L-精氨酸代謝可抑制關(guān)節(jié)炎和炎性骨丟失

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性炎癥性疾病，其特征是關(guān)節(jié)疼痛、腫脹以及軟骨和骨破壞。RA影響全球1%的人口，并構(gòu)成殘疾的一個(gè)關(guān)鍵因素。炎癥是RA骨丟失的關(guān)鍵誘因，導(dǎo)致骨侵蝕增強(qiáng)、過早骨質(zhì)疏松和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，慢性炎癥會(huì)擾亂骨穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致骨吸收超過骨形成。TNFα是一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，也是眾所周知的引發(fā)破骨細(xì)胞過度分化的因素。在破骨細(xì)胞中，TNFα刺激的下游信號(hào)通路如NF-κB和MAPK-AP1被激活。破骨細(xì)胞的分化需要大量的能量。氧化磷酸化有助于破骨細(xì)胞的分化，而糖酵解影響破骨細(xì)胞的吸收活性。此外，線粒體途徑也參與了破骨細(xì)胞的功能，因?yàn)榫€粒體生物發(fā)生和呼吸的主要調(diào)節(jié)因子PGC-1α的缺乏會(huì)降低破骨細(xì)胞的吸收活性。炎癥可能通過改變破骨細(xì)胞的代謝而改變其功能狀態(tài)。然而，到目前為止，還沒有研究探討炎癥條件下破骨細(xì)胞的代謝特性。該研究發(fā)表在《Annals of the Rheumatic Diseases》，IF：27.4。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. L-精氨酸可抑制關(guān)節(jié)炎和炎性骨丟失

為了研究L-精氨酸是否可以預(yù)防炎癥和全身性炎性骨丟失，作者使用了血清誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（SIA）模型，并在血清注射后第0日或第4日口服補(bǔ)充了L-精氨酸（圖1A）。L-精氨酸顯著減少了臨床關(guān)節(jié)炎（圖1B）。作者還分析了SIA小鼠的脛骨，發(fā)現(xiàn)在L-精氨酸和溶劑治療之間，骨量沒有顯著差異（圖1C、D）。盡管如此，L-精氨酸減少了脛骨破骨細(xì)胞的數(shù)量和大?。▓D1E、F）。

作者假設(shè)長期的l -精氨酸治療可能有更好的結(jié)局。因此，作者從首次免疫后第23日開始，用L-精氨酸對患膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）的DBA/1J小鼠進(jìn)行治療（圖1G）。與SIA模型相似，L-精氨酸顯著改善了關(guān)節(jié)炎癥，如關(guān)節(jié)炎評分降低所示（圖1H）。脛骨和椎骨的μCT分析表明，L-精氨酸治療改善了骨丟失，顯著增加了骨體積和骨小梁數(shù)量（圖1I，J）。使用TRAP染色對破骨細(xì)胞進(jìn)行的組織形態(tài)計(jì)量分析顯示，L-精氨酸治療的CIA小鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量顯著受到抑制（圖1K，L）。有趣的是，骨髓上清液中的TNFα表達(dá)和RANKL/OPG比率沒有改變，這表明盡管分別存在促炎和促破骨細(xì)胞因子如TNFα和RANKL，L-精氨酸可能改善骨丟失。

最后，L-精氨酸對關(guān)節(jié)炎的有益作用也在hTNFtg小鼠中得到證實(shí)，hTNFtg小鼠是自發(fā)性炎癥性關(guān)節(jié)炎的模型。出生后6周，在飲用水中補(bǔ)充L-精氨酸（圖1M）。與其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵粯?，?span>L-精氨酸治療的小鼠中，關(guān)節(jié)腫脹減輕，同時(shí)握力改善（圖1N，O）。L-精氨酸通過減少破骨細(xì)胞數(shù)量抑制關(guān)節(jié)炎和炎性骨丟失。

圖1 L-精氨酸保護(hù)三種小鼠關(guān)節(jié)炎模型的骨丟失

2. L-精氨酸可抑制TNFα誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成

接下來，作者用WT骨髓細(xì)胞進(jìn)行破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，這些細(xì)胞被TNFα刺激以模擬促炎微環(huán)境。在整個(gè)分化過程中或僅在后期階段補(bǔ)充L-精氨酸（圖2A）。所使用的L-精氨酸濃度無任何毒性作用（圖2B）。正如預(yù)期的那樣，TNFα刺激（40ng/mL）增強(qiáng)了破骨細(xì)胞數(shù)量，而10mM L-精氨酸顯著減少了破骨細(xì)胞分化（圖2C，D）。有趣的是，與在整個(gè)分化過程中補(bǔ)充L-精氨酸相比，在分化后期補(bǔ)充L-精氨酸能更有效地抑制破骨細(xì)胞的生成（圖2C，D）。TNFα刺激促進(jìn)破骨細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成，而L-精氨酸破壞了F-肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成（圖2E）。在TNFα刺激的細(xì)胞中，L-精氨酸也降低了骨吸收活性（圖2F，G）。破骨細(xì)胞相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)分析顯示了它們在分化過程中的變化。它們的表達(dá)在TNFα刺激后增加，但在L-精氨酸治療后顯著減少（圖2H）?？傊?，L-精氨酸在體外抑制破骨細(xì)胞分化，尤其是在炎癥條件下。

