遷移體釋放和靶向遞送的細(xì)胞因子在炎癥部位的快速積累

細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞的關(guān)鍵效應(yīng)分子，在身體對感染、炎癥和創(chuàng)傷的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。分泌的細(xì)胞因子通過擴(kuò)散形成梯度，由近及遠(yuǎn)濃度逐漸降低。然而，在動(dòng)態(tài)流動(dòng)系統(tǒng)如血液中，建立局部梯度是具有挑戰(zhàn)性的。遷移體（migrasomes）是在遷移細(xì)胞中形成的一種細(xì)胞器，富含細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等信號(hào)分子，可以被周圍細(xì)胞捕獲并影響和改變受體細(xì)胞的行為和狀態(tài)。該研究闡述遷移體在循環(huán)系統(tǒng)中如何包裝、釋放和靶向遞送細(xì)胞因子，揭示了遷移體在免疫反應(yīng)中的重要作用。該文章于2024年12月發(fā)表在《Cell Discovery》，IF=20.91。

首先，研究者研究了單核細(xì)胞是否能在體內(nèi)產(chǎn)生遷移體。在對照小鼠中，CCR2抗體標(biāo)記的單核細(xì)胞幾乎無法檢測到；然而，在LPS刺激后，單核細(xì)胞在血管中清晰可見，并且形成了大量的CCR2陽性細(xì)胞外顆粒（圖1a）。為了確定循環(huán)單核細(xì)胞是否在體內(nèi)釋放如TNF-α等細(xì)胞因子，研究者對血管內(nèi)單核細(xì)胞中的TNF-α進(jìn)行染色?；铙w成像顯示TNF-α明顯極化到CCR2陽性單核細(xì)胞的后端，并且在這些細(xì)胞外顆粒中顯著富集（圖1b）。隨后，研究者通過負(fù)選擇磁性分選從小鼠血液中分離出單核細(xì)胞來源的細(xì)胞外顆粒（圖1c）。對于共聚焦成像分析，研究者首先用抗CCR2抗體涂覆蓋玻片。該抗體涂覆的表面與單核細(xì)胞來源的細(xì)胞外顆粒孵育，隨后洗滌和免疫染色（圖1c）。通過這種方式，研究者捕獲了CCR2陽性顆粒。CCR2陽性顆粒表現(xiàn)出遷移體的形態(tài)特征（圖1d）。并且，在這些遷移體中檢測到了TNF-α和IL-6（圖1e，f）。

研究者發(fā)現(xiàn)，LPS激活原代的單核細(xì)胞產(chǎn)生了大量的遷移體。激活的單核細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6，這兩種細(xì)胞因子在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。用抗TNF-α和IL-6的抗體對LPS激活的單核細(xì)胞進(jìn)行免疫染色顯示，TNF-α以斑點(diǎn)形式存在于遷移體中，而IL-6則存在于遷移體內(nèi)的腔內(nèi)囊泡中。WB證實(shí)，LPS處理顯著增強(qiáng)了細(xì)胞體和遷移體中TNF-α和IL-6的水平。此外，與細(xì)胞體相比，TNF-α和IL-6在遷移體中富集。接下來，研究者從細(xì)胞膜和遷移體中分離總膜蛋白。如預(yù)期的那樣，膜結(jié)合的TNF-α在遷移體中顯著富集。

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明細(xì)胞因子在遷移體中富集。鈣離子對細(xì)胞因子的胞吐至關(guān)重要。為了準(zhǔn)確估計(jì)通過遷移體釋放的細(xì)胞因子量，研究者用細(xì)胞滲透性鈣螯合劑BAPTA-AM處理LPS刺激的單核細(xì)胞10小時(shí)。這種處理阻斷了細(xì)胞體的細(xì)胞膜和遷移體膜的細(xì)胞因子胞吐。隨后，研究者分別用TNF-α和IL-6抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色。研究者觀察到，阻斷胞吐顯著增加了遷移體中的細(xì)胞因子量，但細(xì)胞體中的量沒有增加。BAPTA-AM處理后，遷移體中的TNF-α和IL-6水平分別增加了14.6倍和10.9倍，而細(xì)胞體中僅分別增加了1.41倍和1.35倍（圖1g，h），表明遷移體是細(xì)胞因子的主要分泌場所。

