L-精氨酸代謝可抑制關節(jié)炎和炎性骨丟失

類風濕關節(jié)炎（RA）是一種慢性炎癥性疾病，其特征是關節(jié)疼痛、腫脹以及軟骨和骨破壞。RA影響全球1%的人口，并構成殘疾的一個關鍵因素。炎癥是RA骨丟失的關鍵誘因，導致骨侵蝕增強、過早骨質疏松和骨折風險增加。因此，慢性炎癥會擾亂骨穩(wěn)態(tài)，導致骨吸收超過骨形成。TNFα是一種關鍵的促炎細胞因子，也是眾所周知的引發(fā)破骨細胞過度分化的因素。在破骨細胞中，TNFα刺激的下游信號通路如NF-κB和MAPK-AP1被激活。破骨細胞的分化需要大量的能量。氧化磷酸化有助于破骨細胞的分化，而糖酵解影響破骨細胞的吸收活性。此外，線粒體途徑也參與了破骨細胞的功能，因為線粒體生物發(fā)生和呼吸的主要調節(jié)因子PGC-1α的缺乏會降低破骨細胞的吸收活性。炎癥可能通過改變破骨細胞的代謝而改變其功能狀態(tài)。然而，到目前為止，還沒有研究探討炎癥條件下破骨細胞的代謝特性。該研究發(fā)表在《Annals of the Rheumatic Diseases》，IF：27.4。

技術路線：

主要研究結果：

1. L-精氨酸可抑制關節(jié)炎和炎性骨丟失

為了研究L-精氨酸是否可以預防炎癥和全身性炎性骨丟失，作者使用了血清誘導性關節(jié)炎（SIA）模型，并在血清注射后第0日或第4日口服補充了L-精氨酸（圖1A）。L-精氨酸顯著減少了臨床關節(jié)炎（圖1B）。作者還分析了SIA小鼠的脛骨，發(fā)現(xiàn)在L-精氨酸和溶劑治療之間，骨量沒有顯著差異（圖1C、D）。盡管如此，L-精氨酸減少了脛骨破骨細胞的數(shù)量和大?。▓D1E、F）。

作者假設長期的l -精氨酸治療可能有更好的結局。因此，作者從首次免疫后第23日開始，用L-精氨酸對患膠原誘導關節(jié)炎（CIA）的DBA/1J小鼠進行治療（圖1G）。與SIA模型相似，L-精氨酸顯著改善了關節(jié)炎癥，如關節(jié)炎評分降低所示（圖1H）。脛骨和椎骨的μCT分析表明，L-精氨酸治療改善了骨丟失，顯著增加了骨體積和骨小梁數(shù)量（圖1I，J）。使用TRAP染色對破骨細胞進行的組織形態(tài)計量分析顯示，L-精氨酸治療的CIA小鼠的破骨細胞數(shù)量顯著受到抑制（圖1K，L）。有趣的是，骨髓上清液中的TNFα表達和RANKL/OPG比率沒有改變，這表明盡管分別存在促炎和促破骨細胞因子如TNFα和RANKL，L-精氨酸可能改善骨丟失。

最后，L-精氨酸對關節(jié)炎的有益作用也在hTNFtg小鼠中得到證實，hTNFtg小鼠是自發(fā)性炎癥性關節(jié)炎的模型。出生后6周，在飲用水中補充L-精氨酸（圖1M）。與其他兩個實驗模型一樣，在L-精氨酸治療的小鼠中，關節(jié)腫脹減輕，同時握力改善（圖1N，O）。L-精氨酸通過減少破骨細胞數(shù)量抑制關節(jié)炎和炎性骨丟失。

