國(guó)自然熱點(diǎn)-線粒體自噬文章精講

盡管線粒體自噬在2型糖尿?。═2DM）引起的糖尿病心肌?。―CM）發(fā)病機(jī)制中的確切作用仍存在爭(zhēng)議，但近期研究表明，線粒體自噬的抑制會(huì)加重DCM中的心臟損傷。已有報(bào)道指出，高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP7表達(dá)上調(diào)，而在缺血/再灌注情況下，ZIP7的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致小鼠心臟中線粒體自噬受到抑制。然而，關(guān)于ZIP7在T2DM引起的DCM中的作用及其與線粒體自噬的關(guān)系，目前了解甚少。在T2DM小鼠心臟中，ZIP7表達(dá)上調(diào)，而ZIP7條件性敲除（cKO）減少了T2DM小鼠心臟中的線粒體活性氧（ROS）生成。T2DM抑制了小鼠心臟中的線粒體自噬，而ZIP7 cKO則阻止了這種抑制。T2DM抑制了心臟線粒體中PINK1和Parkin的積累，而ZIP7 cKO則阻止了這種抑制作用，這表明ZIP7上調(diào)通過抑制PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)了T2DM誘導(dǎo)的線粒體自噬抑制。T2DM導(dǎo)致線粒體超極化并降低線粒體Zn2?含量，而ZIP7 cKO則阻止了這一現(xiàn)象，這表明ZIP7上調(diào)通過減少線粒體內(nèi)的Zn2?導(dǎo)致線粒體超極化。最后，ZIP7 cKO阻止了T2DM引起的心臟功能障礙和纖維化。ZIP7上調(diào)通過抑制PINK1/Parkin途徑，介導(dǎo)了T2DM對(duì)小鼠心臟中線粒體自噬的抑制。ZIP7上調(diào)導(dǎo)致的線粒體Zn2?減少，是PINK1/Parkin途徑被抑制的原因。預(yù)防ZIP7上調(diào)對(duì)于治療T2DM引起的心肌病至關(guān)重要。本文于2024年11月發(fā)表于“Cardiovascular Diabetology”（IF=8.5）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）T2DM和高糖均上調(diào)ZIP7

為了測(cè)試ZIP7的表達(dá)是否會(huì)被T2DM改變，我們測(cè)量了其在小鼠心臟和心臟細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。如圖1A所示，ZIP7 mRNA和蛋白在T2DM小鼠心臟中的表達(dá)明顯升高。同樣，暴露于35 mM葡萄糖48小時(shí)的離體小鼠心肌細(xì)胞（圖1B）、HL-1細(xì)胞（圖1C）中ZIP7的表達(dá)也上調(diào)。這些結(jié)果表明ZIP7可能在T2DM誘導(dǎo)的心臟病中發(fā)揮作用。

2）T2DM小鼠心臟線粒體ROS升高，ZIP7的缺失降低了線粒體ROS

已有研究提出，線粒體活性氧（ROS）生成增加導(dǎo)致的氧化應(yīng)激有助于糖尿病心肌?。―CM）的發(fā)病。因此，我們檢測(cè)了2型糖尿?。═2DM）是否能改變心臟中線粒體ROS的生成，并確定了ZIP7在線粒體ROS生成中的作用。圖2A（左）顯示，與從野生型（WT）小鼠中分離的心肌細(xì)胞相比，T2DM小鼠的心肌細(xì)胞顯示出更高的DHE熒光強(qiáng)度，這表明T2DM增強(qiáng)了心肌細(xì)胞的ROS生成。然而，心臟特異性ZIP7敲除（cKO）阻止了T2DM誘導(dǎo)的ROS生成，如DHE熒光強(qiáng)度降低所示（圖2A），這表明ZIP7可能在T2DM誘導(dǎo)的心肌病中介導(dǎo)ROS生成。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)使用了Mitosox Red（一種線粒體超氧化物指示劑），結(jié)果顯示T2DM增加了線粒體ROS的生成，而ZIP7 cKO逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)（圖2B），這表明ZIP7可能有助于T2DM引起的心臟線粒體ROS生成。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，我們使用MitoB（一種線粒體靶向的光譜H2O2探針）在體內(nèi)檢測(cè)了小鼠心臟中的線粒體H2O2水平。圖2C顯示，與WT相比，T2DM心臟中的MitoP/MitoB比率顯著增加，而ZIP7 cKO逆轉(zhuǎn)了這一變化，這表明ZIP7介導(dǎo)了T2DM在小鼠心臟中誘導(dǎo)的線粒體H2O2生成。