接下來，研究者測試了分泌載體是否在遷移體中富集。透射電子顯微鏡（TEM）識(shí)別出原代單核細(xì)胞來源遷移體內(nèi)存在許多腔內(nèi)囊泡。接下來，研究者使用針對分泌載體上各種標(biāo)記物的抗體，包括Rabs、V-SNAREs和T-SNAREs。研究者的發(fā)現(xiàn)表明遷移體中存在幾種分泌載體的關(guān)鍵標(biāo)記物。這些包括與組成性胞吐相關(guān)的Rab8a和VAMP2，以及通過回收內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與調(diào)節(jié)性分泌途徑相關(guān)的Rab11a和VAMP3。此外，TSNARE SNAP23在遷移體膜中顯著富集。同樣，用BAPTA-AM處理細(xì)胞顯著增加了遷移體中Rab8a、Rab11a、VAMP2和VAMP3標(biāo)記的囊泡數(shù)量。這些數(shù)據(jù)表明分泌載體可以富集在遷移體中。

體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示單核細(xì)胞向血液中釋放富含TNF-α的遷移體。為了更詳細(xì)地檢查釋放過程，研究者用熒光素偶聯(lián)的抗TNF-α抗體標(biāo)記PMA激活的THP-1細(xì)胞。這種抗體標(biāo)記了細(xì)胞膜和一群細(xì)胞內(nèi)囊泡。在不支持遷移的對照表面上，THP-1細(xì)胞顯示出TNF-α囊泡的非極化分布，如延時(shí)成像所示。然而，在支持遷移和遷移體形成的纖維連接蛋白（FN）涂覆表面上，TNF-α囊泡明顯極化到細(xì)胞后端并進(jìn)入遷移體（圖2a）。支持這一觀察，L929細(xì)胞表達(dá)TNF-α-BFP或IL-6-GFP的活體成像顯示，大多數(shù)TNF-α-BFP囊泡位于細(xì)胞后端，幾乎沒有囊泡位于前端。IL-6-GFP也顯示出極化分布，盡管程度較小，大多數(shù)囊泡位于后端，幾乎沒有位于前緣（圖2b，c）。然而，當(dāng)細(xì)胞遷移和遷移體形成被遷移肽抑制劑GLPG0187抑制時(shí)，這種極化丟失。在這些條件下，TNF-α-BFP和IL-6-GFP囊泡在整個(gè)細(xì)胞中均勻分布（圖2b，c）。值得注意的是，用BAPTA-AM處理阻斷分泌顯著增加了遷移體中TNF-α-GFP和IL-6-GFP的水平，而不影響細(xì)胞體中TNF-αGFP和IL-6-GFP的水平，進(jìn)一步支持遷移體是遷移細(xì)胞中胞吐的主要場所。以上結(jié)果表明細(xì)胞遷移可以驅(qū)動(dòng)分泌模式的轉(zhuǎn)變，其特征是分泌囊泡向細(xì)胞后端的極化運(yùn)輸。

接下來，為確定靜止細(xì)胞和遷移細(xì)胞中分泌的效率，研究者開發(fā)了一種新方法來定量總細(xì)胞分泌。這種方法需要收集培養(yǎng)基，通過超濾分離可溶性蛋白。同時(shí)，從相同的細(xì)胞培養(yǎng)皿中純化遷移體，并引入裂解緩沖液以回收遷移體內(nèi)的蛋白和濾器上的可溶性蛋白（圖2d）。通過這種方法，研究者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)在促進(jìn)遷移體形成的FN涂覆培養(yǎng)皿上的單核細(xì)胞顯示出TNF-α和IL-6分泌分別增加了3.1倍和1.6倍，與培養(yǎng)在不支持遷移體形成的對照培養(yǎng)皿上的單核細(xì)胞相比（圖2e）。重要的是，這種分泌差異不是由于不同培養(yǎng)條件引起的細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化，因?yàn)榧?xì)胞體內(nèi)的TNF-α和IL-6水平在兩種條件下保持一致（圖2e）。總之，研究者的發(fā)現(xiàn)表明，當(dāng)細(xì)胞開始遷移時(shí)，它們轉(zhuǎn)變?yōu)榕c遷移相關(guān)的分泌模式。這一模式的特征是極化運(yùn)輸路線，顯著提高了總體分泌水平，這一過程依賴于遷移體的形成（圖2f）。