圖1 L-精氨酸保護三種小鼠關節(jié)炎模型的骨丟失

2. L-精氨酸可抑制TNFα誘導的破骨細胞生成

接下來，作者用WT骨髓細胞進行破骨細胞分化實驗，這些細胞被TNFα刺激以模擬促炎微環(huán)境。在整個分化過程中或僅在后期階段補充L-精氨酸（圖2A）。所使用的L-精氨酸濃度無任何毒性作用（圖2B）。正如預期的那樣，TNFα刺激（40ng/mL）增強了破骨細胞數(shù)量，而10mM L-精氨酸顯著減少了破骨細胞分化（圖2C，D）。有趣的是，與在整個分化過程中補充L-精氨酸相比，在分化后期補充L-精氨酸能更有效地抑制破骨細胞的生成（圖2C，D）。TNFα刺激促進破骨細胞中F-肌動蛋白環(huán)的形成，而L-精氨酸破壞了F-肌動蛋白環(huán)的形成（圖2E）。在TNFα刺激的細胞中，L-精氨酸也降低了骨吸收活性（圖2F，G）。破骨細胞相關基因的動態(tài)分析顯示了它們在分化過程中的變化。它們的表達在TNFα刺激后增加，但在L-精氨酸治療后顯著減少（圖2H）?？傊?，L-精氨酸在體外抑制破骨細胞分化，尤其是在炎癥條件下。

圖2 L-精氨酸降低TNFα誘導的破骨細胞生成和再吸收活性

3. L-精氨酸促進氧化磷酸化和ATP生成

為了確定L-精氨酸的功能，作者對TNFα刺激或未刺激的L-精氨酸處理的破骨細胞進行了RNA測序。在未受刺激的細胞中，L-精氨酸處理的細胞中只有少數(shù)基因和相關通路被富集（圖2I）。而當細胞被TNFα刺激時，KEGG通路分析顯示L-精氨酸后氧化磷酸化通路基因強富集（圖2J）。GSEA進一步證明，與TNFα刺激的細胞相比，TNFα/L-精氨酸處理的細胞中氧化磷酸化顯著富集（圖2K）。熱圖分析還突出了與氧化磷酸化相關的基因，這些基因在TNFα/L-精氨酸處理的細胞中顯著上調（圖2L）。

為了進一步證實TNFα/L-精氨酸對細胞氧化磷酸化的促進作用，作者進行了細胞外通量測定。TNFα刺激促進WT細胞的糖酵解，而L-精氨酸不影響糖酵解（圖3A）。與此同時，TNFα抑制氧化磷酸化并促進ATP生成，這一過程被L-精氨酸（10mM）逆轉（圖3B，C）。在TNFα刺激后，糖酵解ATP生成增加，但被L-精氨酸轉化為氧化磷酸化（圖3D，E）。

為了研究單細胞水平的能量代謝，作者對四個處理組分離的前破骨細胞進行了SCENITH實驗。在TNFα刺激的細胞中，精氨酸增加了線粒體依賴性，降低了糖酵解能力（圖3F、G）。此外，L-精氨酸引起的氧化磷酸化增加與葡萄糖消耗增加無關（圖3H）。因此，作者探索了線粒體膜電位的可能變化。JC-1染色顯示TNFα刺激后線粒體膜電位受損，而L-精氨酸恢復了膜電位（圖3I，J）。最后，當用魚藤酮和抗霉素阻斷氧化磷酸化時，L-精氨酸的作用僅在TNFα刺激的條件下以劑量依賴性的方式被消除（圖3K-N）。

圖3 L-精氨酸促進炎癥條件下破骨細胞氧化磷酸化和ATP的產生

4. 精氨酸酶-1誘導介導L-精氨酸抑制破骨細胞

為了研究作者模型中的轉錄調控，作者根據作者的RNA測序數(shù)據進行了轉錄因子富集分析。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)c-Jun在來自DEGs的所有三個轉錄因子數(shù)據庫中都富集（圖4A）。由于c-Jun是已知的控制破骨細胞分化的轉錄因子，并且c-Jun的表達與巨噬細胞中精氨酸酶-1（Arg-1）的表達呈負相關，因此在作者的四種培養(yǎng)條件下，作者對c-Jun的蛋白水平進行了研究。TNFα增強了C-Jun的表達，但L-精氨酸顯著降低了C-Jun的表達，尤其是在破骨細胞分化后期補充L-精氨酸時（圖4B）。接下來，作者分析了在TNFα刺激下c-Jun在破骨細胞生成中的作用。為此，作者分離了cJun ΔLysM小鼠和同窩對照組小鼠的骨髓細胞。即使在TNFα刺激后，c-Jun缺陷細胞中的破骨細胞數(shù)量也較低（圖4C，D）。有趣的是，在TNFα刺激后，c-Jun缺陷的破骨細胞中，Arg1的表達顯著升高，而Arg2無變化（圖4E）。因此，作者研究了精氨酸-1在L-精氨酸介導的破骨細胞抑制中的作用。在L-精氨酸處理的CIA小鼠的足爪組織裂解液中，精氨酸酶活性升高，而尿素水平不變，亞硝酸鹽水平降低（圖4F）。這些數(shù)據表明，c-Jun控制Arg1的表達，從而介導L-精氨酸對破骨細胞分化的抑制作用。

