M1巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞外囊泡轉(zhuǎn)移線粒體誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞鐵死亡

細(xì)胞外囊泡（EVs）不僅對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生重大影響，而且對(duì)其治療干預(yù)作用也有重大影響，這取決于在其起源細(xì)胞中觀察到的差異。線粒體可以通過EVs在細(xì)胞之間運(yùn)輸，以促進(jìn)病理變化。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)來源于M1巨噬細(xì)胞（M1 EVs）的EVs包裹炎性線粒體，可以穿透胰腺β細(xì)胞。炎性線粒體與胰腺β細(xì)胞的線粒體融合，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和線粒體破壞。此外，線粒體DNA（mtDNA）片段被釋放到胞質(zhì)溶膠中，激活STING通路并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。脂肪來源干細(xì)胞（ADSC）釋放的EVs在抑制M1巨噬細(xì)胞反應(yīng)方面的潛力顯示出希望。隨后，利用ADSC-EVs并用F4/80抗體修飾以特異性靶向巨噬細(xì)胞，旨在體內(nèi)治療胰腺β細(xì)胞的鐵死亡?？傊?，該數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，M1表型巨噬細(xì)胞分泌的EVs在β細(xì)胞鐵死亡中起主要作用，并且修飾的ADSC-EVs表現(xiàn)出相當(dāng)大的潛力，可以作為靶向遞送到巨噬細(xì)胞的載體。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1 M1巨噬細(xì)胞通過EV將線粒體轉(zhuǎn)移到胰腺β細(xì)胞

為闡明來源于M1巨噬細(xì)胞的EVs（M1 EVs）對(duì)β細(xì)胞凋亡作用的分子機(jī)制，首先從正常小鼠胰腺組織中分離胰腺駐留巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)，并命名為M0巨噬細(xì)胞。然后將M0巨噬細(xì)胞極化為M1和M2表型。隨后，通過超速離心分離EV。使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了這些EV的蛋白質(zhì)圖譜，并對(duì)其功能和亞細(xì)胞定位注釋進(jìn)行了分類。主要類別包括細(xì)胞質(zhì)、外泌體、溶酶體、細(xì)胞核、線粒體和質(zhì)膜（圖1a）。這些數(shù)據(jù)表明，線粒體成分在被M1巨噬細(xì)胞分泌之前被封閉在EVs內(nèi)。為進(jìn)一步驗(yàn)證線粒體通過EVs轉(zhuǎn)移，通過蛋白質(zhì)印跡和免疫電子顯微鏡在EVs中評(píng)估了ATP5A（一種特異性線粒體標(biāo)記物）的存在。圖1b、圖c所示結(jié)果表明，ATP5A在M1 EV中陽性表達(dá)。此外，位于線粒體基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)VDAC、COX IV和PDHA也在M1 EV中表現(xiàn)出陽性表達(dá)，這通過蛋白質(zhì)印跡分析得到了證實(shí)（圖1d）。這些蛋白質(zhì)分別構(gòu)成線粒體外膜和線粒體內(nèi)膜，并參與電子傳輸鏈的最后階段。本研究調(diào)查了M1巨噬細(xì)胞分泌的EVs中線粒體成分的存在。然而，是否所有線粒體都被包裹在這些EV內(nèi)還有待確認(rèn)。為解決這一問題，對(duì)從M1 EV中提取的DNA進(jìn)行了全基因組PCR分析。結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增了66個(gè)對(duì)應(yīng)于整個(gè)線粒體DNA（mtDNA）基因組的擴(kuò)增子。隨后的擴(kuò)增子測序證實(shí)了EVs內(nèi)完整線粒體的包封，隨后將其運(yùn)輸出細(xì)胞（圖1e）。

