2結(jié)合含有m5C的RNA促使作者研究這些疾病相關(guān)突變是否改變了SRSF2與m5C的優(yōu)先結(jié)合。為了回答這個(gè)問題，作者測試了SRSF2 N端區(qū)域的幾個(gè)突變：T51A、K52A、P95H、H99A和P107H.28有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)與P95H變體相比，其他SRSF2突變形式評(píng)估保持對m5C的偏好（圖4A）。
利用NanoBRET，作者發(fā)現(xiàn)與SRSF2WT相比（Ki，app = 22.9 nM;圖1G）， SRSF2P95H （Ki，app = 43.4 nM;圖4B）顯示了較高的Ki，app值，即對甲基化RNA的親和力較低。這些結(jié)果一致表明，P95H突變降低了SRSF2與RNA m5C結(jié)合的親和力。
7. m5C與WT或突變體SRSF2相互作用的結(jié)構(gòu)建模，并通過平衡結(jié)合親和測量驗(yàn)證
先前的核磁共振結(jié)構(gòu)揭示了SRSF2 N端結(jié)構(gòu)域和RNA相互作用的模式（PDB： 2LEB）單鏈己核苷酸RNA （5 ' -U1C2C3A4G5U6-3 '）適合于由SRSF2的中心β片和鉸鏈區(qū)域（Lys91-His99）發(fā)出的帶正電的芳香氨基酸形成的凹槽（圖4C，左）。在C3堿基的沃森克里克邊緣和Arg61側(cè)鏈之間的兩個(gè)直接氫鍵賦予了第二胞嘧啶（C3）的堿基特異性29有趣的是，C3堿的另一面通過與Pro95的范德瓦爾斯（vdW）接觸而穩(wěn)定。作者在這個(gè)位置（C3）建模了m5C（圖4C，中間）。有趣的是，m5C的甲基部分似乎通過額外的vdW與Arg94和Pro95的蛋白主鏈原子從一側(cè)接觸，以及與RNA的第一胞嘧啶（C2）的核糖部分從另一側(cè)接觸而穩(wěn)定下來（圖4C，右上）。模型組氨酸的側(cè)鏈?zhǔn)冀K與RNA的磷酸主鏈發(fā)生空間沖突（圖4C，右下）。此外，作者對其他SRSF2突變體的相互作用進(jìn)行了建模（圖S4B）。Arg95 （R95）在AML/CMML患者中的突變頻率低于H95也可能與m5C發(fā)生立體沖突。Ala95 （A95）是AML/CMML患者中的一種罕見突變，可能危害較小，并且似乎不會(huì)與m5C堿基或RNA主干發(fā)生沖突?？傊?，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了Pro95在SRSF2-m5C相互作用中的關(guān)鍵作用。最后，基于熒光偏振（FP）的實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)了野生型（WT） SRSF2 RRM與含有m5C的RNA結(jié)合更緊密，而P95H突變體更傾向于未甲基化的RNA序列（圖4D）。
因此，作者的結(jié)構(gòu)研究和FP分析表明，SRSF2特異性識(shí)別m5C修飾RNA的分子機(jī)制，從而可能解釋WT SRSF2如何更緊密地與含有m5C的RNA結(jié)合，而白血病相關(guān)的Pro95突變體，如P95H突變體，更傾向于未甲基化的RNA序列。
圖5 mRNA m5C調(diào)控轉(zhuǎn)錄物在白血病中的參與
8. SRSF2在NSUN2 KD和P95H突變白血病細(xì)胞中的RNA結(jié)合譜
然后，作者在白血病細(xì)胞模型中探索了P95H突變和RNA低甲基化如何影響SRSF2與mRNA的結(jié)合。關(guān)注顯示SRSF2差異結(jié)合的位點(diǎn)，作者發(fā)現(xiàn)在對照細(xì)胞中鑒定的共有1933個(gè)SRSF2結(jié)合位點(diǎn)在shNSUN2細(xì)胞中丟失，在SRSF2P95H突變細(xì)胞中丟失了2280個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。接下來，作者比較了以下位點(diǎn)子集的分布：shNSUN2 -缺失或獲得位點(diǎn)（NSUN2缺失或獲得）和p95h -缺失或獲得位點(diǎn)（SRSF2P95H細(xì)胞中的缺失或獲得）。
