遷移體釋放和靶向遞送的細胞因子在炎癥部位的快速積累

細胞因子是免疫細胞的關鍵效應分子，在身體對感染、炎癥和創(chuàng)傷的反應中起著至關重要的作用。分泌的細胞因子通過擴散形成梯度，由近及遠濃度逐漸降低。然而，在動態(tài)流動系統(tǒng)如血液中，建立局部梯度是具有挑戰(zhàn)性的。遷移體（migrasomes）是在遷移細胞中形成的一種細胞器，富含細胞因子、趨化因子和生長因子等信號分子，可以被周圍細胞捕獲并影響和改變受體細胞的行為和狀態(tài)。該研究闡述遷移體在循環(huán)系統(tǒng)中如何包裝、釋放和靶向遞送細胞因子，揭示了遷移體在免疫反應中的重要作用。該文章于2024年12月發(fā)表在《Cell Discovery》，IF=20.91。

首先，研究者研究了單核細胞是否能在體內(nèi)產(chǎn)生遷移體。在對照小鼠中，CCR2抗體標記的單核細胞幾乎無法檢測到；然而，在LPS刺激后，單核細胞在血管中清晰可見，并且形成了大量的CCR2陽性細胞外顆粒（圖1a）。為了確定循環(huán)單核細胞是否在體內(nèi)釋放如TNF-α等細胞因子，研究者對血管內(nèi)單核細胞中的TNF-α進行染色?；铙w成像顯示TNF-α明顯極化到CCR2陽性單核細胞的后端，并且在這些細胞外顆粒中顯著富集（圖1b）。隨后，研究者通過負選擇磁性分選從小鼠血液中分離出單核細胞來源的細胞外顆粒（圖1c）。對于共聚焦成像分析，研究者首先用抗CCR2抗體涂覆蓋玻片。該抗體涂覆的表面與單核細胞來源的細胞外顆粒孵育，隨后洗滌和免疫染色（圖1c）。通過這種方式，研究者捕獲了CCR2陽性顆粒。CCR2陽性顆粒表現(xiàn)出遷移體的形態(tài)特征（圖1d）。并且，在這些遷移體中檢測到了TNF-α和IL-6（圖1e，f）。

研究者發(fā)現(xiàn)，LPS激活原代的單核細胞產(chǎn)生了大量的遷移體。激活的單核細胞分泌TNF-α和IL-6，這兩種細胞因子在先天免疫反應中發(fā)揮重要作用。用抗TNF-α和IL-6的抗體對LPS激活的單核細胞進行免疫染色顯示，TNF-α以斑點形式存在于遷移體中，而IL-6則存在于遷移體內(nèi)的腔內(nèi)囊泡中。WB證實，LPS處理顯著增強了細胞體和遷移體中TNF-α和IL-6的水平。此外，與細胞體相比，TNF-α和IL-6在遷移體中富集。接下來，研究者從細胞膜和遷移體中分離總膜蛋白。如預期的那樣，膜結(jié)合的TNF-α在遷移體中顯著富集。

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明細胞因子在遷移體中富集。鈣離子對細胞因子的胞吐至關重要。為了準確估計通過遷移體釋放的細胞因子量，研究者用細胞滲透性鈣螯合劑BAPTA-AM處理LPS刺激的單核細胞10小時。這種處理阻斷了細胞體的細胞膜和遷移體膜的細胞因子胞吐。隨后，研究者分別用TNF-α和IL-6抗體對細胞進行染色。研究者觀察到，阻斷胞吐顯著增加了遷移體中的細胞因子量，但細胞體中的量沒有增加。BAPTA-AM處理后，遷移體中的TNF-α和IL-6水平分別增加了14.6倍和10.9倍，而細胞體中僅分別增加了1.41倍和1.35倍（圖1g，h），表明遷移體是細胞因子的主要分泌場所。