在研究者之前的研究中，研究者注意到四跨膜蛋白家族成員調(diào)節(jié)遷移體的形成。Tspan9基因敲除（T9 KO）小鼠的中性粒細(xì)胞顯示出受損的遷移體生物合成。研究者觀察到，從T9 KO小鼠分離的單核細(xì)胞中遷移體形成也受到損害。此外，研究者觀察到WT小鼠的單核細(xì)胞顯示出總TNF-α和IL-6分泌水平分別比T9 KO小鼠的單核細(xì)胞高出2.4倍和1.7倍（圖3a）。這支持了研究者的假設(shè)，即遷移體在細(xì)胞因子釋放中起核心作用。

為了研究Tspan9在單核細(xì)胞遷移體形成中的作用，研究者進(jìn)行了三項(xiàng)檢測，以比較WT和T9 KO小鼠血液中CCR2陽性、單核細(xì)胞來源顆粒的數(shù)量。首先，研究者從小鼠中分離單核細(xì)胞，然后用不同顏色標(biāo)記的CCR2抗體進(jìn)行標(biāo)記。將顏色編碼的細(xì)胞混合后，注入WT小鼠。與研究者在體外的觀察相似，活體成像顯示T9 KO小鼠的單核細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生的遷移體較少（圖3b）。接下來，為了直接比較WT和T9 KO小鼠血液中CCR2顆粒的水平，研究者使用多光譜成像流式細(xì)胞術(shù)定量循環(huán)CCR2顆粒。簡而言之，在稀釋后，全血用CCR2抗體染色以標(biāo)記單核細(xì)胞和單核細(xì)胞來源結(jié)構(gòu)，隨后進(jìn)行成像流式細(xì)胞術(shù)。成像分析表明，這些CCR2陽性顆粒是小囊泡，類似于研究者在體內(nèi)觀察到的單核細(xì)胞來源遷移體。多光譜成像流式細(xì)胞術(shù)顯示T9 KO小鼠的血液中CCR2顆粒顯著減少（圖3c）。最后，研究者從小鼠中收集等體積的血液，將CCR2顆粒捕獲在涂覆有CCR2抗體的表面上，并使用成像分析定量捕獲的CCR2顆粒。一致地，研究者在T9 KO小鼠中觀察到CCR2顆粒的減少（圖3d）。

接下來，研究者從生化角度對單核細(xì)胞來源顆粒進(jìn)行了表征。首先，研究者按照圖1c中所示的示意圖中的協(xié)議分離單核細(xì)胞來源顆粒。由于單核細(xì)胞來源遷移體是CCR2陽性，負(fù)選擇過程將去除其他類型細(xì)胞產(chǎn)生的CCR2陽性顆粒。為了驗(yàn)證單核細(xì)胞來源的CCR2陽性顆粒是否顯著受到其他類型細(xì)胞外囊泡（EVs）的污染，研究者評估了經(jīng)典用于分析小EVs（包括在多泡內(nèi)體中形成的外泌體和在細(xì)胞膜上形成的小ectosomes）和大EVs的標(biāo)記物。研究者的發(fā)現(xiàn)表明CCR2顆粒沒有顯著受到其他EV類型的污染：CCR2顆粒幾乎沒有小EVs的標(biāo)記物CD63、CD81和Alix，并且缺乏微囊泡標(biāo)記物Arf6和Kif23（圖3e）。同樣，CCR2顆粒幾乎不含與血小板或血小板來源EVs強(qiáng)相關(guān)的CD9（圖3e）。相比之下，CCR2顆粒富含遷移體標(biāo)記物CPQ（圖3e）。這些發(fā)現(xiàn)表明，遷移體與其他類型EVs的主要區(qū)別在于遷移體含有分泌載體，這一特征在其他任何EVs中均未報(bào)道。因此，研究者將分泌載體的標(biāo)記物，如VAMP2、VAMP3、Rab8a、Rab11a以及分泌細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-6，作為遷移體的標(biāo)記物。研究者發(fā)現(xiàn)這些蛋白確實(shí)富集在遷移體中，而不是在其他共分離的不同大小和密度的EVs中（圖3e）。在隨后的WB分析中，研究者從小鼠血液中分離出CCR2陽性顆粒，發(fā)現(xiàn)T9 KO小鼠顯示出遷移體標(biāo)記物的顯著減少（圖3f）。值得注意的是，在T9 KO小鼠中，與VAMP2、Rab8a和IL-6相比，VAMP3、Rab11a和TNF-α的減少更為顯著，表明通過回收內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Rab11a調(diào)節(jié)的運(yùn)輸途徑比Rab8a調(diào)節(jié)的組成性運(yùn)輸途徑更特異性地導(dǎo)向遷移體。為了排除這些標(biāo)記物減少是由于表達(dá)水平降低的可能性，研究者比較了從小鼠類型中分離的單核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。研究者的發(fā)現(xiàn)表明，T9 KO小鼠的單核細(xì)胞中這些蛋白的表達(dá)水平并未降低?？傊?，這些結(jié)果表明CCR2顆粒確實(shí)是遷移體，并且T9 KO小鼠的單核細(xì)胞中遷移體標(biāo)記物的水平顯著降低，這并非由于蛋白表達(dá)水平的降低。

