肝癌轉(zhuǎn)移新機(jī)制:基質(zhì)硬度調(diào)控的外泌體miRNA觸發(fā)肺部“富糖前轉(zhuǎn)移生態(tài)位”

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2025-03-14
研究結(jié)果表明,由基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體miRNA觸發(fā)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的新特征葡萄糖富集對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的定植和存活以及隨后的轉(zhuǎn)移灶生長至關(guān)重要......

在肝細(xì)胞癌(HCC)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中,除了經(jīng)典特征外,是否還存在其他新的病理特征尚不清楚。我們之前的研究強(qiáng)調(diào)了基質(zhì)硬度增加對(duì)肝細(xì)胞癌肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成和轉(zhuǎn)移的貢獻(xiàn)。然而,基質(zhì)剛性增加是否影響糖代謝和肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的供應(yīng)仍不清楚。在這里,我們揭示了基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)外泌體miRNA作為主要貢獻(xiàn)者在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中通過減少肺成纖維細(xì)胞的葡萄糖攝取和消耗以及增加血管生成和血管通透性來調(diào)節(jié)葡萄糖富集的潛在機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明,由基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體miRNA觸發(fā)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的新特征葡萄糖富集對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的定植和存活以及隨后的轉(zhuǎn)移灶生長至關(guān)重要。該文章于20252月發(fā)表在Nature Communication》,IF14.1。

技術(shù)路線:
主要研究結(jié)果:
1.在高剛性基質(zhì)上培養(yǎng)肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基會(huì)加速肺部前轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成

參考本研究課題組先前報(bào)道的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動(dòng)物模型的誘導(dǎo)方法,我們開發(fā)了另一種無瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位模型,以評(píng)估高剛度刺激下HCC細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的貢獻(xiàn)。如圖1a的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)示意圖所示,我們分別從生長在6 kPa16 kPa底物上的Hepa1-6細(xì)胞(命名為L-CMH-CM)中收集條件培養(yǎng)基(CM),每隔一天通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)(C57BL/6),誘導(dǎo)具有肺轉(zhuǎn)移前壁龕的無瘤小鼠模型。注射的L-CMH-CM分別代表正常肝臟和肝硬化背景的HCC腫瘤釋放的可溶性因子??紤]到BMDCs募集是肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位最突出的特征之一,我們通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)新鮮肺組織中CD11b+CD45+ BMDCs的募集水平。隨著誘導(dǎo)天數(shù)的延長,L-CM組和H-CMCD11b+CD45+ BMDCs的數(shù)量均增加。同時(shí),與L-CM組相比,H-CM組在第18、2226CD11b+CD45+ BMDCs的募集水平均有所增強(qiáng),其中第26BMDCs募集差異最大(圖1bc)。以上結(jié)果提示,H-CM可能對(duì)HCC肺轉(zhuǎn)移前小環(huán)境的形成具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)能力。此外,它們使我們能夠初步確定第26天的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)作為成功形成具有肺轉(zhuǎn)移前壁龕的無腫瘤小鼠模型的日子。我們進(jìn)一步分析了這些動(dòng)物模型第26天新鮮肺組織中轉(zhuǎn)移前生態(tài)位相關(guān)基因(Fn、Mmp9、S100a8S100a9、Bv8)的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)H-CM組轉(zhuǎn)移前生態(tài)位相關(guān)基因的表達(dá)水平均顯著高于L-CM組(圖1d),這與H-CMBMDCs募集結(jié)果一致。同樣,我們也觀察到纖維連接蛋白(FN)的表達(dá)(圖1e)和髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的比例(圖1f)明顯增加,以及H-CM組中效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞比例的顯著降低(圖1g),證實(shí)H-CM確實(shí)促進(jìn)了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。此外,我們還在第26天檢測(cè)了肺組織血管密度和通透性的分子標(biāo)記,結(jié)果顯示,H-CMCD31表達(dá)明顯增加,但CD31+區(qū)域VE-cadherin覆蓋率明顯降低(圖1h,i),說明H-CM具有更強(qiáng)的促進(jìn)血管生成和破壞血管完整性的能力?;趦山M在BMDCs募集、基質(zhì)重塑(FNMMP9)、免疫抑制(MDSCsCD8+ T細(xì)胞)、血管生成和血管滲透(BV8、CD31VE-cadherin)以及炎癥(S100A8S100A9)方面的顯著差異,我們得出結(jié)論,與L-CM相比,H-CM顯著加速了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。