圖2 L-精氨酸降低TNFα誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和再吸收活性

3. L-精氨酸促進(jìn)氧化磷酸化和ATP生成

為了確定L-精氨酸的功能，作者對TNFα刺激或未刺激的L-精氨酸處理的破骨細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序。在未受刺激的細(xì)胞中，L-精氨酸處理的細(xì)胞中只有少數(shù)基因和相關(guān)通路被富集（圖2I）。而當(dāng)細(xì)胞被TNFα刺激時(shí)，KEGG通路分析顯示L-精氨酸后氧化磷酸化通路基因強(qiáng)富集（圖2J）。GSEA進(jìn)一步證明，與TNFα刺激的細(xì)胞相比，TNFα/L-精氨酸處理的細(xì)胞中氧化磷酸化顯著富集（圖2K）。熱圖分析還突出了與氧化磷酸化相關(guān)的基因，這些基因在TNFα/L-精氨酸處理的細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖2L）。

為了進(jìn)一步證實(shí)TNFα/L-精氨酸對細(xì)胞氧化磷酸化的促進(jìn)作用，作者進(jìn)行了細(xì)胞外通量測定。TNFα刺激促進(jìn)WT細(xì)胞的糖酵解，而L-精氨酸不影響糖酵解（圖3A）。與此同時(shí)，TNFα抑制氧化磷酸化并促進(jìn)ATP生成，這一過程被L-精氨酸（10mM）逆轉(zhuǎn)（圖3B，C）。在TNFα刺激后，糖酵解ATP生成增加，但被L-精氨酸轉(zhuǎn)化為氧化磷酸化（圖3D，E）。

為了研究單細(xì)胞水平的能量代謝，作者對四個(gè)處理組分離的前破骨細(xì)胞進(jìn)行了SCENITH實(shí)驗(yàn)。在TNFα刺激的細(xì)胞中，精氨酸增加了線粒體依賴性，降低了糖酵解能力（圖3F、G）。此外，L-精氨酸引起的氧化磷酸化增加與葡萄糖消耗增加無關(guān)（圖3H）。因此，作者探索了線粒體膜電位的可能變化。JC-1染色顯示TNFα刺激后線粒體膜電位受損，而L-精氨酸恢復(fù)了膜電位（圖3I，J）。最后，當(dāng)用魚藤酮和抗霉素阻斷氧化磷酸化時(shí)，L-精氨酸的作用僅在TNFα刺激的條件下以劑量依賴性的方式被消除（圖3K-N）。

圖3 L-精氨酸促進(jìn)炎癥條件下破骨細(xì)胞氧化磷酸化和ATP的產(chǎn)生

4. 精氨酸酶-1誘導(dǎo)介導(dǎo)L-精氨酸抑制破骨細(xì)胞

為了研究作者模型中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者根據(jù)作者的RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子富集分析。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)c-Jun在來自DEGs的所有三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中都富集（圖4A）。由于c-Jun是已知的控制破骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，并且c-Jun的表達(dá)與巨噬細(xì)胞中精氨酸酶-1（Arg-1）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，因此在作者的四種培養(yǎng)條件下，作者對c-Jun的蛋白水平進(jìn)行了研究。TNFα增強(qiáng)了C-Jun的表達(dá)，但L-精氨酸顯著降低了C-Jun的表達(dá)，尤其是在破骨細(xì)胞分化后期補(bǔ)充L-精氨酸時(shí)（圖4B）。接下來，作者分析了在TNFα刺激下c-Jun在破骨細(xì)胞生成中的作用。為此，作者分離了cJun ΔLysM小鼠和同窩對照組小鼠的骨髓細(xì)胞。即使在TNFα刺激后，c-Jun缺陷細(xì)胞中的破骨細(xì)胞數(shù)量也較低（圖4C，D）。有趣的是，在TNFα刺激后，c-Jun缺陷的破骨細(xì)胞中，Arg1的表達(dá)顯著升高，而Arg2無變化（圖4E）。因此，作者研究了精氨酸-1在L-精氨酸介導(dǎo)的破骨細(xì)胞抑制中的作用。在L-精氨酸處理的CIA小鼠的足爪組織裂解液中，精氨酸酶活性升高，而尿素水平不變，亞硝酸鹽水平降低（圖4F）。這些數(shù)據(jù)表明，c-Jun控制Arg1的表達(dá)，從而介導(dǎo)L-精氨酸對破骨細(xì)胞分化的抑制作用。

