腸道微生物代謝物通過(guò)抑制鐵死亡促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展

腸道菌群在人類健康中起著至關(guān)重要的作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腸道微生物通過(guò)產(chǎn)生致癌代謝物參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)了一種來(lái)源于厭氧菌消化鏈球菌的色氨酸代謝物，反式-3-吲哚丙烯酸（IDA），促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。在機(jī)制上，IDA作為芳香烴受體（AHR）的內(nèi)源性配體，轉(zhuǎn)錄上調(diào)ALDH1A3（乙醛脫氫酶1家族成員A3）的表達(dá)，ALDH1A3利用視網(wǎng)膜作為底物產(chǎn)生NADH，NADH是鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）介導(dǎo)的還原輔酶Q10合成所必需的。該研究于2024年1月發(fā)表在《Nature Cell Biology》，IF：21.3。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. IDA是一種有效的鐵死亡抑制因子

建立包含350種內(nèi)源性人類宿主和腸道微生物代謝物的篩選文庫(kù)，用于786-O人腎腺癌細(xì)胞的鐵死亡測(cè)定（圖1a）。篩選數(shù)據(jù)確定IDA，IDA由腸道微生物群的色氨酸代謝產(chǎn)生，它顯著抑制RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡（圖1b）。為驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，利用兩個(gè)經(jīng)典的鐵死亡敏感癌細(xì)胞系（786-O和HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞）來(lái)測(cè)試IDA的效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IDA處理的細(xì)胞對(duì)鐵死亡具有穩(wěn)健的抗性（圖1c，d）。檢測(cè)IDA孵育的HT1080細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，發(fā)現(xiàn)IDA顯著降低脂質(zhì)過(guò)氧化（圖1e），表明IDA是一種有效的鐵死亡抑制因子。

補(bǔ)充10 μM的IDA有效地消除HT1080細(xì)胞的鐵死亡，而低劑量（10 - 100 μM）的其他色氨酸衍生物沒(méi)有顯示出強(qiáng)大的保護(hù)作用（圖1f）。此外，補(bǔ)充IDA（而非任何其他色氨酸代謝物）大大消除HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵死亡（圖1g）。由于IDA能更有效地抑制鐵死亡，因此將重點(diǎn)放在IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制上。在HT29細(xì)胞和MC38小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中，IDA處理顯著抑制高水平的鐵死亡和脂質(zhì)過(guò)氧化（圖1h-k）。預(yù)測(cè)所有色氨酸代謝物的親脂性，并通過(guò)2,2-二苯基-1-酸酐肼（DPPH）和熒光激活的抑制自氧化（FENIX）檢測(cè)它們捕獲自由基的活性，這些數(shù)據(jù)表明，IDA不能直接減少氧化脂質(zhì)（圖1l），提示IDA可能通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)鐵死亡。

圖1. IDA是一種有效的鐵死亡抑制因子

2. IDA促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展

將HT29和MC38細(xì)胞培養(yǎng)成三維（3D）腫瘤球體，以更好地模擬體內(nèi)環(huán)境。如圖2a，b所示，在HT29腫瘤球體中，RSL3或咪唑酮erastin （IKE）誘導(dǎo)的鐵死亡可以通過(guò)補(bǔ)充IDA或利前列腺素-1 （Lipro-1）得到很大程度上的抑制。同樣，在HT29類器官（圖2c,d）中也觀察到類似的結(jié)果。HT29異種移植發(fā)現(xiàn)IDA顯著消除脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并促進(jìn)腫瘤發(fā)展（圖2e-g）。與這一發(fā)現(xiàn)一致，IDA在C57BL/6J小鼠中顯示出對(duì)鐵死亡的強(qiáng)保護(hù)作用，并促進(jìn)MC38異種移植的進(jìn)展（圖2h-j）。