除了上述體內(nèi)研究結(jié)果外,我們隨后在體外構(gòu)建了一種反映病理狀態(tài)下肺組織硬度的凝膠底物(926.18 Pa,肺硬度底物)來培養(yǎng)常駐細(xì)胞,然后使用H-CM對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),以模擬體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位環(huán)境。我們將6 kPa16 kPa硬度底物培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞的L-CMH-CM分別用于肺硬度底物培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與L-CM干預(yù)相比,H-CM干預(yù)顯著上調(diào)肺成纖維細(xì)胞中FNMMP9的蛋白水平(圖1j),與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖1d)。同時(shí),我們觀察到H-CM處理后肺成纖維細(xì)胞單層表面貼壁的HCC細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖1k)。這些結(jié)果有力地支持了H-CM通過影響肺成纖維細(xì)胞和創(chuàng)造適合腫瘤細(xì)胞粘附的土壤在肺基質(zhì)重塑中的突出作用。另一方面,我們還評(píng)估了H-CM對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中VEGFR2、ZO-1VE-cadherin表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,H-CM顯著提高了VEGFR2的表達(dá),抑制了ZO-1VE-cadherin的表達(dá)(圖1l),這表明H-CM具有更強(qiáng)的促進(jìn)血管生成和損傷血管完整性的誘導(dǎo)能力,這與動(dòng)物模型的研究結(jié)果一致(圖1i)。經(jīng)H-CM處理的HUVEC單層也顯示出對(duì)FITC-葡聚糖的血管通透性增加(圖1m),驗(yàn)證了H-CM可以通過培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯增加血管通透性??傊?,體內(nèi)和體外證據(jù)充分表明,HCC細(xì)胞在高剛度刺激下釋放的條件培養(yǎng)基顯著促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。

從高硬度基質(zhì)上生長的HCC細(xì)胞中提取的條件培養(yǎng)基加速了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成
2.葡萄糖富集發(fā)生在H-CM誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位

轉(zhuǎn)移靶器官中的常駐細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等)受到腫瘤衍生的可溶性因子的教育,通常參與重塑循環(huán)腫瘤細(xì)胞定植和存活的有利“土壤”環(huán)境。我們之前的研究也表明,HCC細(xì)胞在高剛度刺激下分泌的LOXL2可以誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞并招募BMDCs,從而促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。葡萄糖作為主要的營養(yǎng)物質(zhì),主要滿足腫瘤細(xì)胞增殖和存活的能量需求,重編程的葡萄糖代謝也被認(rèn)為是癌癥的一個(gè)典型特征。肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位屬于HCC細(xì)胞的異位生存部位。轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的葡萄糖富集可能對(duì)支持播散性腫瘤細(xì)胞的異位定植、存活和生長至關(guān)重要。因此,除了BMDCs募集、基質(zhì)重塑、免疫抑制、炎癥、血管生成和血管通透性等經(jīng)典病理變化外,我們推測(cè)葡萄糖代謝重編程也可能發(fā)生在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成過程中。為了研究高剛度刺激下HCC細(xì)胞釋放的條件培養(yǎng)基是否調(diào)節(jié)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中常駐細(xì)胞的葡萄糖代謝,我們參照肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位環(huán)境構(gòu)建了上述相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),評(píng)估葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和糖酵解酶在常駐間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)變化。結(jié)果表明,H-CM干預(yù)顯著降低了肺成纖維細(xì)胞中GLUT1、PFKPPKM2HK2的表達(dá),但對(duì)SGLT2的表達(dá)影響不大(圖2a),說明肺成纖維細(xì)胞的糖攝取和糖代謝水平均被嚴(yán)重削弱。與此一致的是,2-NBDG攝取和葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)也顯示,經(jīng)H-CM處理的肺成纖維細(xì)胞的葡萄糖攝取和消耗明顯減少(圖2b,c)。隨后,我們進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析,以進(jìn)一步闡明H-CM對(duì)肺成纖維細(xì)胞代謝改變的影響,發(fā)現(xiàn)H-CM干預(yù)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)糖酵解代謝物(包括葡萄糖6-磷酸)含量顯著降低,果糖-6-磷酸、2-磷酸- d -甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸,這些差異代謝物也在中心碳代謝途徑中富集(圖2d)。以上數(shù)據(jù)均支持H-CM干預(yù)有效減弱肺成纖維細(xì)胞的葡萄糖攝取和消耗,從而創(chuàng)造一個(gè)富含葡萄糖的微環(huán)境。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn),我們繼續(xù)檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶在具有肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的無腫瘤小鼠模型新鮮肺組織中的表達(dá)變化。我們的結(jié)果還顯示,除了Slc5a2SGLT2的基因名稱)外,糖酵解酶(Pfkp,PkmHk2)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Slc2a1)的表達(dá)水平在H-CM組均顯著降低(圖2e)。同時(shí),在肺組織水平上,GLUT1的低表達(dá)和糖原含量的增加(圖2f)也支持了H-CM組糖代謝水平的顯著降低和葡萄糖積累的增加。此外,通過培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞,H-CM誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的血管通透性和血管生成得到改善(圖11,m)也表明肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的葡萄糖供應(yīng)和聚集增加。這些數(shù)據(jù)表明,在H-CM誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中存在葡萄糖富集的新特征。

