EGFR激活肌成纖維細胞促進胰腺癌轉移

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2024-10-11
EGFR激活的myCAFs促進小鼠PDAC轉移,揭示了雙向惡性細胞-成纖維細胞串擾調節(jié)PDAC myCAF分子和功能異質性并驅動轉移的機制......

 

         胰腺導管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC)是一種高度侵襲性和難治性疾病,預后很差。癌癥相關成纖維細胞(Cancer-associated Fibroblasts,CAFs)是公認的潛在治療靶點,但對異質性細胞群的了解不足限制了治療。本研究表明肌成纖維細胞(myofibroblastic CAFs,myCAFs)中轉化生長因子βTransforming Growth Factor Beta,TGF-β)通過雙調蛋白介導的自分泌過程誘導EGFR/ERBB2信號的傳導。在PDAC類器官衍生培養(yǎng)物和小鼠模型中抑制EGFR/ERBB2信號對不同CAF亞型的影響不同,為其異質性的機制提供了見解。值得注意的是,EGFR激活的myCAFs促進小鼠PDAC轉移,揭示了myCAF異質性中的功能意義。最后,對其他癌癥數(shù)據(jù)集的分析表明,這些過程可能在其他惡性腫瘤中起作用這些數(shù)據(jù)為myCAF異質性提供了功能相關性,并確定了PDAC中預防腫瘤侵襲的候選靶點。

         該研究于20231228日發(fā)表在《Cancer Cell》,IF50.3

技術路線

主要研究結果

1. TGF-βPDAC類器官條件培養(yǎng)基激活myCAFs中的EGFR/ERBB2信號傳導

         TGF-β信號傳導促進PDAC myCAFs的形成和增殖,但尚不清楚該途徑是否在這些細胞中發(fā)揮其他功能。因此,作者描述了PDAC CAF前體細胞——胰腺星狀細胞(Pancreatic Stellate CellsPSCs——TGF-β處理后受體酪氨酸激酶(RTK)的磷酸化。磷酸化表皮生長因子受體(p-EGFR)和磷酸化Erb-B2受體(p-ERBB2)是TGF-β處理后激活的最豐富的RTK,與對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的靜止PSCs相比,它們的水平顯著增加(圖1A1B)。此外,單細胞RNA測序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)集的分析證實了EGFRERBB2在小鼠和人中PDAC CAFs的表達。PSCTGF-β受體IITGFBR2)的缺失阻斷了TGF-β應答基因的誘導、TGF-β依賴性增生和EGFR的激活。這表明TGF-β通過其同源受體TGFBR2激活EGFR。此外,PSCEGFRERBB2的激活快速且持續(xù)抑制TGF-β受體ITGFBR1)(TGFBR1i)(圖1C-E)。由于TGF-β治療4天后仍觀察到持續(xù)的EGFR/ERBB2激活,作者在該時間點對TGF-β-處理的PSCs和對照進行RNA-seq。TGF-β處理的PSCs富集了已知的myCAF相關途徑,包括細胞外基質(ECM)相關、TGF-β-依賴性LRRC15+CAFiCAF特征(圖1F1G)。這些結果驗證了TGF-β處理的PSCs myCAFs中激活的信號通路。此外,該分析顯示TGF-β誘導的myCAFs中膽固醇生成相關特征顯著富集(圖1G)。此外,TGF-β處理PSCs還誘導了與EGFR激活相關的特征,包括KRAS信號傳導、MAPK信號傳導和Dusp6ERK通路的已知靶點)表達增加(圖1F1G)。

         在體外和體內,PDAC惡性細胞均表達TGF-β。此外,PDAC類器官條件培養(yǎng)基(CM)可激活PSCTGF-β通路的下游成員SMAD2,而在CM處理的PSC中,抑制TGF-β信號傳導可增強iCAF表型。這些結果表明,PDAC類器官CM治療PSC可激活myCAF。因此,在PDAC類器官分泌TGF-β基礎上,評估了PDAC類器官CM是否激活PSC中的EGFR/ERBB2信號傳導。PDAC類器官CM誘導PSC中的EGFRERBB2激活,這被EGFRERBB2受體雙重抑制劑(ERBBi)內拉替尼阻斷(圖2A)。除了TGF-β,PDAC類器官還表達EGFR/ERBB2配體,這可能有助于促進myCAFFEGFR/ERBB2的激活。為了更好地表征EGFR/ERBB2激活的CAFs,作者在存在或不存在ERBBi的情況下對CM處理的PSCs進行RNA-seq。通過將TGF-βCM誘導的基因與EGFR/ERBB2抑制下調的基因交叉,發(fā)現(xiàn)了體外myCAF衍生的52個基因的ERBB特征(圖2B)。CM處理的PSCs上調了KRAS信號傳導和Dusp6表達,這些效應被ERBBi阻斷,而沒有顯著改變TGF-β信號傳導激活(圖2C、2D)。此外,膽固醇b生成相關特征是myCAF衍生的ERBB特征中最顯著豐富的途徑之一(圖2C2D)。