3）ZIP7參與T2DM對(duì)線粒體自噬的抑制

功能失調(diào)的線粒體會(huì)觸發(fā)ROS生成和線粒體損傷的惡性循環(huán)。線粒體自噬可以選擇性地清除受損或功能失調(diào)的線粒體，從而防止線粒體ROS生成。因此，抑制或失活線粒體自噬會(huì)導(dǎo)致線粒體ROS生成增加。據(jù)此，我們檢測(cè)了ZIP7是否通過控制線粒體自噬來介導(dǎo)T2DM引起的線粒體ROS生成增加。用高劑量葡萄糖（35mM）處理AC16細(xì)胞，不僅增加了ZIP7蛋白表達(dá)，還下調(diào)了自噬作用，表現(xiàn)為P62表達(dá)增加，而LC3II/I比率降低（圖3A）。在小鼠心臟中，T2DM增加了P62、TOM22、TOM20和VDAC的蛋白表達(dá)水平，而ZIP7 cKO抑制了這一效應(yīng)，這表明T2DM在體內(nèi)通過ZIP7抑制小鼠心臟的線粒體自噬（圖3B）。在從小鼠心臟分離的線粒體中，ZIP7 cKO也阻止了T2DM引起的LC3II減少（圖3C）。為了確認(rèn)ZIP7在T2DM背景下線粒體自噬中的作用，我們向小鼠注射了mitoQC質(zhì)粒，并在心臟組織中檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。圖3D顯示，ZIP7 cKO在生理?xiàng)l件下或在T2DM背景下均增加了線粒體自噬。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)使用了mKeima（一種線粒體自噬的定量探針），結(jié)果表明T2DM下調(diào)了線粒體自噬，而ZIP7 cKO逆轉(zhuǎn)了這一變化（圖3E）。所有這些數(shù)據(jù)都表明，T2DM通過ZIP7抑制小鼠心臟的線粒體自噬。

4）ZIP7介導(dǎo)T2DM對(duì)線粒體中PINK1和Parkin積累的抑制

PINK1-Parkin通路在調(diào)節(jié)線粒體自噬過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了探究ZIP7是否通過PINK1-Parkin通路介導(dǎo)2型糖尿?。═2DM）背景下的線粒體自噬抑制，我們檢測(cè)了從小鼠心臟分離的線粒體內(nèi)Parkin和PINK1蛋白的水平。與野生型（WT）相比，T2DM顯著降低了線粒體內(nèi)Parkin和PINK1蛋白的水平，而ZIP7條件性敲除（cKO）則逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)，這表明ZIP7可能通過PINK1-Parkin通路介導(dǎo)T2DM誘導(dǎo)的線粒體自噬抑制（圖4A）。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，我們隨后檢測(cè)了PINK1 siRNA對(duì)活性氧（ROS）生成的影響。在注射siRNA后48小時(shí)，我們從心肌細(xì)胞中測(cè)量了ROS的水平。通過Western blotting評(píng)估了siRNA的有效性（圖4B）。如上所述，ZIP7 cKO能夠阻止T2DM誘導(dǎo)的ROS生成。然而，PINK1 siRNA逆轉(zhuǎn)了cKO的這一效應(yīng)，如二氫乙啶（DHE）熒光增強(qiáng)所示（圖4C）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)揭示，在cKOT2DM小鼠心肌細(xì)胞中，PINK1 siRNA顯著增強(qiáng)了Mitosox Red的熒光強(qiáng)度，這表明ZIP7敲低通過PINK1減輕了T2DM誘導(dǎo)的線粒體ROS生成。因此，這一結(jié)果支持了上述發(fā)現(xiàn)，即ZIP7通過PINK1-Parkin通路介導(dǎo)T2DM誘導(dǎo)的線粒體自噬抑制。

5）ZIP7 cKO通過增加線粒體Zn2+來阻止T2DM誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞線粒體超極化