為了確定葡萄糖富集是肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的新特征,闡明其病理意義是必不可少的?;谄咸烟歉患欣谔岣?/span>HCC細(xì)胞粘附能力的結(jié)果(圖2g),并且MDSCs的積累可能部分歸因于MDSC分化的增加(圖1f),我們合理推測(cè),轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的葡萄糖富集可能會(huì)影響粘附分子的表達(dá),從而促進(jìn)HCC細(xì)胞的粘附,或者增強(qiáng)周圍的免疫抑制強(qiáng)度,從而促進(jìn)其生存和轉(zhuǎn)移。我們重點(diǎn)研究了一種粘附分子,整合素β1,它可以結(jié)合基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的纖維連接蛋白,并探討了高糖上調(diào)整合素β1表達(dá)的潛在機(jī)制。AMPK是細(xì)胞能量傳感器的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,據(jù)報(bào)道,在癌細(xì)胞、成肌細(xì)胞和足細(xì)胞中,AMPK受到高葡萄糖的負(fù)調(diào)控。為了進(jìn)一步確定高糖誘導(dǎo)的整合素β1上調(diào)是否參與了HCC細(xì)胞對(duì)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的粘附,我們使用AMPK激動(dòng)劑(A-769662)或整合素β1功能阻斷抗體(整合素β1 Ab)治療HCC細(xì)胞,觀察其粘附變化。結(jié)果顯示,激活AMPK或阻斷整合素β1可明顯抑制肝細(xì)胞在肺成纖維細(xì)胞單層上的粘附(圖2h)。因此,肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中葡萄糖富集可通過調(diào)節(jié)AMPKα/SNX17通路,有效上調(diào)HCC細(xì)胞表面整合素β1水平,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的粘附。除了細(xì)胞粘附特性外,肺轉(zhuǎn)移前壁龕中MDSCs的數(shù)量對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在外源組織中的定植和存活也至關(guān)重要。在具有肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的無腫瘤小鼠模型中,我們驗(yàn)證了H-CM在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中MDSCs積累中的重要作用(圖1f)??紤]到MDSCs的積累可能部分歸因于MDSC分化的增加,我們繼續(xù)澄清葡萄糖富集是否影響MDSCs分化。在IL-6GM-CSF存在下,高糖顯著促進(jìn)骨髓細(xì)胞向MDSCs分化,而糖酵解抑制劑(2-DG)干預(yù)顯著減弱其對(duì)MDSCs分化的影響(圖2i)。在之前的報(bào)道中,mTOR通路的激活可能參與了葡萄糖積累對(duì)MDSCs分化和功能的影響。在這里,我們還觀察到MDSCs在高糖刺激下mTOR磷酸化水平的增加,但2-DG干預(yù)有效地抑制了這種作用(圖2j)??傊?,轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中的葡萄糖富集通過AMPKα/SNX17途徑顯著上調(diào)整合素β1的表達(dá),促進(jìn)HCC細(xì)胞對(duì)生態(tài)位的粘附,也增加了MDSCs的分化,加強(qiáng)了免疫抑制微環(huán)境,從而促進(jìn)了隨后的定植和生存,這表明葡萄糖富集是肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的一個(gè)新特征。

葡萄糖富集發(fā)生在h-cm誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位
3.腫瘤來源的外泌體作為主要貢獻(xiàn)者在H-CM誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中調(diào)節(jié)葡萄糖富集