接下來，研究者評估了遷移體在體內(nèi)細(xì)胞因子分泌中的作用。這尤其重要，因?yàn)檫w移體中釋放的細(xì)胞因子可能無法通過標(biāo)準(zhǔn)方法如細(xì)胞因子陣列檢測到。為此，研究者從小鼠中分離等體積的血液，提取單核細(xì)胞來源的遷移體，并使用超濾從血液中收集分泌蛋白。然后，研究者使用WB分析測量這些單核細(xì)胞來源遷移體（M）中的TNF-α和IL-6水平，以及可溶性分?jǐn)?shù)（S）和合并樣本（TS）中的水平（圖3g）。研究者的結(jié)果表明，在WT小鼠中，約50%的TNF-α和24%的IL-6與遷移體相關(guān)分泌（圖3h）。此外，WT小鼠的TNF-α和IL-6的總分泌分別比T9 KO小鼠高出1.8倍和1.5倍（圖3h）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明遷移體是單核細(xì)胞在體內(nèi)的主要分泌途徑。此外，數(shù)據(jù)揭示了大量細(xì)胞因子是成批在遷移體中釋放的。

研究者已經(jīng)收集了證據(jù)，表明血液中總炎癥細(xì)胞因子的相當(dāng)一部分包含在循環(huán)遷移體中。研究者進(jìn)一步研究了這些遷移體包裝的細(xì)胞因子是否可以在遷移體從細(xì)胞分離后釋放。為此，研究者從表達(dá)TNF-α-GFP的L929細(xì)胞中分離遷移體，并在含鈣緩沖液中培養(yǎng)這些富集的遷移體。延時(shí)成像顯示TNF-α-GFP陽性分泌囊泡逐漸與遷移體膜融合，表明這種融合可以在遷移體分離后發(fā)生。為了確定這種融合是否可以在生理?xiàng)l件下發(fā)生，研究者從血清中分離單核細(xì)胞來源的CCR2陽性遷移體，然后在血清中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，研究者用TNF-α抗體對遷移體進(jìn)行免疫染色。研究者的觀察表明，在直接從血清中分離的遷移體（未培養(yǎng)）中，大多數(shù)TNF-α信號(hào)是腔內(nèi)的。然而，在24小時(shí)培養(yǎng)后，幾乎所有TNF-α信號(hào)都出現(xiàn)在遷移體膜上，表明含有TNF-α的分泌囊泡與遷移體膜融合。為了更深入地了解遷移體持續(xù)釋放細(xì)胞因子的生化機(jī)制，研究者通過過濾從等量血清中分離遷移體和可溶性細(xì)胞因子，并比較有無24小時(shí)培養(yǎng)的樣本。在未培養(yǎng)的遷移體分?jǐn)?shù)（M）中，TNF-α以加工和未加工形式存在。在24小時(shí)培養(yǎng)后，研究者注意到無論其形式如何，TNF-α水平顯著降低。同樣，遷移體分?jǐn)?shù)中IL-6的量在培養(yǎng)后顯著減少。相反，可溶性TNF-α和IL-6（S分?jǐn)?shù)）的水平在培養(yǎng)后增加，表明這些細(xì)胞因子從遷移體中釋放。當(dāng)培養(yǎng)反應(yīng)用BAPTA-AM處理時(shí)，TNF-α和IL-6的釋放被抑制，支持細(xì)胞因子釋放是通過SNARE依賴性融合過程促進(jìn)的觀點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)分離的遷移體可以包含TNF-α和IL-6，這意味著在分離后，遷移體可能作為信號(hào)配體的囊泡載體。為了確定遷移體包裝的細(xì)胞因子是否具有功能，研究者研究了遷移體是否可以傳遞TNF-α信號(hào)。利用TNF-α和caspase 8抑制劑zVAD的組合可以在L929細(xì)胞中誘導(dǎo)壞死的知識(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)將分離的單核細(xì)胞來源遷移體和zVAD引入L929細(xì)胞可以有效地導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鑒于TNF-α和TACE都存在于遷移體上，研究者接下來檢查了遷移體結(jié)合的TNF-α是否可以被TACE切割以產(chǎn)生可溶性TNF-α。研究者觀察到TNF-α確實(shí)可以從遷移體上被切割下來，并且這種切割和遷移體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷可以通過添加TACE抑制劑部分抑制。因此，細(xì)胞毒性效應(yīng)似乎是從遷移體釋放的裂解的自由TNF-α和遷移體相關(guān)TNF-α的綜合結(jié)果。這些結(jié)果表明遷移體可能使細(xì)胞因子在血液中持續(xù)釋放的機(jī)制。