         總之,這些數(shù)據(jù)支持PDAC惡性細胞分泌的TGF-β激活小鼠和人PDACmyCAFsEGFR信號傳導。

 


1TGF-β激活myCAFsEGFR/ERBB2信號傳導


2myCAFsTGF-β誘導的自分泌雙調蛋白激活EGFR信號

 

2.TGF-β誘導的自分泌雙調蛋白激活myCAFs中的EGFR信號傳導

         在TGF-β處理30分鐘后,PSCsEGFR信號的早期激活似乎是由增加的受體介導的(圖1D)。為了研究TGF-β誘導的myCAFsEGFR的激活如何持續(xù),作者在RNA-seq圖譜中尋找TGF-βPDAC類器官CM培養(yǎng)的PSCsERBBi存在或不存在時EGFR/ERBB2配體表達。圖譜確定了EGFR/ERBB2配體,包括TGF-β顯著誘導的雙調節(jié)蛋白(Areg)和肝素結合EGF-樣生長因子(Hbegf)(圖2E)。RT-qPCR分析證實了TGF-β-誘導的PSCAregHbegf的表達,Tgfbr2 KOTGFBR1抑制劑(TGFBR1iA83-01治療阻止Areg的表達(圖2FS2D)。此外,在EgfrErbb2缺失或藥理抑制后,AregHbegf表達部分缺失,這表明了AregHbegf作為體外TGF-β誘導的myCAFsEGFR激活的候選介質(圖2F)。然而,AregTGF-βPDAC類器官CM治療顯著誘導的EGFR/ERBB2唯一配體(圖2E)。此外,PSCTGF-β上調AREG蛋白,Tgfbr2缺失或TGFBR1藥物抑制完全阻斷AREG蛋白,但EgfrErbb2缺失或抑制并不能阻斷AREG蛋白(圖2G)。在TGF-β誘導的myCAFs中,直接測試了AREG是否介導EGFR信號的激活,PSCs中刪除Areg基因(圖2H)。與對照組相比,AREG誘導的EGFR持續(xù)激活在AREG KO PSCs中減少(圖2I)。

         因此,PDAC myCAFs中,自分泌AREG介導EGFR激活下游的TGF-β信號

3. 體外抑制EGFR/ERBB2信號轉導耗盡myCAFs

         為了進一步了解EGFR/ERBB2激活如何影響myCAFs,首先測量了立即或延遲(72小時)暴露于ERBBiPSC的增殖,發(fā)現(xiàn)增殖顯著減少,而凋亡沒有增加,這表明EGFR/ERBB2信號傳導介導了TGF-β-誘導的myCAFs的增殖(圖3A、3B)。此外,體外和體內iCAF的缺氧特征在EGFR/ERBB2抑制后增加,相反的,EGFR/ERBB2抑制下調已知的myCAF相關特征(圖3C)。RT-qPCR分析證實了EGFR/ERBB2抑制后iCAF標記的上調(圖3D)。當PSCsPDAC類器官在transwell中共培養(yǎng)時,即使PDAC類器官增殖通過ERBBi治療而減少(圖3E),也觀察到這種效果。

         為了分析更接近體內情況的模型,建立了PDAC類器官與Egfr WTEgfr KO PSC的共培養(yǎng)物。然后通過RNA-seq分析流動排序的惡性細胞和PSC群體(圖3F3G)。與對照相比,Egfr耗竭時PSC中大多數(shù)下調通路由已知的myCAF相關特征構成(圖3H;表S3)。雖然缺氧和體外iCAF特征也被下調,但這可能是由于共培養(yǎng)的惡性細胞的變化,而不是Egfr損失的直接影響。

         總而言之,這些數(shù)據(jù)表明EGFR/ERBB2抑制優(yōu)先針對體外的myCAFs,且只有myCAFs的亞群被耗盡。此外,這些分析突出顯示如何聯(lián)合EGFR/ERBB2抑制,而不是EGFR封鎖單獨,可能需要體內有效靶向EGFR激活的myCAFs。