接下來，研究者測試了分泌載體是否在遷移體中富集。透射電子顯微鏡（TEM）識別出原代單核細胞來源遷移體內(nèi)存在許多腔內(nèi)囊泡。接下來，研究者使用針對分泌載體上各種標記物的抗體，包括Rabs、V-SNAREs和T-SNAREs。研究者的發(fā)現(xiàn)表明遷移體中存在幾種分泌載體的關鍵標記物。這些包括與組成性胞吐相關的Rab8a和VAMP2，以及通過回收內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與調(diào)節(jié)性分泌途徑相關的Rab11a和VAMP3。此外，TSNARE SNAP23在遷移體膜中顯著富集。同樣，用BAPTA-AM處理細胞顯著增加了遷移體中Rab8a、Rab11a、VAMP2和VAMP3標記的囊泡數(shù)量。這些數(shù)據(jù)表明分泌載體可以富集在遷移體中。

體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示單核細胞向血液中釋放富含TNF-α的遷移體。為了更詳細地檢查釋放過程，研究者用熒光素偶聯(lián)的抗TNF-α抗體標記PMA激活的THP-1細胞。這種抗體標記了細胞膜和一群細胞內(nèi)囊泡。在不支持遷移的對照表面上，THP-1細胞顯示出TNF-α囊泡的非極化分布，如延時成像所示。然而，在支持遷移和遷移體形成的纖維連接蛋白（FN）涂覆表面上，TNF-α囊泡明顯極化到細胞后端并進入遷移體（圖2a）。支持這一觀察，L929細胞表達TNF-α-BFP或IL-6-GFP的活體成像顯示，大多數(shù)TNF-α-BFP囊泡位于細胞后端，幾乎沒有囊泡位于前端。IL-6-GFP也顯示出極化分布，盡管程度較小，大多數(shù)囊泡位于后端，幾乎沒有位于前緣（圖2b，c）。然而，當細胞遷移和遷移體形成被遷移肽抑制劑GLPG0187抑制時，這種極化丟失。在這些條件下，TNF-α-BFP和IL-6-GFP囊泡在整個細胞中均勻分布（圖2b，c）。值得注意的是，用BAPTA-AM處理阻斷分泌顯著增加了遷移體中TNF-α-GFP和IL-6-GFP的水平，而不影響細胞體中TNF-αGFP和IL-6-GFP的水平，進一步支持遷移體是遷移細胞中胞吐的主要場所。以上結(jié)果表明細胞遷移可以驅(qū)動分泌模式的轉(zhuǎn)變，其特征是分泌囊泡向細胞后端的極化運輸。

接下來，為確定靜止細胞和遷移細胞中分泌的效率，研究者開發(fā)了一種新方法來定量總細胞分泌。這種方法需要收集培養(yǎng)基，通過超濾分離可溶性蛋白。同時，從相同的細胞培養(yǎng)皿中純化遷移體，并引入裂解緩沖液以回收遷移體內(nèi)的蛋白和濾器上的可溶性蛋白（圖2d）。通過這種方法，研究者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)在促進遷移體形成的FN涂覆培養(yǎng)皿上的單核細胞顯示出TNF-α和IL-6分泌分別增加了3.1倍和1.6倍，與培養(yǎng)在不支持遷移體形成的對照培養(yǎng)皿上的單核細胞相比（圖2e）。重要的是，這種分泌差異不是由于不同培養(yǎng)條件引起的細胞因子表達水平的變化，因為細胞體內(nèi)的TNF-α和IL-6水平在兩種條件下保持一致（圖2e）?？傊?，研究者的發(fā)現(xiàn)表明，當細胞開始遷移時，它們轉(zhuǎn)變?yōu)榕c遷移相關的分泌模式。這一模式的特征是極化運輸路線，顯著提高了總體分泌水平，這一過程依賴于遷移體的形成（圖2f）。