圖2.IDA促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤發(fā)展

3.AHR是IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制所必需的

使用AHR拮抗劑BAY218和StemRegenin 1 （SR1），發(fā)現(xiàn)AHR拮抗劑顯著消除IDA調(diào)節(jié)的鐵死亡抑制（圖3a）。沉默HT29細(xì)胞中的基因表達(dá)（圖3b）。正如預(yù)期的那樣，在表達(dá)小發(fā)夾（sh）-AHR的細(xì)胞中，IDA未能抑制鐵死亡（圖3c）。此外，通過(guò)成簇的不規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR） -Cas9技術(shù)敲除AHR（圖3d）。事實(shí)上，由于AHR表達(dá)缺失，IDA未能挽救鐵死亡細(xì)胞（圖3e,f）。

在HT29和HT1080細(xì)胞中進(jìn)一步生成AHR - / -克隆，在AHRnullHT29細(xì)胞中，IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制通過(guò)AHR的異位表達(dá)得以恢復(fù)（圖3g-j）。為研究AHR是否促進(jìn)體內(nèi)IDA介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生，野生型（WT）和AHR KO HT29異種移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)在AHR - / -細(xì)胞中，IDA的保護(hù)作用基本上被消除（圖3k-n）。

圖3.AHR是IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制所必需的

4. FSP1是IDA抗鐵死亡作用所必需的

在HT29和HT1080細(xì)胞中構(gòu)建FSP1?/?克隆，以驗(yàn)證FSP1是否參與IDA調(diào)節(jié)的鐵死亡抵抗。如圖4a,b所示，在HT29細(xì)胞中，敲除FSP1后，IDA- AHR軸的保護(hù)作用大大減弱，而WT HT29細(xì)胞對(duì)IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制反應(yīng)明顯。與HT29 FSP1單向?qū)В?span>sg）RNA細(xì)胞相似，HT1080細(xì)胞中FSP1的缺失完全阻斷了IDA的抗鐵死亡作用（圖4c-f）。相反，FSP1的異位表達(dá)挽救了這一表型（圖4g,h）。在HT29 WT細(xì)胞中，補(bǔ)充IDA促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，而在FSP1 KO細(xì)胞中，IDA的作用基本上被消除（圖4i,j），這表明IDA - AHR軸介導(dǎo)的鐵死亡抑制依賴于FSP1。

圖4. FSP1是IDA抗鐵死亡作用所必需的

5. IDA通過(guò)AHR-ALDH1A3-FSP1-CoQ10軸抑制鐵死亡

對(duì)IDA處理的HT29細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-seq）。在可能由IDA介導(dǎo)的排名最高的基因中，ALDH1A3是上調(diào)最多的（圖5a）。對(duì)IDA和IPA處理的細(xì)胞進(jìn)行比較RNA-seq，以尋找特異性參與IDA應(yīng)答的候選基因。逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR （RT-qPCR）和蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)，ALDH1A3的信使RNA和蛋白水平在IDA處理后顯著升高（圖5b,c），這意味著ALDH1A3可能是AHR的直接下游靶點(diǎn)。通過(guò)與共有AHR結(jié)合基序（GCGTG）比較，發(fā)現(xiàn)三個(gè)潛在的結(jié)合區(qū)域（R1-R3），其中R3包含相同的序列（圖5d）。在有或沒(méi)有IDA處理的HT29中進(jìn)行ChIP檢測(cè)。有趣的是，在IDA作用下，內(nèi)源性AHR與ALDH1A3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游約100 bp處的R3具有很強(qiáng)的親和力，而與R1或R2沒(méi)有親和力（圖5e），這表明AHR在被IDA激活的情況下可以募集到ALDH1A3啟動(dòng)子上。

為測(cè)試ALDH1A3在鐵死亡中的作用，在HT29細(xì)胞中阻斷ALDH1A3的表達(dá)并檢測(cè)了鐵死亡細(xì)胞的水平。如圖5f,g所示，ALDH1A3缺失使細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化誘導(dǎo)的鐵死亡明顯敏感。此外，ALDH1A3表達(dá)的降低削弱了IDA抑制鐵死亡的能力（圖5h）。視網(wǎng)膜或維生素a調(diào)節(jié)的鐵死亡保護(hù)依賴于ALDH1A3（圖5i），這表明視網(wǎng)膜通過(guò)ALDH1A3的酶活性使細(xì)胞抵抗鐵死亡。使用ALDH1酶抑制劑雙硫侖來(lái)測(cè)試ALDH1A3的作用。正如預(yù)期，雙硫侖誘導(dǎo)了高水平的鐵死亡，并減弱了IDA和ALDH1A3介導(dǎo)的鐵死亡抑制作用（圖5j）。 