 

3:體外抑制EGFR/ERBB2信號轉導耗盡myCAFs

 

4. 抑制EGFR/ERBB2信號優(yōu)先靶向體內myCAFs

         為了確定EGFR/ERBB2信號抑制是否差異影響體內不同的CAF亞型,作者用PDAC類器官建立了原位移植小鼠模型,并用EGFR/ERBB2抑制劑(ERBBineratinib治療荷瘤小鼠2周(圖4A)。盡管ERBBi治療后apCAFs沒有顯著改變,但myCAFs減少,iCAFs增加,PDAC腫瘤中myCAF/myCAF的比例顯著改變(圖4B4C)。雖然已被證明藥物抑制時對CAFs形成途徑的相互轉換,但這是否與本研究相關仍有待確定。為了進一步研究EGFR/ERBB2抑制對CAFs的影響,作者建立了另外的PDAC類器官來源的原位移植小鼠模型,并在流式分選惡性細胞和成纖維細胞群體進行RNA-seq分析之前,用ERBBi或載體治療荷瘤小鼠2周(圖4A4D)。與EGFR/ERBB2激活發(fā)生在myCAFs中的發(fā)現(xiàn)一致,與載體治療腫瘤的CAFs相比,來自ERBBi治療腫瘤的CAFs顯著下調了Areg表達和TGF-β誘導的myCAF特征,并顯著上調了體內iCAF特征(圖4E)。此外,先前確定的myCAF亞群如TGF-β依賴性LRRC15+CAFs的特征不受ERBBi治療的影響,表明EGFR/ERBB2抑制可能只會耗盡myCAFs的一個子集。

         為了驗證上述發(fā)現(xiàn)并進一步研究EGFR/ERBB2抑制后CAF群體的變化,作者對用ERBBi或載體治療2周的PDAC腫瘤進行了單核RNA測序(snRNA-seq)(圖4A4F、4G)。Dusp6表達的下調證實了多種細胞類型中對該通路的靶向作用,DEGs分析確定上皮細胞和CAFsEGFR/ERBB2抑制后受影響最大的細胞群體(圖4H)。與載體治療的腫瘤相比,ERBBi治療的PDAC腫瘤中iCAF豐度和iCAF相關特征豐富,而myCAF豐度和myCAF相關特征下調(圖4I-4L)。最后,雖然原發(fā)性腫瘤生長和腹水和肝轉移的發(fā)生率沒有顯著影響,但EGFR/ERBB2抑制導致膈肌和肺轉移的小鼠明顯減少(圖4M)。

         總之,這些數(shù)據(jù)表明體內PDAC抑制EGFR/ERBB2靶向myCAFs,并表明在myCAFs的一個亞群中的EGFR/ERBB2通路抑制可能會損害PDAC轉移形成。


 

4:體內抑制EGFR/ERBB2信號優(yōu)先靶向myCAFs

 

5. 抑制EGFR/ERBB2信號轉導耗盡myCAFs的亞群

         雖然數(shù)據(jù)表明EGFR激活的myCAFsPDAC中具有潛在的轉移促進作用,但有文獻表明,α-平滑肌肌動蛋白(αSMA)陽性或HH激活的肌成纖維細胞和細胞外基質成分(如膠原)抑制PDAC進展。與些先前研究以及TGF-β3HH信號傳導抑制相比,ERBBi治療并未減少整體膠原沉積或肌成纖維細胞標志物αSMA的水平(圖5A-5C)。因此,作者評估了EGFR/ERBB2抑制是否僅針對PDAC腫瘤中myCAFs的一個亞群。作者之前研究發(fā)現(xiàn)Thy1(編碼CD90)在myCAFs中高度表達。為了調查ERBBi治療對myCAFs子集的潛在差異影響,作者評估了CD90-CD90+myCAFs(如CD31-CD45-EpCAM-PDPN+Ly6C-MHCII-)豐度的變化。發(fā)消息,EGFR/ERBB2抑制對myCAFs的消耗僅限于CD90?myCAFs,在CD90+myCAFs中有適度增加(圖5D)。