為直觀檢測線粒體通過EVs轉(zhuǎn)運(yùn)從M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胰腺β細(xì)胞，使用GFP標(biāo)記M1巨噬細(xì)胞中的線粒體，而使用Mito TrackerDeep Red標(biāo)記β細(xì)胞（β TC-6細(xì)胞）中的線粒體。隨后，使用Transwell單元培養(yǎng)細(xì)胞，48小時(shí)后觀察到GFP熒光。然而，用GW4869預(yù)處理的M1巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著降低（圖2a）。GW4869是一種公認(rèn)的巨噬細(xì)胞外泌體釋放抑制劑，如作者的研究所示，在減少M1巨噬細(xì)胞中EVs的釋放方面表現(xiàn)出顯著的功效。

圖1：源自巨噬細(xì)胞的EVs含有包裝線粒體

2 源自M1巨噬細(xì)胞的炎性線粒體誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的熒光探針。在正常線粒體中，JC-1在線粒體基質(zhì)中聚集形成聚合物，并發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。當(dāng)線粒體膜電位低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，從而產(chǎn)生綠色熒光。在與M1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，使用JC-1細(xì)胞評(píng)估TC-6細(xì)胞的線粒體膜電位。結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，表現(xiàn)出JC-1綠色熒光的陽性染色細(xì)胞比例顯著增加。然而，在經(jīng)GW4869預(yù)處理的M1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的TC-6細(xì)胞中，這一比例顯著降低（圖2b）。在此期間，還使用膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒評(píng)估βTC-6的細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)與使用JC-1檢測方法獲得的結(jié)果一致。具體而言，與M1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的TC-6細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞的比例顯著高于正常細(xì)胞。相反，在與用GW4869預(yù)處理的M1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的TC-6細(xì)胞中觀察到膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞的顯著減少（圖2b）。作者的研究結(jié)果表明，給予GW4869可減少巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞囊泡分泌釋放線粒體。此外，作者觀察到用GW4869處理導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中GFP熒光的顯著增加。這些結(jié)果表明，線粒體轉(zhuǎn)移是通過EVs的釋放發(fā)生的。

圖2：研究線粒體在M1巨噬細(xì)胞和β TC-6細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移以及隨后對(duì)β TC-6細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的分析

活化的巨噬細(xì)胞進(jìn)行代謝重編程，從而誘導(dǎo)促炎表型。這種代謝轉(zhuǎn)變的特征是巨噬細(xì)胞線粒體從ATP產(chǎn)生轉(zhuǎn)變?yōu)榫€粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生。此外，線粒體產(chǎn)生的這種ROS也由巨噬細(xì)胞分泌，并被其他細(xì)胞（如心肌細(xì)胞）吸收，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在作者的研究中，M0巨噬細(xì)胞的線粒體被GFP標(biāo)記，其激活了炎癥M1和抗炎M2表型。隨后，從細(xì)胞上清液中選擇M1和M2巨噬細(xì)胞分泌的線粒體，并使用透射電子顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。為直觀地檢測胰腺β細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的線粒體融合，源自GFP標(biāo)記的M1巨噬細(xì)胞線粒體被引入到以Mito Tracker Deep Red不同濃度標(biāo)記的β TC-6細(xì)胞中。隨后，對(duì)熒光共定位進(jìn)行分析，作者的研究結(jié)果顯示，β TC-6細(xì)胞中存在綠色熒光，隨著線粒體濃度的升高，綠色熒光的強(qiáng)度逐漸增加，在25和30 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值。綠色熒光與紅色熒光共定位，在相同的像素中觀察到紅色和綠色信號(hào)之間的熒光定量（圖3a）。這些數(shù)據(jù)提供了β細(xì)胞的線粒體與來源于M1巨噬細(xì)胞的線粒體融合的證據(jù)。為研究M1巨噬細(xì)胞的炎性線粒體對(duì)胰腺β細(xì)胞凋亡的影響，作者從M1和M2巨噬細(xì)胞的細(xì)胞上清液中分離線粒體，并以不同劑量將其與β TC-6細(xì)胞共培養(yǎng)。研究結(jié)果表明，隨著M1巨噬細(xì)胞中線粒體濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加。這種增加在25和30 μg/mL的濃度下達(dá)到峰值。然而，通過檢測JC-1和膜聯(lián)蛋白V，M2巨噬細(xì)胞的線粒體沒有觀察到顯著變化（圖3b，c）。