為研究ALDH1A3在腫瘤發(fā)展中的作用，測(cè)試ALDH1A3的缺失或藥物抑制是否影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。正如預(yù)期的那樣，ALDH1A3的缺失顯著抑制腫瘤的進(jìn)展，并阻斷IDA促進(jìn)的腫瘤生長(zhǎng)（圖5k,l）。體外實(shí)驗(yàn)表明純化的ALDH1A3可以通過(guò)視網(wǎng)膜產(chǎn)生NADH（圖5m,n）。此外，ALDH1A3的缺失顯著降低了NADH水平，而在ALDH1A3 KO細(xì)胞中補(bǔ)充NADH恢復(fù)了鐵死亡（圖5o,p）。此外，在ALDH1A3?/?和FSP1?/?細(xì)胞中檢測(cè)到較低的還原和氧化CoQ10比例（圖5q）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，ALDH1A3對(duì)IDA–AHR–FSP1–CoQ10-介導(dǎo)的鐵死亡抑制至關(guān)重要。

圖5. IDA通過(guò)AHR-ALDH1A3-FSP1-CoQ10軸抑制鐵死亡

6. 厭氧菌是IDA生物合成的主要因素

為研究IDA在結(jié)直腸癌發(fā)展中的來(lái)源，從健康人和結(jié)直腸癌患者的糞便中分離微生物種類，并分別使用16S核糖體RNA基因測(cè)序和質(zhì)譜（MS）進(jìn)行代謝組學(xué)分析，對(duì)微生物組成進(jìn)行大規(guī)模表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)厭氧菌（一種與CRC6相關(guān)的已知細(xì)菌）在CRC患者中顯著富集（圖6a）。通過(guò)MS對(duì)代謝物的分析表明，厭氧菌產(chǎn)生了可檢測(cè)到的IDA含量（圖6b）。此外，與健康人相比CRC患者糞便中的IDA含量要高得多 （圖6c），厭氧菌的豐度與糞便IDA水平呈正相關(guān)（圖6d）。在厭氧條件下培養(yǎng)厭氧菌，并使用液相色譜（LC） -MS技術(shù)檢測(cè)上清液中多種色氨酸衍生物的水平。事實(shí)上，厭氧菌有效地利用色氨酸產(chǎn)生高水平的IDA和IPA（圖6e,f）。IDA濃度在12 h達(dá)到約15 μM（圖6e）。此外，厭氧菌上清液處理HT29細(xì)胞后，ALDH1A3和CYP1A2的水平顯著升高，而大腸桿菌上清液對(duì)其無(wú)影響（圖6g,h）。此外，在添加厭氧菌上清液的細(xì)胞中，鐵死亡被顯著抑制（圖6i）。正如所料，損失AHR消除這一作用，而AHR過(guò)表達(dá)恢復(fù)這一保護(hù)作用（圖6j）。體內(nèi)瘤內(nèi)注射厭氧菌并檢測(cè)腫瘤中IDA的含量。IDA在腫瘤中的濃度（約5 μM）有效降低CRC鐵死亡并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)（圖7a-d）。此外，IDA的生理濃度足以消除體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡（圖7a-d）。綜上所述，表明生理濃度的IDA在體外和體內(nèi)都能有效地抑制鐵死亡