當(dāng)作者比較這兩種情況下顯示結(jié)合缺失的位點(diǎn)時(shí)，作者觀察到1203個(gè)結(jié)合位點(diǎn)重疊，對應(yīng)于62.3%的shNSUN2缺失位點(diǎn)（圖5B）。這一結(jié)果表明，NSUN2缺失和SRSF2P95H突變可能類似地影響SRSF2與某些靶標(biāo)的結(jié)合。引人注目的是，已知重疊區(qū)有104個(gè)結(jié)合位點(diǎn)編碼白血病相關(guān)基因，例如ZESTE同源物增強(qiáng)子2 （EZH2）、溴結(jié)構(gòu)域蛋白4 （BRD4）、剪接因子3B亞基1 （SF3B1）和原肌球蛋白3 （TPM3）（圖5B和5C）。NSUN2 KD和SRSF2P95H突變都改變了SRSF2與mRNA的結(jié)合，特別是與白血病相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合，這一事實(shí)強(qiáng)調(diào)了m5C識(shí)別在白血病發(fā)生中的潛在參與。
9. NSUN2缺失導(dǎo)致與SRSF2突變相當(dāng)?shù)娜?span>RNA剪接改變
作者首先研究了在NSUN2缺失或SRSF2P95H突變細(xì)胞中觀察到的SRSF2結(jié)合譜的改變是否與翻譯有關(guān)。研究表明，SRSF2P95H突變體改變了與癌癥發(fā)展有關(guān)的大量基因的RNA剪接譜。因此，作者對NSUN2 KD和SRSF2P95H K562細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序，分析RNA剪接模式（圖5D），這表明NSUN2缺失和SRSF2突變介導(dǎo)的rna剪接改變共同影響許多下游生物功能。
接下來，作者研究了SRSF2結(jié)合位點(diǎn)與其他剪接事件位點(diǎn)的距離。與HeLa細(xì)胞的研究結(jié)果一致（圖3I），作者發(fā)現(xiàn)在對照細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的SRSF2結(jié)合位點(diǎn)，而不是隨機(jī)選擇的位點(diǎn)，優(yōu)先位于NSUN2缺失或SRSF2P95H突變細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的剪接事件周圍（圖5E）。此外，作者發(fā)現(xiàn)大約26%-32%的差異剪接基因是SRSF2結(jié)合靶點(diǎn)，在NSUN2缺失或SRSF2突變時(shí)發(fā)生改變（圖5F）。有趣的是，這些差異剪接的SRSF2結(jié)合靶點(diǎn)在RNA剪接類別中顯著豐富（圖5G）。這些結(jié)果表明，NSUN2缺失和SRSF2突變通過影響其他RNA剪接因子的結(jié)合和剪接，導(dǎo)致SRSF2直接結(jié)合靶點(diǎn)和間接靶點(diǎn)的選擇性剪接。
10. NSUN2高、低水平CMML患者單核細(xì)胞中RNA m5C的分布
為了在單堿基分辨率下分析白血病患者轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m5C甲基化，作者分離了8名CMML患者的外周血單核細(xì)胞，并對核糖缺失的RNA進(jìn)行了RNA-BisSeq檢測（圖6A）。作者發(fā)現(xiàn)NSUN2-low患者的m5C位點(diǎn)數(shù)量明顯低于NSUN2-high患者（圖6B）。然后檢查mRNA中m5C位點(diǎn)的分布概況，發(fā)現(xiàn)與m5C相關(guān)程度最高的區(qū)域是CDS，特別是翻譯起始位點(diǎn)的下游區(qū)域（圖6C）。這些模式與作者對HeLa細(xì)胞的m5C MeRIP-seq數(shù)據(jù)以及先前對小鼠組織和正常和腫瘤來源的人類組織的報(bào)道一致值得注意的是，與NSUN2高的患者相比，NSUN2低的患者在mRNA外顯子區(qū)域（尤其是CDSs）出現(xiàn)m5C位點(diǎn)的頻率更低（圖6C）。
圖6 NSUN2高或低水平CMML患者單核細(xì)胞中RNA m5C的轉(zhuǎn)錄組全分布
鑒于上述觀察結(jié)果，NSUN2 -低患者的m5C位點(diǎn)計(jì)數(shù)較低，作者進(jìn)一步比較了m5C標(biāo)記mRNA轉(zhuǎn)錄物的甲基化水平。作者觀察到NSUN2低患者的m5C水平顯著降低（圖6D）。與此一致的是，熱圖顯示大多數(shù)m5C修飾的轉(zhuǎn)錄本在NSUN2 -低患者中低甲基化（圖6E）。這些結(jié)果表明，低NSUN2水平導(dǎo)致CMML患者單核細(xì)胞中低m5C水平?；蚣患治觯?span>Gene set enrichment analysis， GSEA）顯示炎癥反應(yīng)途徑明顯被過度代表，并且與NSUN2-高患者相比，NSUN2-低患者的m5C差異呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)（圖6F）。值得注意的是，CMML單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征已被報(bào)道為高度炎癥，有助于惡性擴(kuò)張，并反映白血病特異性和年齡相關(guān)的改變