為研究線粒體通過EV轉(zhuǎn)運(yùn)在胰腺β細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移，作者在不同濃度下孵育了來源于GFP標(biāo)記的M1巨噬細(xì)胞和用Mito TrackerDeep Red標(biāo)記的β TC-6細(xì)胞的EV。隨后分析了熒光的共定位，發(fā)現(xiàn)結(jié)果支持線粒體定向轉(zhuǎn)移的概念。具體而言，作者在TC-6細(xì)胞中觀察到綠色熒光，隨著EVs濃度的增加，綠色熒光的強(qiáng)度逐漸增加，在1×108和1×109粒子/mL處達(dá)到峰值。紅色熒光也與綠色熒光共定位，在相同的像素中觀察到紅色和綠色信號(hào)之間的熒光定量（圖4a）。對(duì)TC-6細(xì)胞的線粒體膜電位和凋亡進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果與定向線粒體轉(zhuǎn)移的概念一致。隨著M1巨噬細(xì)胞中EVs濃度的增加，觀察到凋亡細(xì)胞比例逐漸增加。這種增加在1×108和1×109顆粒/mL的濃度下達(dá)到最大值。相反，如JC-1和膜聯(lián)蛋白V分析所示，M2巨噬細(xì)胞的線粒體中沒有觀察到顯著的變化（圖4b，c）。因此，使用25 μg/mL M1線粒體（M1 Mito）和1×108個(gè)粒子/mL M1 EVs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3：巨噬細(xì)胞來源的線粒體與β TC-6 細(xì)胞孵育后的凋亡分析

圖4：線粒體通過EV的運(yùn)輸從巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 β TC-6 細(xì)胞

3炎性線粒體通過鐵死亡誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡

鐵死亡是一種鐵依賴性的調(diào)節(jié)性壞死，線粒體在這一過程中發(fā)揮著重要作用。在作者的研究中，他們初步評(píng)估了EVs或線粒體處理后β TC-6細(xì)胞中的ROS、游離Fe2+水平和線粒體脂質(zhì)過氧化。該評(píng)估通過用MitoSox Red、FerroOrange和MitoPePDPP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色來進(jìn)行。研究結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞相比，EVs或線粒體處理的β細(xì)胞中MitoSox Red、FerroOrange和MitoPePDPP的熒光強(qiáng)度顯著更高。此外，免疫熒光定位分析表明，大多數(shù)MitoSox Red、FerroOrange和MitoPeDPP定位在線粒體中。將Ferrostatin-1（Ferro-1，一種脫鐵抑制劑）添加到M1 Mito或M1 EVs處理的β TC-6細(xì)胞中，以驗(yàn)證鐵死亡的作用，并且添加Fer-1后，MitoSox Red、FerroOrange和MitoPePDPP的熒光強(qiáng)度顯著降低（圖5a-c）。線粒體形態(tài)變化是鐵死亡的可靠生物標(biāo)志物，鐵死亡是一種以線粒體通透性增加和隨后破裂為特征的細(xì)胞過程。在作者的研究中，他們使用透射電子顯微鏡檢查了β TC-6細(xì)胞的線粒體形態(tài)。正常細(xì)胞具有明顯的線粒體嵴和完整的線粒體膜。相反，用M1 EVs或M1 Mito處理的細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體腫脹、線粒體嵴溶解和破裂。此外，觀察到每個(gè)細(xì)胞的線粒體數(shù)量顯著減少（圖5d）。