為了驗(yàn)證c-Jun是否在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Arg1的表達(dá)，特別是在TNFα刺激下，作者納入了Arg1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的5000 bp，并通過計(jì)算機(jī)模擬JASPAR數(shù)據(jù)庫，預(yù)測了Arg1啟動(dòng)子上的8個(gè)假定的c-Jun結(jié)合位點(diǎn)（圖4G）。然后用抗c-jun抗體對TNFα刺激的破骨前細(xì)胞進(jìn)行ChIP-qPCR。事實(shí)上，c-Jun可以在穩(wěn)定狀態(tài)下與啟動(dòng)子位點(diǎn)3、4、5和8結(jié)合，在TNFα刺激下與啟動(dòng)子位點(diǎn)1、2、4、6和8結(jié)合（圖4G）。有趣的是，染色質(zhì)重塑標(biāo)志物表明c-Jun結(jié)合位點(diǎn)的抑制模式，TNFα刺激后，Arg1啟動(dòng)子的H3me3K27甲基化增強(qiáng)，而H3me3K4甲基化未檢測到變化（圖4H）。這些結(jié)果表明，TNFα通過c-Jun下調(diào)Arg1的表達(dá)。

接下來，作者分析了來自兩個(gè)Arg-1條件性敲除小鼠的骨髓來源的破骨細(xì)胞。正如預(yù)期的那樣，L-精氨酸可以減少WT細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化，但在TNFα刺激后Arg-1缺陷細(xì)胞中沒有這種作用（圖4I-L）。

綜上所述，這些結(jié)果表明Arg-1在TNFα刺激后允許L-精氨酸抑制破骨細(xì)胞生成中起重要作用。

圖4 精氨酸酶-1的誘導(dǎo)介導(dǎo)L-精氨酸抑制破骨細(xì)胞

5. L-精氨酸在炎癥刺激下重新編程嘌呤代謝

為了研究L-精氨酸補(bǔ)充后的代謝通量，作者首先使用13 c同位素標(biāo)記進(jìn)行了L-精氨酸的代謝示蹤。如圖5A所示，在13 C 6 - L-精氨酸補(bǔ)充后，標(biāo)記為13 C同位素的下游代謝物為鳥氨酸、精胺、n -乙酰-精脒、n -乙酰-瓜氨酸/瓜氨酸、d -脯氨酸、吡咯啉和吡咯烷。有趣的是，從各代謝物的同位素分布圖中可以看出，TNFα刺激增加了13 C 6 -L-精氨酸的消耗，而13 C 6 >- L-精氨酸的補(bǔ)充增加了其細(xì)胞濃度。此外，添加C 6 - L-精氨酸促進(jìn)了13 C 4 -鳥氨酸、13 C 5 - d -脯氨酸、13 C 4 -精胺、13 C 4 - n -乙酰-精胺、13 C 4 -吡咯啉和13 C 4 -吡咯烷的產(chǎn)生。然而，在TNFα刺激下，13 C 6 - L-精氨酸減少了13 C 5 -鳥氨酸的產(chǎn)生，這表明鳥氨酸只在炎癥條件下消耗。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，L-精氨酸生物利用度的提高確實(shí)使代謝通量向精氨酸-1方向傾斜。

接下來，為了進(jìn)一步闡明L-精氨酸處理后的細(xì)胞內(nèi)代謝變化以及闡明下游代謝通路，作者對L-精氨酸和TNFα刺激或不刺激的破骨細(xì)胞進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析。正如預(yù)期的那樣，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的通路富集證實(shí)，在l -精氨酸處理的破骨細(xì)胞中，精氨酸和脯氨酸代謝增加（圖5B）。最有趣的是，與TNFα刺激的細(xì)胞相比，TNFα L-精氨酸處理的細(xì)胞中嘌呤代謝富集（圖5B）。次黃嘌呤和肌苷的生成增加，可能是由于ATP生成增加（圖5C，D）。在TNFα L-精氨酸處理的細(xì)胞中，腺苷和腺嘌呤的產(chǎn)生顯著減少。與代謝組學(xué)結(jié)果一致，RNA-seq數(shù)據(jù)還表明，在TNFα L-精氨酸處理的細(xì)胞中，嘌呤代謝相關(guān)通路在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫中顯著富集（圖5E）。編碼與嘌呤代謝相關(guān)的酶的基因也發(fā)生了相應(yīng)的變化（圖5F）。特別是腺苷脫氨酶（ADA）和Nt5c1a在TNFα刺激的細(xì)胞中被L-精氨酸單獨(dú)上調(diào)（圖5F）。綜上所述，這些結(jié)果揭示了L-精氨酸在炎癥刺激下重編程嘌呤代謝。