原發(fā)性腫瘤釋放的可溶性因子通常包含分泌蛋白、細(xì)胞外囊泡(EVs)和其他分子元件。外泌體作為分泌的微泡可以從腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交換。考慮到葡萄糖代謝重編程發(fā)生在細(xì)胞內(nèi),腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可能在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中調(diào)節(jié)葡萄糖富集發(fā)揮主導(dǎo)作用。我們用差示超離心的方法從H-CM制備了無外泌體的H-CMH-CM- exo -free),并通過分析外泌體標(biāo)記包括TSG101CD63、Hsp70ALIX來證實(shí)其質(zhì)量。然后,我們分別利用無H-CM- exoH-CM處理生長在肺堅(jiān)硬底物上的肺成纖維細(xì)胞,結(jié)果表明,無H-CM- exo干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了H-CM干預(yù)對(duì)糖酵解酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響(圖2k),以及葡萄糖攝取和消耗(圖2l,m)。這些數(shù)據(jù)表明,在H-CM誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位期間,外泌體確實(shí)是調(diào)節(jié)葡萄糖富集的主要因素。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證外泌體在H-CM誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中調(diào)控葡萄糖富集的主導(dǎo)作用,我們采用差分超離心法從L-CMH-CM中純化外泌體,分別命名為L-ExoH-Exo。純化的外泌體呈現(xiàn)典型的杯狀結(jié)構(gòu)(圖3a),符合外泌體的典型表型特征。此外,它們的分子標(biāo)記TSG101、CD63Hsp70、ALIX均檢測(cè)到,而陰性分子標(biāo)記Albumin、Cytochrome C均未檢測(cè)到(圖3b),進(jìn)一步證實(shí)純化的外泌體質(zhì)量符合外泌體的特性,可用于下游實(shí)驗(yàn)。我們隨后使用膜綠色熒光探針(DIO)標(biāo)記L-ExoH-Exo來確定受體細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在DIO標(biāo)記的外泌體孵卵后,受體細(xì)胞(肺成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)都有細(xì)胞內(nèi)的綠色斑點(diǎn)(圖3c),表明來自HCC細(xì)胞的L-ExoH-Exo可以成功轉(zhuǎn)移到肺成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中。由于腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體動(dòng)員BMDCs進(jìn)入次要器官部位,觸發(fā)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成,我們利用Millicell懸掛細(xì)胞培養(yǎng)插入物構(gòu)建了模擬轉(zhuǎn)移前生態(tài)位環(huán)境的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)(圖3d),以闡明外泌體在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成中的作用。具體來說,BMCsIL-6GM-CSF存在下在下腔培養(yǎng)48小時(shí),然后與在肺硬度底物上生長的L-Exoh-exo處理的肺成纖維細(xì)胞在上腔共培養(yǎng)48小時(shí)。我們觀察到,與L-Exo干預(yù)相比,H-Exo干預(yù)顯著提高了肺成纖維細(xì)胞中FNMMP9的表達(dá),而與BMCs共培養(yǎng)進(jìn)一步增強(qiáng)了這些作用(圖3d)。同時(shí),當(dāng)BMCsh-exo處理的肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),BMCsMDSCs分化的數(shù)量顯著增加(圖3e)。H-Exo干預(yù)與H-CM干預(yù)在體內(nèi)的結(jié)果基本一致,說明H-ExoH-CM類似,也促進(jìn)了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。使用L-ExoH-Exo處理生長在肺僵硬底物上的肺成纖維細(xì)胞,我們進(jìn)一步檢測(cè)糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)和肺成纖維細(xì)胞的葡萄糖攝取能力,以驗(yàn)證它們?cè)谄咸烟谴x中的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,H-Exo干預(yù)顯著降低了肺成纖維細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT1)和糖酵解酶(PFKPPKM2HK2)的基因和蛋白表達(dá)水平。此外,H-Exo處理也削弱了它們的葡萄糖攝取和消耗能力,與H-CM干預(yù)的結(jié)果一致(圖2a-c),證實(shí)了外泌體在葡萄糖代謝中的調(diào)節(jié)作用。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)H-Exo培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞單層表面粘附的HCC細(xì)胞數(shù)量增加,表明H-Exo通過重塑基質(zhì)和促進(jìn)葡萄糖富集,為CTC的粘附和定植創(chuàng)造了有利的“土壤”環(huán)境。這意味著H-Exo干預(yù)通過改變血管通透性和血管生成,增加了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的葡萄糖供應(yīng)和聚集。

h - cm誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位期間,腫瘤來源的外泌體作為主要貢獻(xiàn)者調(diào)節(jié)葡萄糖富集