圖5：不同處理方案對(duì)β TC 6細(xì)胞的mitoROS、Fe2+濃度、脂質(zhì)過氧化含量和線粒體形態(tài)的影響

GSH/GSSG是指生物系統(tǒng)中還原型谷胱甘肽（GSH）與氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比例，是細(xì)胞氧化還原平衡的重要指標(biāo)。與正常細(xì)胞相比，用M1 EVs或M1 Mito處理后，GSH/GSSG比率顯著降低。然而，如圖6a所示，通過添加Fer-1，緩解了當(dāng)前情況下的這種干擾。隨后，作者研究了Fer-1對(duì)β TC-6細(xì)胞胰島素分泌和凋亡的影響。這些結(jié)果證實(shí)了作者之前的發(fā)現(xiàn)，證明在用M1 EVs或M1 Mito處理的β細(xì)胞中，Fer-1不僅阻止了細(xì)胞凋亡，而且增強(qiáng)了胰島素分泌，如圖6b-d所示。線粒體耗氧率（OCR）反映了線粒體在指定時(shí)間段內(nèi)利用氧的速率。在作者的研究中，還評(píng)估了β細(xì)胞中的線粒體線粒體耗氧量（OCR），并觀察到M1 EVs或M1 Mito治療后線粒體ATP產(chǎn)生、基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸、備用呼吸能力和質(zhì)子泄漏的減少。然而，除了最大呼吸和質(zhì)子泄漏外，Fer-1的加入減輕了這些影響（圖6e）。

圖6：Fer-1能有效恢復(fù)經(jīng)各種處理后β TC 6細(xì)胞中下降的GSH/GSGG比值、細(xì)胞功能和OCR

4 胞質(zhì)mtDNA誘導(dǎo)β細(xì)胞STING通路的激活

STING通路是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在識(shí)別胞質(zhì)DNA和啟動(dòng)針對(duì)病原體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外，它與細(xì)胞死亡途徑有關(guān)，如凋亡、焦亡和壞死。鐵死亡導(dǎo)致線粒體通透性增加和斷裂，然后mtDNA進(jìn)入胞質(zhì)溶膠形成胞質(zhì)DNA。在本研究中，作者確定了STING通路是否被鐵死亡引起的mtDNA釋放激活。最初，作者證明了在用M1 EVs或M1 Mito處理后，TC-6細(xì)胞中線粒體釋放mtDNA。免疫熒光分析顯示，在M1 EVs或M1 Mito處理后，β TC-6細(xì)胞中的mtDNA與線粒體標(biāo)記物（TOM20）分離。隨后，使用ImageJ共定位插件工具對(duì)免疫熒光圖像進(jìn)行共定位分析。計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Rr）以評(píng)估相關(guān)性程度。結(jié)果表明，在M1-EVs或M1-Mito處理后，β TC-6細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)下降，但在添加Fer-1后增加（圖7a），這意味著Fer-1阻止了線粒體斷裂。環(huán)狀GMP-AMP合酶（cGAS）最初被鑒定為雙鏈DNA傳感器，在對(duì)抗病原體的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為研究cGAS與線粒體之間的相互作用，使用免疫熒光圖像進(jìn)行共定位分析，重點(diǎn)研究不同處理后TC-6細(xì)胞中TOM20與cGAS的共定位。所獲得的Pearson相關(guān)系數(shù)（Rr）低于5.0，表明線粒體和cGAS之間缺乏共定位（圖7b）。隨后的評(píng)估涉及檢查cGAS和胞質(zhì)mtDNA之間的相互作用，這揭示了在各種處理后其在TC-6細(xì)胞中的存在（圖7c）。為研究cGAS和胞質(zhì)mtDNA之間相互作用在不同處理下激活TC-6細(xì)胞STING通路的必要性，作者使用蛋白質(zhì)印跡來評(píng)估GPX4的表達(dá)以及STING和IRF3的磷酸化水平。研究結(jié)果顯示，在用M1 EVs或M1 Mito處理的β TC-6細(xì)胞中，GPX4下調(diào)，STING和IRF3磷酸化增加。添加Fer-1產(chǎn)生了對(duì)比結(jié)果（圖7d）?？傊?，M1巨噬細(xì)胞利用EVs將線粒體運(yùn)輸?shù)揭认?span>β細(xì)胞。這些線粒體與β細(xì)胞中已經(jīng)存在的線粒體的融合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Fe2+的積累，增加線粒體活性氧（ROS）和脂質(zhì)過氧化。因此，線粒體破裂發(fā)生，隨后線粒體DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，STING通路被激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡（圖7e）?？傊?，M1巨噬細(xì)胞釋放EVs促進(jìn)了胰腺β細(xì)胞的死亡。因此，解決M1巨噬細(xì)胞引起的胰腺β細(xì)胞的死亡需要一種集中的方法來阻止M1巨噬細(xì)胞的極化。通過有效抑制M1巨噬細(xì)胞的極化，可以減輕AP誘導(dǎo)的葡萄糖代謝異常。