在研究者之前的研究中，研究者注意到四跨膜蛋白家族成員調(diào)節(jié)遷移體的形成。Tspan9基因敲除（T9 KO）小鼠的中性粒細胞顯示出受損的遷移體生物合成。研究者觀察到，從T9 KO小鼠分離的單核細胞中遷移體形成也受到損害。此外，研究者觀察到WT小鼠的單核細胞顯示出總TNF-α和IL-6分泌水平分別比T9 KO小鼠的單核細胞高出2.4倍和1.7倍（圖3a）。這支持了研究者的假設，即遷移體在細胞因子釋放中起核心作用。

為了研究Tspan9在單核細胞遷移體形成中的作用，研究者進行了三項檢測，以比較WT和T9 KO小鼠血液中CCR2陽性、單核細胞來源顆粒的數(shù)量。首先，研究者從小鼠中分離單核細胞，然后用不同顏色標記的CCR2抗體進行標記。將顏色編碼的細胞混合后，注入WT小鼠。與研究者在體外的觀察相似，活體成像顯示T9 KO小鼠的單核細胞在體內(nèi)產(chǎn)生的遷移體較少（圖3b）。接下來，為了直接比較WT和T9 KO小鼠血液中CCR2顆粒的水平，研究者使用多光譜成像流式細胞術定量循環(huán)CCR2顆粒。簡而言之，在稀釋后，全血用CCR2抗體染色以標記單核細胞和單核細胞來源結(jié)構(gòu)，隨后進行成像流式細胞術。成像分析表明，這些CCR2陽性顆粒是小囊泡，類似于研究者在體內(nèi)觀察到的單核細胞來源遷移體。多光譜成像流式細胞術顯示T9 KO小鼠的血液中CCR2顆粒顯著減少（圖3c）。最后，研究者從小鼠中收集等體積的血液，將CCR2顆粒捕獲在涂覆有CCR2抗體的表面上，并使用成像分析定量捕獲的CCR2顆粒。一致地，研究者在T9 KO小鼠中觀察到CCR2顆粒的減少（圖3d）。

接下來，研究者從生化角度對單核細胞來源顆粒進行了表征。首先，研究者按照圖1c中所示的示意圖中的協(xié)議分離單核細胞來源顆粒。由于單核細胞來源遷移體是CCR2陽性，負選擇過程將去除其他類型細胞產(chǎn)生的CCR2陽性顆粒。為了驗證單核細胞來源的CCR2陽性顆粒是否顯著受到其他類型細胞外囊泡（EVs）的污染，研究者評估了經(jīng)典用于分析小EVs（包括在多泡內(nèi)體中形成的外泌體和在細胞膜上形成的小ectosomes）和大EVs的標記物。研究者的發(fā)現(xiàn)表明CCR2顆粒沒有顯著受到其他EV類型的污染：CCR2顆粒幾乎沒有小EVs的標記物CD63、CD81和Alix，并且缺乏微囊泡標記物Arf6和Kif23（圖3e）。同樣，CCR2顆粒幾乎不含與血小板或血小板來源EVs強相關的CD9（圖3e）。相比之下，CCR2顆粒富含遷移體標記物CPQ（圖3e）。這些發(fā)現(xiàn)表明，遷移體與其他類型EVs的主要區(qū)別在于遷移體含有分泌載體，這一特征在其他任何EVs中均未報道。因此，研究者將分泌載體的標記物，如VAMP2、VAMP3、Rab8a、Rab11a以及分泌細胞因子，如TNF-α和IL-6，作為遷移體的標記物。研究者發(fā)現(xiàn)這些蛋白確實富集在遷移體中，而不是在其他共分離的不同大小和密度的EVs中（圖3e）。在隨后的WB分析中，研究者從小鼠血液中分離出CCR2陽性顆粒，發(fā)現(xiàn)T9 KO小鼠顯示出遷移體標記物的顯著減少（圖3f）。值得注意的是，在T9 KO小鼠中，與VAMP2、Rab8a和IL-6相比，VAMP3、Rab11a和TNF-α的減少更為顯著，表明通過回收內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Rab11a調(diào)節(jié)的運輸途徑比Rab8a調(diào)節(jié)的組成性運輸途徑更特異性地導向遷移體。為了排除這些標記物減少是由于表達水平降低的可能性，研究者比較了從小鼠類型中分離的單核細胞中的蛋白表達水平。研究者的發(fā)現(xiàn)表明，T9 KO小鼠的單核細胞中這些蛋白的表達水平并未降低。總之，這些結(jié)果表明CCR2顆粒確實是遷移體，并且T9 KO小鼠的單核細胞中遷移體標記物的水平顯著降低，這并非由于蛋白表達水平的降低。