圖6. 厭氧菌是IDA生物合成的主要因素

 圖7. 厭氧菌或IDA促進(jìn)原位CRC進(jìn)展

7. 厭氧菌或IDA促進(jìn)原位CRC進(jìn)展

采用Apc突變（ApcMin/+）驅(qū)動(dòng)的CRC模型，一種自發(fā)性CRC的遺傳小鼠模型。如圖7e所示，厭氧菌在結(jié)腸組織中有效定植（圖7f）。此外，P. anaerobius處理的ApcMin/+小鼠產(chǎn)生了更高的腫瘤增殖（圖7g-j），表明P. anaerobius加速ApcMin/+小鼠的結(jié)直腸發(fā)育。無(wú)菌小鼠被灌胃厭氧菌，72 h后處死小鼠，檢測(cè)血清色氨酸代謝物豐度（圖7k）。與體外研究結(jié)果一致，補(bǔ)充厭氧菌后IDA和IPA顯著增加（圖7l,m），表明厭氧菌負(fù)責(zé)體內(nèi)IDA的生物合成。接下來(lái)，評(píng)估補(bǔ)充IDA是否驅(qū)動(dòng)ApcMin/+小鼠的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生（圖7n）。正如預(yù)期的那樣，IDA處理的ApcMin/+小鼠顯示出顯著較高的腫瘤多樣性（圖7o）。此外，建立結(jié)腸炎相關(guān)癌癥的氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（AOM/DSS）模型，發(fā)現(xiàn)IDA和厭氧菌顯著促進(jìn)了結(jié)腸炎誘導(dǎo)的CRC的進(jìn)展（圖7p,q）。

接下來(lái)，分析AHR在臨床樣本中的功能結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AHR和ALDH1A3的表達(dá)在結(jié)直腸癌中上調(diào)（圖8a-c）。此外，AHR的高表達(dá)與CRC患者的不良臨床結(jié)局呈正相關(guān)（圖8d）。免疫組織化學(xué)（IHC）和蛋白質(zhì)印跡分析一致表明，AHR和ALDH1A3在人類CRC樣本中表達(dá)更高（圖8e-h）。此外，用4-羥基-2-壬烯醛（4-HNE）、3,4-亞甲基二氧苯丙胺（MDA）和8-羥基-2 ' -脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHDG）進(jìn)行的IHC染色顯示，在結(jié)直腸癌中觀察到較低的脂質(zhì)過(guò)氧化水平（圖8i-k）?？傊?，研究表明，IDA-AHR-ALDH1A3 - FSP1通路通過(guò)抑制鐵死亡促進(jìn)CRC的發(fā)展。

圖8. AHR-ALDH1A3通路與結(jié)直腸癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)

結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)一種色氨酸衍生物IDA，通過(guò)抑制鐵死亡在體外和體內(nèi)促進(jìn)腫瘤發(fā)展。具體而言，IDA介導(dǎo)的癌細(xì)胞鐵死亡抵抗依賴于AHR-ALDH1A3-FSP1軸。IDA補(bǔ)充或種植厭氧菌促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，提示IDA–AHR–ALDH1A3–FSP1通路的破壞可能有利于CRC的治療。

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)菌的分離、培養(yǎng)和鑒定，WB，細(xì)胞活力、細(xì)胞死亡及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定，DPPH實(shí)驗(yàn)，FENIX實(shí)驗(yàn)，通過(guò)離心生成三維球體，根據(jù)類器官建立方案生成球體，質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染，RT-PCR，ChIP，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核分離，NADH水平測(cè)定，CoQ和CoQH2分析，糞便微生物群16S rRNA基因測(cè)序，體外色氨酸代謝產(chǎn)物的LC-MS代謝組學(xué)分析，體內(nèi)色氨酸代謝物的LC-MS分析，磷脂的LC-MS分析，體內(nèi)IDA含量的藥代動(dòng)力學(xué)，ALDH1A3酶活性測(cè)定，基于FlAsH傳感器的BRET檢測(cè)，異種移植實(shí)驗(yàn)，ApcMin/+腫瘤模型，結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的AOM/DSS模型，無(wú)菌小鼠厭氧假單胞菌植入及C57BL/6J小鼠瘤內(nèi)注射，免疫組化

參考文獻(xiàn)

Cui W, Guo M, Liu D, Xiao P, Yang C, Huang H, Liang C, Yang Y, Fu X, Zhang Y, Liu J, Shi S, Cong J, Han Z, Xu Y, Du L, Yin C, Zhang Y, Sun J, Gu W, Chai R, Zhu S, Chu B. Gut microbial metabolite facilitates colorectal cancer development via ferroptosis inhibition. Nat Cell Biol. 2024 Jan;26(1):124-137. doi: 10.1038/s41556-023-01314-6. Epub 2024 Jan 2. PMID: 38168770.