圖7：各種處理后 β TC-6 細(xì)胞中的游離 mtDNA 激活 STING 通路

5 ADSC來源EVs的表面修飾

巨噬細(xì)胞表型從M1到M2的逆轉(zhuǎn)是通過MSC分泌EVs實(shí)現(xiàn)的。因此，來源于ADSCs的EVs已被用于抵消巨噬細(xì)胞的促炎表型，從而在體外和體內(nèi)防止胰腺β細(xì)胞的死亡。首先，鑒定了人ADSCs的生物學(xué)特性，包括特異性標(biāo)記表達(dá)和多分化潛能。作者的結(jié)果表明，人ADSCs對(duì)CD29、CD90和CD105呈陽性，并且ADSCs成功分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。先前的報(bào)道已經(jīng)表明，來源于MSCs的EVs攜帶某些miRNA和蛋白酶，這些miRNAs和蛋白酶可以逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞從M1到M2的顯性表型，并且用褪黑素預(yù)處理的MSCs分泌的EVs的逆轉(zhuǎn)作用顯著提高。在這項(xiàng)研究中，來自褪黑素預(yù)處理的ADSCs的EVs中，特異性miRNA（let-7b-5p和miR-24-3p）和蛋白酶（USP29）的水平顯著升高，這促進(jìn)了M2極化。這些EV在褪黑素處理前后的顆粒大小分布、球形和EV標(biāo)記蛋白方面相似，并顯著提高M1巨噬細(xì)胞中CD206陽性細(xì)胞的百分比。因此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用來源于褪黑素預(yù)處理的ADSCs的EV。為提高EVs在體內(nèi)的遞送效率，制備了活化巨噬細(xì)胞靶向ADSC衍生的EVs，并使用點(diǎn)擊化學(xué)將抗F4/80抗體的大鼠單克隆抗體修飾在ADSC衍生EVs的表面上（稱為F4/80 EVs，圖8a）。分析了F4/80-EVs和正常EVs的生物學(xué)特性，數(shù)據(jù)顯示形態(tài)、顆粒大小分布或電動(dòng)汽車標(biāo)記蛋白沒有顯著變化，正常EVs中的F4/80除外（圖8b）。NF-kB是Rel家族成員的二聚體，由五種蛋白質(zhì)組成。NF-kB（p65）和NF-kB1（p50）亞基的異二聚體是第一個(gè)被描述的NF-kB分子，在未刺激的細(xì)胞中被IkBα蛋白抑制。M1極化后，通過免疫熒光染色在巨噬細(xì)胞中檢測p65和p50（圖S12）。p50幾乎進(jìn)入細(xì)胞核，一些p65留在細(xì)胞質(zhì)中。為檢測F4/80-EVs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，作者對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析。這些分析旨在評(píng)估NF-kB1（p50）在細(xì)胞核中的表達(dá)，以及在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行各種處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS和CD206的百分比變化。免疫熒光顯示，在EV（圖8c）和F4/80-EV（圖8d）處理后，NF-kB1（p50）以濃度依賴的方式被有效地限制在細(xì)胞質(zhì)中。使用FITC標(biāo)記的NF-kB1（p50）和Cy5標(biāo)記的IkBa來評(píng)估定位。最初在細(xì)胞核中觀察到FITC熒光信號(hào)；然而，在與EVs孵育后，FITC信號(hào)與細(xì)胞質(zhì)中的Cy5共定位。任意單細(xì)胞的熒光定量顯示，在相同濃度下，F4/80-EV組的FITC信號(hào)比EV組少。使用流式細(xì)胞術(shù)分析M1巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物iNOS和M2巨噬細(xì)胞的標(biāo)志器CD206的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在相同濃度下，F4/80-EV組中CD206陽性細(xì)胞的百分比顯著高于EV組（圖8e）。炎癥因子，白細(xì)胞介素（IL）?1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-6，在M1巨噬細(xì)胞和細(xì)胞懸浮液的轉(zhuǎn)錄和分泌過程中都被鑒定。這是使用實(shí)時(shí)PCR和ELISA實(shí)現(xiàn)的。使用從免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)的準(zhǔn)確性。這些數(shù)據(jù)表明，anit-F4/80抗體對(duì)EVs的表面修飾賦予了在體外將巨噬細(xì)胞表型從M1轉(zhuǎn)化為M2的更好特性。