11. 在SRSF2P95H突變的AML患者中，NSUN2而非NSUN6的低表達(dá)與預(yù)后不良顯著相關(guān)
接下來，作者探索了NSUN2在大量白血病患者中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)NSUN2在CMML和AML患者中的表達(dá)顯著下調(diào)（圖7A）。NSUN2在患者中的整體低表達(dá)促使作者研究NSUN2的臨床作用。
圖7 在SRSF2P95H突變的AML患者中，NSUN2低表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)
為了探索m5C相關(guān)基因在白血病中的臨床相關(guān)性，作者首先對246名AML患者（標(biāo)記為“Bamopoulos等人”）組成的公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行了生存分析如先前報(bào)道，SRSF2P95H患者的總生存期（OS）比非P95H突變（稱為“WT”）患者短。然后，作者研究了m5C撰寫者NSUN2的豐度與患者預(yù)后之間的關(guān)系。NSUN2高、低WT患者的OS無顯著差異。然而，引人注目的是，NSUN2 -低SRSF2P95H組的預(yù)后明顯較差，1年生存率僅為20%（圖7B）。與此一致的是，單Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，對于NSUN2低的SRSF2P95H突變患者，平均死亡風(fēng)險(xiǎn)比NSUN2高的患者高出約251%（圖7C）。這些發(fā)現(xiàn)通過另一個(gè)隊(duì)列（Beat AML隊(duì)列，36包含451個(gè)樣本）的分析得到驗(yàn)證（圖7D， 7E）。接下來，作者評(píng)估了兩個(gè)AML隊(duì)列中四組患者中關(guān)鍵白血病相關(guān)基因的表達(dá)。在SRSF2P95H突變的NSUN2-低患者中，重要的是， ORM1和LCN2，37，38個(gè)已知與白血病發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的癌基因的表達(dá)顯著升高（圖7F和7G）。
綜上所述，這些結(jié)果表明，在SRSF2P95H突變患者中，低表達(dá)NSUN2而非NSUN6與預(yù)后不良和部分癌基因低表達(dá)具有可重復(fù)性相關(guān)。這表明NSUN2作為SRSF2P95H突變AML患者預(yù)后標(biāo)志物的潛在作用，并突出了NSUN2、SRSF2P95H和腫瘤發(fā)生之間未被認(rèn)識(shí)的聯(lián)系。
總之，作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)以前未被識(shí)別的mRNA上m5C的讀者：SRSF2蛋白，它以參與剪接而為人所知，其殘基95 （P95H）突變與血液系統(tǒng)惡性腫瘤密切相關(guān)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了以前未知的NSUN2/m5C與SRSF2介導(dǎo)的RNA剪接之間的關(guān)聯(lián)。引人注目的是，在白血病患者中，NSUN2低表達(dá)，這與低m5C甲基化水平相關(guān)。低NSUN2與SRSF2突變同時(shí)發(fā)生預(yù)示預(yù)后不良。雖然從突變到疾病的途徑仍有待完全闡明，但作者的研究表明，SRSF2 m5C讀取器功能的損傷可能有助于白血病的進(jìn)展?？偟膩碚f，作者的數(shù)據(jù)確定了RNA修飾和一個(gè)重要的突變依賴因子之間未被識(shí)別的機(jī)制串?dāng)_。
實(shí)驗(yàn)方法：
RNA干擾和轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒，定點(diǎn)突變組氨酸標(biāo)記，蛋白純化，m5C印跡質(zhì)譜分析，逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR，RNA免疫沉淀，PAR-CLIP，MeRIP-seq，RNA- bis-seq。
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