為了探究2型糖尿病（T2DM）抑制Parkin招募入線粒體的機(jī)制，我們使用JC-1標(biāo)記分離的小鼠心肌細(xì)胞，測(cè)定了線粒體膜電位（MMP）。如圖5A所示，T2DM增加了JC-1的聚集體/單體比例，表明T2DM誘導(dǎo)了線粒體超極化。然而，ZIP7條件性敲除（cKO）逆轉(zhuǎn)了T2DM的這一效應(yīng)，暗示ZIP7是導(dǎo)致T2DM誘導(dǎo)的線粒體超極化的原因。為了支持這一觀點(diǎn)，使用TMRE的額外實(shí)驗(yàn)也顯示，ZIP7 cKO消除了T2DM誘導(dǎo)的超極化（圖5B）。ZIP7定位于線粒體，其在線粒體中的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)Zn2?水平降低。由于Zn2?是陽離子，ZIP7上調(diào)導(dǎo)致的線粒體內(nèi)Zn2?減少可能會(huì)引起線粒體超極化。因此，我們使用Zinpyr-1和Mitotracker在分離的小鼠心肌細(xì)胞中檢測(cè)了線粒體Zn2?水平。圖5C顯示，T2DM降低了線粒體Zn2?水平，而ZIP7 cKO阻止了這種降低，表明ZIP7是導(dǎo)致T2DM引起線粒體Zn2?減少的原因。體外研究也表明，用35mM葡萄糖處理小鼠心肌細(xì)胞會(huì)降低線粒體Zn2?水平，而ZIP7 cKO逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)（圖5D）。為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，我們使用ICPOES測(cè)定了線粒體Zn2?水平。與上述定量數(shù)據(jù)一致，T2DM顯著降低了線粒體Zn2?含量，而ZIP7 cKO阻止了這種降低（圖5E）。為了驗(yàn)證所有這些發(fā)現(xiàn)，我們測(cè)定了線粒體ZIP7蛋白水平，并發(fā)現(xiàn)從T2DM小鼠心臟分離的線粒體中ZIP7表達(dá)顯著增加（圖5F），這表明線粒體中的ZIP7增加會(huì)通過促進(jìn)Zn2?從線粒體流向胞質(zhì)溶膠來降低線粒體Zn2?水平。

6）ZIP7 cKO對(duì)T2DM引起的心功能障礙和纖維化有預(yù)防作用

為了進(jìn)一步證實(shí)ZIP7的作用，我們測(cè)試了ZIP7 cKO對(duì)T2DM條件下心功能、肥厚和纖維化的影響。超聲心動(dòng)圖研究顯示，T2DM可降低射血分?jǐn)?shù)（EF）、分?jǐn)?shù)縮短（FS）、左室舒張前壁厚度（LVAWD）和左室舒張后壁厚度（LVPWD），而ZIP7 cKO可抑制這一作用，提示ZIP7可解釋T2DM誘導(dǎo)的心功能障礙（圖6A）。HE染色的組織病理學(xué)研究顯示，WT小鼠心肌細(xì)胞條紋清晰，排列規(guī)律（圖6B，上面板）。相比之下，T2DM心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，纖維斷裂，ZIP7 cKO改善了這些，表明ZIP7與T2DM誘導(dǎo)的心肌損傷有關(guān)。Masson染色顯示，與WT相比，T2DM心肌中膠原蛋白明顯積累，ZIP7 cKO再次阻止了這種積累，提示ZIP7參與了T2DM誘導(dǎo)的纖維化。

結(jié)論：

ZIP7在糖尿病心肌病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而抑制或失活ZIP7可能成為治療T2DM所致糖尿病心肌病患者的有效治療策略。

實(shí)驗(yàn)方法：

Western blotting，線粒體膜電位測(cè)定，DHE，線粒體自噬試驗(yàn)，HE染色，qPCR。

參考文獻(xiàn)：

Yang N, Zhang R, Zhang H, Yu Y, Xu Z. ZIP7 contributes to the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy by suppressing mitophagy in mouse hearts. Cardiovasc Diabetol. 2024 Nov 7;23(1):399. doi: 10.1186/s12933-024-02499-2.