圖8：ADSC來源的EV的表面修飾和體外轉(zhuǎn)化巨噬細(xì)胞極化

6體內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞靶向傳遞F4/80-EVs及其對(duì)AP小鼠的治療作用

為進(jìn)一步驗(yàn)證胰腺中巨噬細(xì)胞對(duì)F4/80 EVs的F4/80介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，使用正常和AP小鼠通過每只小鼠腹膜內(nèi)注射1×109個(gè)EVs或F4/80 EV顆粒來評(píng)估靶向遞送。使用全身熒光成像來分析EV的位置。如圖9a，b所示，EV處理后24小時(shí)，大多數(shù)熒光信號(hào)仍保留在正常小鼠的注射部位。相反，在EV處理的AP小鼠中，熒光信號(hào)擴(kuò)散到腹部，胰腺顯示出比用F4/80 EV處理的AP小鼠更強(qiáng)的熒光信號(hào)。接下來，采集這些小鼠的器官以評(píng)估EV在體內(nèi)的分布。與正常小鼠相比，EVs和F4/80-EVs主要積聚在胰腺和脾臟，部分分布在AP小鼠的腸道、腎臟和肝臟（圖9b）。F4/80-EVs在胰腺和脾臟中的熒光強(qiáng)度顯著高于EVs（圖9c）。接下來，作者使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢查了這些小鼠胰腺切片的熒光信號(hào)分布。結(jié)果與全身和器官成像結(jié)果非常一致。在EV和F4/80-EV處理后AP小鼠的胰腺中觀察到熒光；然而，F4/80-EV組的熒光顯著高于EV治療組（圖9d，e）。為驗(yàn)證F4/80 EVs在體內(nèi)靶向巨噬細(xì)胞的遞送，用Cy5標(biāo)記的兔抗F4/80多克隆抗體用于定位胰腺切片中的巨噬細(xì)胞，用FITC標(biāo)記的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒抗體用于定位修飾EV表面的大鼠抗F4/80多克隆抗體。雙陽性細(xì)胞表明巨噬細(xì)胞含有F4/80-EV，其隨F4/80-EVs濃度的增加而增加。胰腺切片中的雙陽性細(xì)胞逐漸增加，峰值為每只小鼠5×108和1×109個(gè)顆粒（圖9f，g）。