接下來，研究者評估了遷移體在體內(nèi)細胞因子分泌中的作用。這尤其重要，因為遷移體中釋放的細胞因子可能無法通過標準方法如細胞因子陣列檢測到。為此，研究者從小鼠中分離等體積的血液，提取單核細胞來源的遷移體，并使用超濾從血液中收集分泌蛋白。然后，研究者使用WB分析測量這些單核細胞來源遷移體（M）中的TNF-α和IL-6水平，以及可溶性分數(shù)（S）和合并樣本（TS）中的水平（圖3g）。研究者的結(jié)果表明，在WT小鼠中，約50%的TNF-α和24%的IL-6與遷移體相關分泌（圖3h）。此外，WT小鼠的TNF-α和IL-6的總分泌分別比T9 KO小鼠高出1.8倍和1.5倍（圖3h）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明遷移體是單核細胞在體內(nèi)的主要分泌途徑。此外，數(shù)據(jù)揭示了大量細胞因子是成批在遷移體中釋放的。

研究者已經(jīng)收集了證據(jù)，表明血液中總炎癥細胞因子的相當一部分包含在循環(huán)遷移體中。研究者進一步研究了這些遷移體包裝的細胞因子是否可以在遷移體從細胞分離后釋放。為此，研究者從表達TNF-α-GFP的L929細胞中分離遷移體，并在含鈣緩沖液中培養(yǎng)這些富集的遷移體。延時成像顯示TNF-α-GFP陽性分泌囊泡逐漸與遷移體膜融合，表明這種融合可以在遷移體分離后發(fā)生。為了確定這種融合是否可以在生理條件下發(fā)生，研究者從血清中分離單核細胞來源的CCR2陽性遷移體，然后在血清中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，研究者用TNF-α抗體對遷移體進行免疫染色。研究者的觀察表明，在直接從血清中分離的遷移體（未培養(yǎng)）中，大多數(shù)TNF-α信號是腔內(nèi)的。然而，在24小時培養(yǎng)后，幾乎所有TNF-α信號都出現(xiàn)在遷移體膜上，表明含有TNF-α的分泌囊泡與遷移體膜融合。為了更深入地了解遷移體持續(xù)釋放細胞因子的生化機制，研究者通過過濾從等量血清中分離遷移體和可溶性細胞因子，并比較有無24小時培養(yǎng)的樣本。在未培養(yǎng)的遷移體分數(shù)（M）中，TNF-α以加工和未加工形式存在。在24小時培養(yǎng)后，研究者注意到無論其形式如何，TNF-α水平顯著降低。同樣，遷移體分數(shù)中IL-6的量在培養(yǎng)后顯著減少。相反，可溶性TNF-α和IL-6（S分數(shù)）的水平在培養(yǎng)后增加，表明這些細胞因子從遷移體中釋放。當培養(yǎng)反應用BAPTA-AM處理時，TNF-α和IL-6的釋放被抑制，支持細胞因子釋放是通過SNARE依賴性融合過程促進的觀點。研究者發(fā)現(xiàn)分離的遷移體可以包含TNF-α和IL-6，這意味著在分離后，遷移體可能作為信號配體的囊泡載體。為了確定遷移體包裝的細胞因子是否具有功能，研究者研究了遷移體是否可以傳遞TNF-α信號。利用TNF-α和caspase 8抑制劑zVAD的組合可以在L929細胞中誘導壞死的知識，研究者發(fā)現(xiàn)將分離的單核細胞來源遷移體和zVAD引入L929細胞可以有效地導致細胞死亡。鑒于TNF-α和TACE都存在于遷移體上，研究者接下來檢查了遷移體結(jié)合的TNF-α是否可以被TACE切割以產(chǎn)生可溶性TNF-α。研究者觀察到TNF-α確實可以從遷移體上被切割下來，并且這種切割和遷移體介導的細胞殺傷可以通過添加TACE抑制劑部分抑制。因此，細胞毒性效應似乎是從遷移體釋放的裂解的自由TNF-α和遷移體相關TNF-α的綜合結(jié)果。這些結(jié)果表明遷移體可能使細胞因子在血液中持續(xù)釋放的機制。