為了進(jìn)一步驗(yàn)證H-Exo對(duì)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成,特別是葡萄糖富集的貢獻(xiàn),我們?cè)隗w內(nèi)建立了H-Exo誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位無腫瘤小鼠模型。與圖1a所描述的方法類似,我們每隔一天通過尾靜脈分別向C57BL/6小鼠體內(nèi)注射L-ExoH-Exo,誘導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成(圖3f)。在誘導(dǎo)外泌體的第26天,我們收集新鮮肺組織進(jìn)行后續(xù)分析。與H-CM誘導(dǎo)相同,H-Exo誘導(dǎo)也顯著促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成,包括增加CD11b+CD45+ BMDCs的募集,誘導(dǎo)基質(zhì)重塑,促進(jìn)肺組織血管生成和炎癥(圖3g)。我們從游離的肺組織中分離并收集了間質(zhì)部分液,并檢測(cè)了無細(xì)胞間質(zhì)部分液中的葡萄糖水平。結(jié)果顯示,H-Exo誘導(dǎo)小鼠肺組織間質(zhì)葡萄糖含量高于L-Exo誘導(dǎo)小鼠肺組織間質(zhì)葡萄糖含量(圖3h),表明H-Exo誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前壁龕中形成了葡萄糖富集。此外,對(duì)外泌體標(biāo)志物TSG101、成纖維細(xì)胞標(biāo)志物S100A4FSP-1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的多重免疫熒光分析顯示,h-exo誘導(dǎo)組肺成纖維細(xì)胞接受外泌體,其外泌體集中區(qū)域的葡萄糖攝?。?/span>GLUT1表達(dá))明顯降低。此外,H-Exo誘導(dǎo)還通過抑制cd31陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞中VE-cadherin的表達(dá)來增加血管通透性(圖3i),這表明H-Exo增加了葡萄糖供應(yīng)和聚集。我們繼續(xù)將Hepa1-6-Luc細(xì)胞靜脈注射到已建立的動(dòng)物模型體內(nèi)(圖3f),發(fā)現(xiàn)h-exo誘導(dǎo)的富糖肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位顯著促進(jìn)了肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的定植和肺轉(zhuǎn)移(圖3j,k),驗(yàn)證了富糖肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的定植和存活以及隨后轉(zhuǎn)移灶生長的促進(jìn)作用??傊?,這些發(fā)現(xiàn)表明外泌體不僅介導(dǎo)基質(zhì)剛度誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成,而且在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中也是導(dǎo)致葡萄糖富集的主要因素。

4.基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體let-7d-5p在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中促進(jìn)葡萄糖富集

由于其對(duì)基因表達(dá)的高調(diào)控作用,外泌體中的miRNA通常被認(rèn)為是細(xì)胞間串?dāng)_的重要介質(zhì)。我們進(jìn)一步確定了基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)外泌體中哪些miRNA在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中促進(jìn)葡萄糖富集。我們進(jìn)行小RNA測(cè)序以篩選MHCC97H-L-ExoMHCC97H-H-Exo之間差異表達(dá)的miRNA。以|FC| > 1.5 FC: fold change)和P < 0.05為閾值,我們共獲得了MHCC97-H-Exo中已知的15個(gè)差異表達(dá)miRNA,包括9個(gè)上調(diào)miRNA6個(gè)下調(diào)miRNA(圖4a),我們采用miRNA qRT-PCR隨機(jī)驗(yàn)證了一些差異miRNAslet-7d-5p,miR-365a-5p,miR-194-5pmiR-125a-5p)的表達(dá),這些miRNAsMHCC97H-H-Exo中均表現(xiàn)出顯著上調(diào)(圖4b),表明測(cè)序結(jié)果的可靠性。而在Hep3B-H-Exo中,除miR-194-5p外,這些miRNA也表現(xiàn)出過表達(dá)(圖4b)。因此,我們分別將9個(gè)上調(diào)的miRNA模擬物轉(zhuǎn)染到肺成纖維細(xì)胞中,以確定不同miRNA對(duì)葡萄糖富集的貢獻(xiàn)。糖酵解相關(guān)基因分析表明,與其他miRNA模擬物相比,let-7d-5p模擬物對(duì)SLC2A1、PFKPPKMHK2的表達(dá)具有最顯著的抑制作用(圖4c),這表明H-Exo中的let-7d-5p可能是調(diào)節(jié)肺成纖維細(xì)胞糖代謝最關(guān)鍵的miRNA。另一方面,我們采用慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)或RNAi技術(shù)構(gòu)建let-7d-5p過表達(dá)或敲低的肺成纖維細(xì)胞,然后將其培養(yǎng)在體外反映肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的肺剛度底物上,分析糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,let-7d-5p過表達(dá)可顯著抑制GLUT1、PFKPHK2的表達(dá),而let-7d-5p敲低可明顯改善其表達(dá)(圖4d)。有趣的是,在let-7d-5p過表達(dá)的肺成纖維細(xì)胞中,我們觀察到PKMmRNA水平上下降(圖4c),但在蛋白質(zhì)水平上變化不大(圖4d)。此外,我們還評(píng)估了let-7d-5p對(duì)葡萄糖攝取的影響,發(fā)現(xiàn)let-7d-5p過表達(dá)明顯降低了肺成纖維細(xì)胞的葡萄糖攝取,而let-7d-5p敲低則提高了肺成纖維細(xì)胞的葡萄糖攝?。▓D4e),驗(yàn)證了let-7d-5p上調(diào)對(duì)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中葡萄糖富集的積極貢獻(xiàn)。