為研究F4/80 EVs和EVs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響及其在體內(nèi)的治療效果，基于先前的報(bào)告，作者通過5次腹膜內(nèi)注射，間隔3天，向AP小鼠全身施用EVs。使用實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)在治療后24小時(shí)進(jìn)行全身熒光成像（圖10a）。隨著F4/80-EV劑量的增加，熒光信號(hào)在胰腺和注射部位變得更加集中。糖耐受測試顯示，所有EV治療組均有顯著改善。每只小鼠1×109個(gè)顆粒的F4/80-EV組在3周后首先恢復(fù)到正常水平，而每只小鼠5×108個(gè)顆粒的F4/80-EV和每只小鼠10×109個(gè)粒子的EV組在4周后恢復(fù)（圖10b）。為進(jìn)一步驗(yàn)證EV治療的各組對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用，使用ELISA評(píng)估血漿中炎癥因子的水平，即IL-1β、TNF-α和IL-6。結(jié)果表明，炎癥因子水平在EV處理后顯著降低。值得注意的是，每只小鼠1×109個(gè)顆粒劑量的F4/80-EV組、每只小鼠5×108個(gè)顆粒F4/80-EV組和每只小鼠10×109個(gè)粒子的F4/8o-EV組表現(xiàn)出比每只小鼠50×108個(gè)粒子的EV組更好的療效。此外，HOMA-β分析證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。

接下來，作者使用抗iNOS和-CD206抗體分析了用EVs或F4/80EVS治療2、3和4周后AP小鼠的巨噬細(xì)胞極化。結(jié)果表明，與其他組相比，在每只小鼠1×109個(gè)顆粒的F4/80-EV組中CD206陽性細(xì)胞百分比最高。此外，F4/80-EV組中CD206陽性細(xì)胞的百分比（每只小鼠5×108個(gè)顆粒）幾乎等于EV組中每只小鼠1×109個(gè)顆粒的百分比（圖10c-e）。與治療效果一致，F4/80-EV組每只小鼠5×108個(gè)粒子，在體內(nèi)將M1極化轉(zhuǎn)化為M2極化，類似于EV組每每只小鼠1×109個(gè)粒子（圖11）。

圖9：體外F4/80-EV靶向遞送至巨噬細(xì)胞

圖10：AP小鼠中EVs和 F4/80‐EVs的治療效果 

結(jié)論：

總之，作者在小鼠模型中檢測了PPDM的發(fā)病機(jī)制。該分析表明，來源于M1表型巨噬細(xì)胞的EVs具有將炎性線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到β細(xì)胞中并通過鐵死亡和STING通路誘導(dǎo)β細(xì)胞死亡的能力。用抗F4/80抗體修飾ADSC分泌的EVs，用于靶向遞送至體內(nèi)巨噬細(xì)胞，用于AP的異常葡萄糖治療。作者的研究結(jié)果進(jìn)一步表明，M1表型巨噬細(xì)胞在β細(xì)胞衰竭和凋亡中發(fā)揮著重要作用，并且修飾的ADSC-EVs顯示出相當(dāng)大的潛力，可以作為PPDM靶向遞送的載體。

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞培養(yǎng)，葡萄糖耐受試驗(yàn)，細(xì)胞外囊泡分離，透射電鏡，納米粒子跟蹤分析，免疫電鏡，線粒體分離及轉(zhuǎn)染，線粒體呼吸測試，免疫熒光

參考文獻(xiàn)：

Gao Y, Mi N, Wu W, Zhao Y, Fan F, Liao W, Ming Y, Guan W, Bai C. Transfer of inflammatory mitochondria via extracellular vesicles from M1 macrophages induces ferroptosis of pancreatic beta cells in acute pancreatitis. J Extracell Vesicles. 2024 Feb;13(2):e12410. doi: 10.1002/jev2.12410. PMID: 38320981; PMCID: PMC10847061.