為了驗證c-Jun是否在轉錄水平調控Arg1的表達，特別是在TNFα刺激下，作者納入了Arg1轉錄起始位點上游的5000 bp，并通過計算機模擬JASPAR數(shù)據庫，預測了Arg1啟動子上的8個假定的c-Jun結合位點（圖4G）。然后用抗c-jun抗體對TNFα刺激的破骨前細胞進行ChIP-qPCR。事實上，c-Jun可以在穩(wěn)定狀態(tài)下與啟動子位點3、4、5和8結合，在TNFα刺激下與啟動子位點1、2、4、6和8結合（圖4G）。有趣的是，染色質重塑標志物表明c-Jun結合位點的抑制模式，TNFα刺激后，Arg1啟動子的H3me3K27甲基化增強，而H3me3K4甲基化未檢測到變化（圖4H）。這些結果表明，TNFα通過c-Jun下調Arg1的表達。

接下來，作者分析了來自兩個Arg-1條件性敲除小鼠的骨髓來源的破骨細胞。正如預期的那樣，L-精氨酸可以減少WT細胞的破骨細胞分化，但在TNFα刺激后Arg-1缺陷細胞中沒有這種作用（圖4I-L）。

綜上所述，這些結果表明Arg-1在TNFα刺激后允許L-精氨酸抑制破骨細胞生成中起重要作用。

圖4 精氨酸酶-1的誘導介導L-精氨酸抑制破骨細胞

5. L-精氨酸在炎癥刺激下重新編程嘌呤代謝

為了研究L-精氨酸補充后的代謝通量，作者首先使用13 c同位素標記進行了L-精氨酸的代謝示蹤。如圖5A所示，在13 C 6 - L-精氨酸補充后，標記為13 C同位素的下游代謝物為鳥氨酸、精胺、n -乙酰-精脒、n -乙酰-瓜氨酸/瓜氨酸、d -脯氨酸、吡咯啉和吡咯烷。有趣的是，從各代謝物的同位素分布圖中可以看出，TNFα刺激增加了13 C 6 -L-精氨酸的消耗，而13 C 6 >- L-精氨酸的補充增加了其細胞濃度。此外，添加C 6 - L-精氨酸促進了13 C 4 -鳥氨酸、13 C 5 - d -脯氨酸、13 C 4 -精胺、13 C 4 - n -乙酰-精胺、13 C 4 -吡咯啉和13 C 4 -吡咯烷的產生。然而，在TNFα刺激下，13 C 6 - L-精氨酸減少了13 C 5 -鳥氨酸的產生，這表明鳥氨酸只在炎癥條件下消耗。綜上所述，這些數(shù)據表明，L-精氨酸生物利用度的提高確實使代謝通量向精氨酸-1方向傾斜。

接下來，為了進一步闡明L-精氨酸處理后的細胞內代謝變化以及闡明下游代謝通路，作者對L-精氨酸和TNFα刺激或不刺激的破骨細胞進行了非靶向代謝組學分析。正如預期的那樣，代謝組學數(shù)據的通路富集證實，在l -精氨酸處理的破骨細胞中，精氨酸和脯氨酸代謝增加（圖5B）。最有趣的是，與TNFα刺激的細胞相比，TNFα L-精氨酸處理的細胞中嘌呤代謝富集（圖5B）。次黃嘌呤和肌苷的生成增加，可能是由于ATP生成增加（圖5C，D）。在TNFα L-精氨酸處理的細胞中，腺苷和腺嘌呤的產生顯著減少。與代謝組學結果一致，RNA-seq數(shù)據還表明，在TNFα L-精氨酸處理的細胞中，嘌呤代謝相關通路在Gene Ontology數(shù)據庫中顯著富集（圖5E）。編碼與嘌呤代謝相關的酶的基因也發(fā)生了相應的變化（圖5F）。特別是腺苷脫氨酶（ADA）和Nt5c1a在TNFα刺激的細胞中被L-精氨酸單獨上調（圖5F）。綜上所述，這些結果揭示了L-精氨酸在炎癥刺激下重編程嘌呤代謝。