為了證實(shí)外泌體let-7d-5p對(duì)體內(nèi)葡萄糖富集的貢獻(xiàn),我們通過尾靜脈注射let-7d-5p- oe /Exo來建立具有肺轉(zhuǎn)移前壁龕的無腫瘤小鼠模型。與圖1a和圖3f所描述的方法類似,我們每隔一天通過尾靜脈向C57BL/6小鼠體內(nèi)注射let-7d-5p-OE/ExoMock/Exo,誘導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成。在誘導(dǎo)外泌體的第26天,我們觀察到let-7d-5p- oe / exo誘導(dǎo)小鼠新鮮肺組織中CD11b+CD45+ bmdc的比例顯著增加(圖4f),這突出了外泌體let-7d-5p在促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成中的重要作用。此外,我們檢測(cè)了外泌體誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動(dòng)物模型肺成纖維細(xì)胞(CD45-CD31-CD140a+)的糖代謝,發(fā)現(xiàn)與Mock/Exo組相比,let-7d-5p-OE/Exo組肺成纖維細(xì)胞的2-NBDG吸收顯著減少(圖4)。此外,let-7d-5p- oe /Exo給藥明顯抑制了外泌體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動(dòng)物模型肺組織中GLUT1、PFKPHK2的表達(dá)(圖4h),證實(shí)了外泌體let-7d-5p在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中葡萄糖富集的突出作用。

我們繼續(xù)測(cè)量外泌體誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動(dòng)物模型新鮮肺組織中MDSCsCD8+ T細(xì)胞的比例。體外高葡萄糖促進(jìn)MDSCs分化的發(fā)現(xiàn)反映了MDSCs在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的積累部分歸因于葡萄糖富集(圖2i)。因此,葡萄糖富集可能參與強(qiáng)化肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的免疫抑制微環(huán)境。為了明確let-7d-5p-OE/ exo誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動(dòng)物模型對(duì)HCC轉(zhuǎn)移的影響,我們將HCC細(xì)胞靜脈注射到肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動(dòng)物模型中,并在第61天(HCC細(xì)胞注射后35天)檢測(cè)兩組肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況。結(jié)果顯示,let-7d-5p- oe /Exo組肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量和大小顯著增加(圖4i),驗(yàn)證了外泌體let-7d-5p誘導(dǎo)的富含葡萄糖的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位作為有利的微環(huán)境有利于CTC的定植和轉(zhuǎn)移灶的發(fā)展。

基質(zhì)剛度調(diào)整的外泌體let-7d-5p在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中促進(jìn)葡萄糖富集
5.肺成纖維細(xì)胞中基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)外泌體let-7d-5p/HMGA2/E2F1乙?;?/span>/GLUT1PFKPHK2通路參與調(diào)節(jié)葡萄糖富集