遷移體富含粘附分子，如整合素。內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥期間經(jīng)歷“內(nèi)皮激活”，這一過程以粘附分子的上調(diào)為特征。研究者推測循環(huán)遷移體可能選擇性地粘附到正在經(jīng)歷局部炎癥的血管系統(tǒng)區(qū)域。

為研究遷移體包裝的細(xì)胞因子的潛在生理作用，研究者使用局部炎癥檢測。用小劑量LPS注射小鼠肝臟，接下來從血液中純化CCR2陽性遷移體，用抗CCR2抗體染色，然后注入尾靜脈。研究者觀察到外源性注入的CCR2陽性遷移體迅速在LPS注射部位積累，導(dǎo)致CCR2信號(hào)的積累（圖4a）。相比之下，局部PBS注射并未導(dǎo)致外源性遷移體積累。

為了確定在血液中循環(huán)的內(nèi)源性單核細(xì)胞來源遷移體是否也靶向炎癥部位，腹腔注射LPS以提高循環(huán)中的單核細(xì)胞水平。LPS注射后2小時(shí)，研究者注入抗CCR2和抗TNF-α抗體以標(biāo)記單核細(xì)胞來源遷移體。觀察到CCR2和TNF-α陽性遷移體迅速在LPS注射部位積累，但在PBS注射部位沒有積累，表明循環(huán)中的單核細(xì)胞來源遷移體可以迅速靶向炎癥部位（圖4b）。相比之下，在T9 KO小鼠中，LPS注射部位的CCR2和TNF-α信號(hào)的積累顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)了遷移體對于局部炎癥部位的細(xì)胞因子靶向遞送是必需的（圖4c）?？傊?，研究者的數(shù)據(jù)指向了一種以前未被識(shí)別的細(xì)胞因子遞送機(jī)制。這一機(jī)制確保了各種細(xì)胞因子通過遷移體快速運(yùn)輸?shù)骄植垦装Y部位，并且這些遷移體隨后作為細(xì)胞因子的持續(xù)局部來源。研究者的發(fā)現(xiàn)為炎癥反應(yīng)期間細(xì)胞因子靶向的復(fù)雜機(jī)制提供了新的見解（圖4d）。

這篇文章揭示了單核細(xì)胞在LPS刺激下釋放富含炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-6）的遷移體，這些遷移體在循環(huán)中作為細(xì)胞因子的主要載體。研究發(fā)現(xiàn)，遷移體是單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的主要途徑，且Tspan9基因敲除小鼠的單核細(xì)胞遷移體形成受損，導(dǎo)致血液中總細(xì)胞因子水平顯著降低。此外，遷移體能夠在分離后持續(xù)釋放細(xì)胞因子，并且在局部炎癥發(fā)生時(shí)，循環(huán)中的單核細(xì)胞衍生遷移體能迅速靶向炎癥部位，為細(xì)胞因子的局部遞送提供了新機(jī)制，對理解免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)具有重要意義。

細(xì)胞培養(yǎng)與激活、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡和長時(shí)間延時(shí)成像技術(shù)、活體成像、掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）、遷移體分離、EVs分離、多光譜成像流式細(xì)胞術(shù)、總膜蛋白分離、western blot。

Jiao H, Li X, Li Y, et al. Packaged release and targeted delivery of cytokines by migrasomes in circulation. Cell Discov. 2024;10(1):121. Published 2024 Dec 9. doi:10.1038/s41421-024-00749-x