         為了更好地表征CD90- CD90+myCAF群體,建立了PDAC的原位嫁接類器官衍生小鼠模型,并在RNA-seq之前對兩個myCAF群體進行了流動排序(圖5E、5F)。RNA-seq分析證實了兩個myCAF群體的流動排序,顯示與CD90+ myCAFs相比,CD90-myCAFsThy1表達顯著下調(圖5G)。與CD90+ myCAFs相比,CD90- myCAFs具有顯著更高水平的AregDusp6,這表明EGFR信號在CD90- myCAF亞群中更高(圖5G)。這些數(shù)據(jù)為EGFR/ERBB2抑制優(yōu)先靶向CD90- myCAFs提供了解釋。此外,與CD90- myCAFs相比,CD90+ myCAFs具有明顯更高的Acta2Col1a1表達,并且ECM相關特征富集(圖5H5I)。因此,上述數(shù)據(jù)表明,由于靶向產(chǎn)生較少ECMCD90-myCAF亞群,EGFR/ERBB2抑制后膠原沉積和αSMA水平?jīng)]有改變。此外,CD90-myCAFs顯著富集膽固醇生物合成相關特征,這些特征在體外TGF-β誘導的myCAFmyCAF-衍生的ERBB特征中上調(圖5I、1G2C)。此外,CD90- myCAFs顯示出已知體內iCAFmyCAF特征的顯著下調,證實了它們與CD90+myCAFs或其他先前描述的myCAF,包括TGF-β依賴性LRRC15+myCAFs的表型差異(圖5I)。最后,除了Areg,還發(fā)現(xiàn)了許多在CD90?CD90+myCAFs中差異表達的其他分泌蛋白,它們可能介導這些CAF群體的不同功能。具體來說,CD90+myCAFs富含膠原蛋白,已被證明在PDAC中起到腫瘤抑制作用,而CD90-myCAFs上調了編碼分泌蛋白的基因,包括Spp1Sema3e,這些蛋白已被證明促進轉移(圖5J)。

         總的來說,這些數(shù)據(jù)提供了對myCAF異質性的見解,并確定了依賴于EGFR/ERBB2信號激活并可能影響PDAC進展的myCAF亞群。


 

5:抑制EGFR/ERBB2信號轉導耗盡myCAFs亞群

 

6. EGFR激活的myCAFs促進PDAC轉移

         在小鼠模型中的ERBBi研究表明,myCAFs中的EGFR/ERBB2抑制可能會損害PDAC轉移的形成(圖4M)。然而,已有研究報道過PDAC腫瘤中惡性細胞的EGFR信號傳導,snRNA-seq分析確定上皮細胞是ERBBi治療后PDAC腫瘤中受影響最大的細胞類型(圖4H)。因此,為了研究EGFR激活的myCAFsPDAC進展中的作用,建立了PDAC類器官單獨或與Egfr WT(如Rosa26 KO)或Egfr KO PSCs共同注射的原位移植小鼠模型(圖6A)。通過IHC檢測與SV40T抗原永生的共移植PSC,證實EGFR信號在促進CAF增殖。作者評估了CAFsEgfr缺失后的改變是否與EGFR/ERBB2抑制后觀察到的一致,與PDAC+Egfr WT PSC腫瘤相比,PDAC+Egfr KO PSC腫瘤含有更少的myCAFs,更多的iCAFs(圖6B和圖6C)。值得注意的是,來自PDAC+Egfr WT PSC的腫瘤明顯大于單獨來自PDAC的腫瘤(圖6D)。此外,與EGFR/ERBB2抑制后觀察到的相似,它們產(chǎn)生的隔膜轉移、肺轉移和腹水明顯多于單獨PDACPDAC+Egfr KO PSC腫瘤(圖6E-6I)。

         為了研究CAFs中的AREG阻斷是否會重現(xiàn)EGFR信號完全消融的影響,建立了PDAC類器官單獨或與Areg WT(即Rosa26 KO)或Areg KO PSC(圖6JS6I)共同注射的原位移植小鼠模型。與PDAC+Areg WT PSC腫瘤相比,PDAC+Areg KO PSC腫瘤的巨噬細胞明顯減少(圖S6JS6K)。這些發(fā)現(xiàn)與體外分析一致,顯示Egfr缺失下調但不完全確實PSCAreg的表達(圖2F2G),并表明myCAF產(chǎn)生的AREG在成纖維細胞-巨噬細胞串擾中的作用。此外,PDAC+Areg KO PSC腫瘤在整體CAF豐度或iCAF/myCAF比例方面與PDAC相比沒有顯著差異,這些結果表明Areg缺失損害但不完全抑制EGFR信號激活,和myCAF形成(圖2I)。PDAC+Areg WT PSC腫瘤明顯大于單獨來自PDACPDAC+Areg KO PSC的腫瘤(圖6K)。這些發(fā)現(xiàn)也符合體外分析,顯示Egfr缺失并不完全降低PSCAreg的表達,并表明myCAF產(chǎn)生的AREG在局部起作用以促進原發(fā)PDAC生長。最后,PSC中的Areg缺失損害了膈肌轉移、肝轉移和腹水的形成,但對肺轉移沒有影響,進一步突出了CAF介導的PDAC轉移過程的復雜性(圖6L-6N)。