圖5 L-精氨酸干擾TNFα刺激細(xì)胞的嘌呤代謝

為了進(jìn)一步分析嘌呤代謝在破骨細(xì)胞生成過程中的作用，作者誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，并用肌苷或次黃嘌呤處理細(xì)胞。肌苷和次黃嘌呤均可抑制體外破骨細(xì)胞生成，尤其是在TNFα刺激后（圖6A，B）。通過使用ADA抑制劑（戊司他丁或紅-9-（2-羥基-3-壬基）腺嘌呤）阻止肌苷和次黃嘌呤的產(chǎn)生，作者可以逆轉(zhuǎn)炎癥環(huán)境下L-精氨酸對破骨細(xì)胞分化的抑制作用（圖6C-E）。

接下來，作者在補(bǔ)充L-精氨酸的CIA小鼠體內(nèi)分析了ADA抑制的效果（圖6F）。與之前一樣，L-精氨酸顯著改善了關(guān)節(jié)炎，而噴司他丁注射液完全恢復(fù)了關(guān)節(jié)炎（圖6G）。脛骨的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析表明，補(bǔ)充L-精氨酸減少了破骨細(xì)胞，并保護(hù)了炎性骨丟失。然而，ADA抑制可逆轉(zhuǎn)L-精氨酸的作用（圖6H，I）。綜上所述，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，L-精氨酸誘導(dǎo)的嘌呤代謝介導(dǎo)了對炎癥性破骨細(xì)胞生成的抑制。

圖6 L-精氨酸通過控制腺苷脫氨酶來減輕炎性骨丟失

6. RA患者精氨酸水平的改變和L-精氨酸對人破骨細(xì)胞生成的抑制作用

為了研究RA患者的精氨酸水平是否有變化，作者對23例RA患者和29名年齡和性別匹配的健康對照者的血清樣本進(jìn)行了超高效液相色譜-質(zhì)譜分析，以確定參與尿素循環(huán)的氨基酸水平。與健康對照者相比，RA患者血清中精氨酸水平顯著升高，而鳥氨酸水平降低，瓜氨酸和脯氨酸水平無變化（圖7A）。此外，在輕中度疾病活動(dòng)（DAS28評分<5.2個(gè)單位）的RA患者中，精氨酸水平與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)（圖7B）。作者還在另一個(gè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎前期患者隊(duì)列中檢測了這些氨基酸水平。有趣的是，在RA前期患者中，與健康對照相比，D-精氨酸水平升高，而鳥氨酸和D-脯氨酸水平顯著降低，瓜氨酸水平無變化（圖7C）。總之，精氨酸在RA和RA前期患者中表達(dá)顯著升高，提示在疾病的早期階段就存在精氨酸代謝失調(diào)。

最后，作者還在人類細(xì)胞中研究了L-精氨酸對破骨細(xì)胞的作用。用10mM L-精氨酸處理外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的破骨細(xì)胞，并用20pg/mL TNFα刺激（圖7D）。在MCSF和RANKL刺激的細(xì)胞和TNFα刺激的細(xì)胞中，L-精氨酸處理后均觀察到破骨細(xì)胞數(shù)量和破骨細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)顯著減少（圖7E-G）。因此，L-精氨酸也抑制人類破骨細(xì)胞的生成。

圖7 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者精氨酸代謝的改變和L-精氨酸抑制人破骨細(xì)胞生成

結(jié)論：

綜上所述，該研究表明L-精氨酸通過重編程破骨細(xì)胞的氨基酸代謝來抑制關(guān)節(jié)炎，炎癥性破骨細(xì)胞生成和炎癥誘導(dǎo)的骨丟失。因此，治療性補(bǔ)充L-精氨酸可能是一種抑制關(guān)節(jié)炎炎癥和保護(hù)炎性骨丟失的飲食策略。

實(shí)驗(yàn)方法：

小鼠實(shí)驗(yàn)，RNA測序和生物信息學(xué)分析，細(xì)胞外通量測定，單細(xì)胞能量代謝，質(zhì)譜分析

參考文獻(xiàn)：

Cao S, Li Y, Song R, Meng X, Fuchs M, Liang C, et al. L-arginine metabolism inhibits arthritis and inflammatory bone loss. Ann Rheum Dis. 2024 Jan 2;83(1):72-87. doi: 10.1136/ard-2022-223626.