為了闡明let-7d-5p調(diào)節(jié)肺成纖維細(xì)胞葡萄糖代謝的分子機(jī)制,我們使用TargetScanmiRWalkmiRTarBase三種公開的生物信息學(xué)工具篩選let-7d-5p的常見候選靶蛋白,獲得154種常見候選蛋白(圖5a)。在這些候選蛋白中,我們基于以下原因確定HMGA2let-7d-5p的靶蛋白:(1HMGA2let-7d-5p靶蛋白的預(yù)測(cè)分析中得分最高。(2TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示HMGA2與肺癌和肝癌組織中糖酵解途徑呈正相關(guān)??紤]到外泌體let-7d-5p進(jìn)入受體細(xì)胞(肺成纖維細(xì)胞)相當(dāng)于受體細(xì)胞中let-7d-5p的上調(diào),我們隨后用慢病毒感染肺成纖維細(xì)胞,以確定let-7d-5p上調(diào)或下調(diào)對(duì)HMGA2表達(dá)的影響。結(jié)果表明,過表達(dá)let-7d-5p可顯著抑制HMGA2的蛋白表達(dá),而敲低let-7d-5p可增加HMGA2的蛋白表達(dá)(圖5b),表明let-7d-5pHMGA2之間存在負(fù)向調(diào)控作用。此外,利用TargetScan Human version 8.0的數(shù)據(jù),我們觀察到在HMGA2 mRNA3'UTR中存在7個(gè)假定的let-7d-5p結(jié)合區(qū),并且所有結(jié)合區(qū)都包含共同序列(圖5c)。隨后,我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定,以明確let-7d-5p是否特異性結(jié)合HMGA2 mRNA3'UTR。圖5c的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,let-7d-5pHMGA2 3utr - wt共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性明顯降低,而HMGA2 3utr -mut組的熒光素酶活性保持不變(圖5c),這表明let-7d-5p特異性結(jié)合HMGA2 mRNA3utr并調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)HMGA2let-7d-5p的靶蛋白。我們將HMGA2- oe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到let-7d-5p過表達(dá)的肺成纖維細(xì)胞中,進(jìn)一步驗(yàn)證let-7d-5p是否通過HMGA2調(diào)節(jié)肺成纖維細(xì)胞的糖代謝。正如預(yù)期的那樣,HMGA2過表達(dá)明顯增加了對(duì)照細(xì)胞中GLUT1、PFKPHK2的表達(dá),也恢復(fù)了這些因let-7d-5p過表達(dá)而被耗盡的蛋白的水平(圖5d)。

HMGA2作為結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)包括E2F1在內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子的活性,HMGA2Rb相互作用增強(qiáng)垂體腺瘤中E2F1的乙?;突钚?。因此,我們猜測(cè)外泌體let-7d-5p可能通過影響HDAC1Rb-E2F1復(fù)合物的分離來調(diào)節(jié)肺成纖維細(xì)胞中E2F1的乙酰化。我們利用免疫沉淀法證實(shí)了HMGA2Rb在肺成纖維細(xì)胞核蛋白中的相互作用(圖5e)。然后,我們從let-7d-5p過表達(dá)或下調(diào)的肺成纖維細(xì)胞中提取核蛋白,以Rb為誘餌蛋白捕獲HMGA2、HDAC1E2F1。圖5f的結(jié)果顯示,在let-7d-5p過表達(dá)的肺成纖維細(xì)胞中,HDAC1Rb的相互作用較多,而在let-7d-5p下調(diào)的細(xì)胞中,HDAC1Rb的相互作用較少。同時(shí),HMGA2能夠與HDAC1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Rb,但對(duì)E2F1Rb的結(jié)合影響不大(圖5f)。除此之外,我們用Rb抗體免疫沉淀核蛋白后,進(jìn)行了定量實(shí)驗(yàn)(ELISA),專門檢測(cè)捕獲蛋白中HDAC1蛋白的水平。我們發(fā)現(xiàn),在具有let-7d-5p-OE的肺成纖維細(xì)胞中,HDAC1Rb相互作用的水平明顯增加,而在具有抗let-7d-5p的肺成纖維細(xì)胞中,HDAC1Rb相互作用的水平顯著降低,這表明HMGA2上調(diào)增加了HDAC1Rb- e2f1復(fù)合物的解離。為了進(jìn)一步證明let-7d-5p是否可以通過HMGA2調(diào)節(jié)E2F1的乙酰化,我們采用免疫沉淀法捕獲let-7d-5p過表達(dá)或下調(diào)的肺成纖維細(xì)胞核蛋白中的E2F1,檢測(cè)E2F1的乙?;健N覀冇^察到,在let-7d-5p過表達(dá)的肺成纖維細(xì)胞中,HDAC1E2F1相互作用較多,E2F1乙?;捷^低(圖5g)。相反,在let-7d-5p下調(diào)的肺成纖維細(xì)胞中,與E2F1相互作用的HDAC1較少,E2F1乙?;黾樱▓D5)。這些數(shù)據(jù)表明,let-7d-5p上調(diào)確實(shí)增加了HDAC1E2F1的結(jié)合,從而減弱了E2F1乙?;健^D(zhuǎn)錄因子通常通過結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子序列來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)53。通過JASPAR數(shù)據(jù)庫分析,我們預(yù)測(cè)E2F1是一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子,可以結(jié)合到三個(gè)糖酵解相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域,包括SLC2A1、PFKPHK2。通過ChIP-qPCR,我們證實(shí)肺成纖維細(xì)胞中SLC2A1、PFKPHK2啟動(dòng)子上E2F1的占用增加(圖5h)。