         總之,這些數(shù)據(jù)確定了以前未被認識到的myCAFs的功能復雜性,表明EGFR激活的myCAFs促進PDAC的轉移。此外,這些結果表明,為了更有效地損害其促轉移作用,需要完全消融CAFs中的EGFR信號激活,而不是單獨阻斷AREG。


 

6EGFR激活myCAFs促進PDAC轉移

 

7. EGFR激活的myCAFs促進PDAC惡性細胞的轉移潛能

         為了研究EGFR激活的CAFs促進PDAC轉移的潛在機制,對與Egfr WTEgfr KO PSCs共培養(yǎng)的PDAC類器官中流式分選的RNA-seq進行分析(圖3F3G)。結果看出與Egfr缺失的PSCs培養(yǎng)的類器官中,參與轉移形成的通路顯著下調,包括EMT轉換和缺氧基因特征(圖7A)。為了調查這些變化是否也在體內觀察到,建立了PDAC類器官與Egfr WT(即Rosa26 KO)或Egfr KO PSCs共注射的原位移植小鼠模型,并對流式分選的惡性細胞進行RNA-seq(圖7B7C)。與PDAC+Egfr WT PSC腫瘤流式分選的惡性細胞相比,DAC+Egfr KO PSC分選出的惡性細胞顯示EMT特征下調(圖7D)。還分析了體內EGFR/ERBB2抑制后惡性細胞轉錄組的變化,發(fā)現(xiàn)EGFR激活的myCAFs耗盡。ERBBi-或載體治療2周后,PDAC腫瘤通過流式分選惡性細胞的RNA-seq證實了ERBBi治療后轉移相關通路下調,包括EMT和缺氧基因特征(圖4A4D7E)。這些結果也通過ERBBi-或載體治療2周的腫瘤中PDAC惡性細胞的snRNA-seq分析得到證實,該分析顯示,與載體治療的腫瘤相比,ERBBi治療的腫瘤上皮細胞中EMT和缺氧基因特征顯著下調(圖4A、4F-4H)。

         總之,這些數(shù)據(jù)支持EGFR激活myCAFs通過增強PDAC惡性細胞的轉移潛力促進PDAC轉移形成(圖7G)。


 

7EGFR激活myCAFs促進PDAC惡性細胞的轉移潛能

 

結論

通過互補的體外和體內分析,作者揭示了EGFR激活在PDAC CAFs中以前未知的作用。數(shù)據(jù)顯示TGF-β誘導PDAC myCAFs中的AREG表達,引發(fā)自分泌EGFR/ERBB2反應。該網(wǎng)絡似乎微調了CAF細胞狀態(tài)的平衡,相對于iCAF表型,更有利于myCAF。因此,EGFR/ERBB2抑制優(yōu)先針對myCAFs而不是iCAFs。此外,體內這種效應似乎僅限于EGFR信號激活更高的CD90-myCAFs亞群。最后證明了EGFR激活的myCAFs促進小鼠PDAC轉移,從而揭示了雙向惡性細胞-成纖維細胞串擾調節(jié)PDAC myCAF分子和功能異質性并驅動轉移的機制。

實驗方法

         細胞培養(yǎng)和處理,小鼠實驗,原位移植小鼠模型,蛋白質印跡分析,ELISA檢測,擴散分析,免疫組織化學和組織學分析,RNA原位雜交分析,流式細胞術分析,細胞共培養(yǎng),流式分選,逆轉錄定量聚合酶鏈反應分析,RNA測序和單細胞RNA測序分析,基因集變異分析,單核RNA測序,降維和聚類,差異基因表達(DEG)分析,基因集富集分析

參考文獻

         Mucciolo Gianluca, Araos Henríquez Joaquín, Jihad Muntadher, et al. EGFR-activated myofibroblasts promote metastasis of pancreatic cancer.[J] .Cancer Cell, 2023, undefined: undefined.