圖5 L-精氨酸干擾TNFα刺激細胞的嘌呤代謝

為了進一步分析嘌呤代謝在破骨細胞生成過程中的作用，作者誘導破骨細胞分化，并用肌苷或次黃嘌呤處理細胞。肌苷和次黃嘌呤均可抑制體外破骨細胞生成，尤其是在TNFα刺激后（圖6A，B）。通過使用ADA抑制劑（戊司他丁或紅-9-（2-羥基-3-壬基）腺嘌呤）阻止肌苷和次黃嘌呤的產生，作者可以逆轉炎癥環(huán)境下L-精氨酸對破骨細胞分化的抑制作用（圖6C-E）。

接下來，作者在補充L-精氨酸的CIA小鼠體內分析了ADA抑制的效果（圖6F）。與之前一樣，L-精氨酸顯著改善了關節(jié)炎，而噴司他丁注射液完全恢復了關節(jié)炎（圖6G）。脛骨的組織形態(tài)計量學分析表明，補充L-精氨酸減少了破骨細胞，并保護了炎性骨丟失。然而，ADA抑制可逆轉L-精氨酸的作用（圖6H，I）。綜上所述，在體外和體內實驗中，L-精氨酸誘導的嘌呤代謝介導了對炎癥性破骨細胞生成的抑制。

圖6 L-精氨酸通過控制腺苷脫氨酶來減輕炎性骨丟失

6. RA患者精氨酸水平的改變和L-精氨酸對人破骨細胞生成的抑制作用

為了研究RA患者的精氨酸水平是否有變化，作者對23例RA患者和29名年齡和性別匹配的健康對照者的血清樣本進行了超高效液相色譜-質譜分析，以確定參與尿素循環(huán)的氨基酸水平。與健康對照者相比，RA患者血清中精氨酸水平顯著升高，而鳥氨酸水平降低，瓜氨酸和脯氨酸水平無變化（圖7A）。此外，在輕中度疾病活動（DAS28評分<5.2個單位）的RA患者中，精氨酸水平與疾病嚴重程度顯著相關（圖7B）。作者還在另一個類風濕關節(jié)炎前期患者隊列中檢測了這些氨基酸水平。有趣的是，在RA前期患者中，與健康對照相比，D-精氨酸水平升高，而鳥氨酸和D-脯氨酸水平顯著降低，瓜氨酸水平無變化（圖7C）?？傊彼嵩?span>RA和RA前期患者中表達顯著升高，提示在疾病的早期階段就存在精氨酸代謝失調。

最后，作者還在人類細胞中研究了L-精氨酸對破骨細胞的作用。用10mM L-精氨酸處理外周血單個核細胞來源的破骨細胞，并用20pg/mL TNFα刺激（圖7D）。在MCSF和RANKL刺激的細胞和TNFα刺激的細胞中，L-精氨酸處理后均觀察到破骨細胞數(shù)量和破骨細胞標志物表達顯著減少（圖7E-G）。因此，L-精氨酸也抑制人類破骨細胞的生成。

圖7 類風濕關節(jié)炎患者精氨酸代謝的改變和L-精氨酸抑制人破骨細胞生成

結論：

綜上所述，該研究表明L-精氨酸通過重編程破骨細胞的氨基酸代謝來抑制關節(jié)炎，炎癥性破骨細胞生成和炎癥誘導的骨丟失。因此，治療性補充L-精氨酸可能是一種抑制關節(jié)炎炎癥和保護炎性骨丟失的飲食策略。

實驗方法：

小鼠實驗，RNA測序和生物信息學分析，細胞外通量測定，單細胞能量代謝，質譜分析

參考文獻：

Cao S, Li Y, Song R, Meng X, Fuchs M, Liang C, et al. L-arginine metabolism inhibits arthritis and inflammatory bone loss. Ann Rheum Dis. 2024 Jan 2;83(1):72-87. doi: 10.1136/ard-2022-223626.