遷移體富含粘附分子，如整合素。內(nèi)皮細胞在炎癥期間經(jīng)歷“內(nèi)皮激活”，這一過程以粘附分子的上調(diào)為特征。研究者推測循環(huán)遷移體可能選擇性地粘附到正在經(jīng)歷局部炎癥的血管系統(tǒng)區(qū)域。

為研究遷移體包裝的細胞因子的潛在生理作用，研究者使用局部炎癥檢測。用小劑量LPS注射小鼠肝臟，接下來從血液中純化CCR2陽性遷移體，用抗CCR2抗體染色，然后注入尾靜脈。研究者觀察到外源性注入的CCR2陽性遷移體迅速在LPS注射部位積累，導致CCR2信號的積累（圖4a）。相比之下，局部PBS注射并未導致外源性遷移體積累。

為了確定在血液中循環(huán)的內(nèi)源性單核細胞來源遷移體是否也靶向炎癥部位，腹腔注射LPS以提高循環(huán)中的單核細胞水平。LPS注射后2小時，研究者注入抗CCR2和抗TNF-α抗體以標記單核細胞來源遷移體。觀察到CCR2和TNF-α陽性遷移體迅速在LPS注射部位積累，但在PBS注射部位沒有積累，表明循環(huán)中的單核細胞來源遷移體可以迅速靶向炎癥部位（圖4b）。相比之下，在T9 KO小鼠中，LPS注射部位的CCR2和TNF-α信號的積累顯著減少，進一步證實了遷移體對于局部炎癥部位的細胞因子靶向遞送是必需的（圖4c）。總之，研究者的數(shù)據(jù)指向了一種以前未被識別的細胞因子遞送機制。這一機制確保了各種細胞因子通過遷移體快速運輸?shù)骄植垦装Y部位，并且這些遷移體隨后作為細胞因子的持續(xù)局部來源。研究者的發(fā)現(xiàn)為炎癥反應期間細胞因子靶向的復雜機制提供了新的見解（圖4d）。

這篇文章揭示了單核細胞在LPS刺激下釋放富含炎癥細胞因子（如TNF-α和IL-6）的遷移體，這些遷移體在循環(huán)中作為細胞因子的主要載體。研究發(fā)現(xiàn)，遷移體是單核細胞分泌細胞因子的主要途徑，且Tspan9基因敲除小鼠的單核細胞遷移體形成受損，導致血液中總細胞因子水平顯著降低。此外，遷移體能夠在分離后持續(xù)釋放細胞因子，并且在局部炎癥發(fā)生時，循環(huán)中的單核細胞衍生遷移體能迅速靶向炎癥部位，為細胞因子的局部遞送提供了新機制，對理解免疫反應調(diào)節(jié)具有重要意義。

細胞培養(yǎng)與激活、細胞轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡和長時間延時成像技術、活體成像、掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）、遷移體分離、EVs分離、多光譜成像流式細胞術、總膜蛋白分離、western blot。

Jiao H, Li X, Li Y, et al. Packaged release and targeted delivery of cytokines by migrasomes in circulation. Cell Discov. 2024;10(1):121. Published 2024 Dec 9. doi:10.1038/s41421-024-00749-x