為了進(jìn)一步闡明E2F1乙酰化在調(diào)節(jié)GLUT1、PFKPHK2表達(dá)中的作用,我們使用HDAC1抑制劑TSA治療let-7d-5p過表達(dá)的肺成纖維細(xì)胞。TSA干預(yù)明顯挽救了let-7d-5p過表達(dá)導(dǎo)致的E2F1乙?;档停▓D5i),并恢復(fù)了靶蛋白GLUT1、PFKPHK2的表達(dá)(圖5i)。我們分別將Flag-E2F1WT- oe質(zhì)粒或Flag-E2F1K117/120/125 R- oe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到let-7d-5p下調(diào)的肺成纖維細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞中,證實(shí)細(xì)胞中E2F1蛋白過表達(dá)(Supplementary Fig. 5g)。隨后的免疫沉淀分析顯示,無論在let-7d-5p下調(diào)組還是對(duì)照組,使用Flag-E2F1K117/120/125 Roe質(zhì)粒的肺成纖維細(xì)胞中,E2F1的乙?;骄@著低于使用Flag-E2F1WT- oe質(zhì)粒的肺成纖維細(xì)胞(圖5j)。更重要的是,K117/120/125 R突變明顯逆轉(zhuǎn)了let-7d-5p敲低引起的靶蛋白(GLUT1、PFKPHK2)上調(diào)(圖5k)。因此,K117K120K125確實(shí)是E2F1的主要乙?;稽c(diǎn),其乙?;接绊懓械鞍椎谋磉_(dá)。綜上所述,上述證據(jù)表明,肺成纖維細(xì)胞中基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體let-7d-5p/HMGA2/E2F1乙?;?/span>/GLUT1PFKPHK2通路參與了葡萄糖富集的調(diào)節(jié)。

肺成纖維細(xì)胞中基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體let-7d-5p/HMGA2/E2F1乙?;?/span>/GLUT1、PFKPHK2通路參與調(diào)節(jié)葡萄糖富集
6.基質(zhì)剛性調(diào)節(jié)外泌體miR-365a-5p有效調(diào)節(jié)血管生成和血管通透性,從而影響肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中的葡萄糖富集

除了肺成纖維細(xì)胞葡萄糖消耗減少對(duì)葡萄糖富集的貢獻(xiàn)外,血管生成和血管通透性作為轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的關(guān)鍵特征,也通過增加葡萄糖供應(yīng)來影響葡萄糖富集?;谏鲜鲨b定的差異miRNA,我們繼續(xù)確定基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)外泌體中哪些miRNA在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中有效控制血管生成和血管通透性。我們分別將9種上調(diào)的miRNA模擬物轉(zhuǎn)染到HUVECs中,分析了不同miRNA對(duì)血管生成和血管通透性的貢獻(xiàn)。只有miR-365a-5p明顯抑制HUVECsTJP1ZO-1的基因名稱)和CDH5VE-cadherin的基因名稱)的表達(dá)(圖6a)。此外,miR-365a-5p mimic顯著降低了ZO-1VE-cadherin的蛋白水平,但升高了VEGFR2的蛋白水平,而miR-365a-5p inhibitor則表現(xiàn)出相反的效果(圖6b)。我們進(jìn)一步分析了miR-365a-5p是否會(huì)破壞內(nèi)皮屏障的完整性,促進(jìn)癌細(xì)胞外滲(圖6c),發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)miR-365a-5pHUVEC單層對(duì)fitc -葡聚糖和MHCC97H-GFP細(xì)胞的滲透性更強(qiáng)(圖6d,e)。相反,在HUVEC中敲低miR-365-5p會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮滲漏明顯減少(圖6d,e)。為了闡明miR-365a-5p在血管生成中的作用,我們進(jìn)行了體內(nèi)絨毛膜尿囊膜(CAM)測(cè)定和體外試管形成測(cè)定。miR-365-1-5p(小鼠miR-365-1-5p序列與人類miR-365a-5p相同)在Hepa1-6細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá),并收集其條件培養(yǎng)基進(jìn)行CAM檢測(cè)。與Hepa1-6-Mock/CM處理的對(duì)照組相比,Hepa1-6-miR-365-1-5p-OE/CM處理的CAM血管數(shù)量顯著增加(圖6f)。在體外成管實(shí)驗(yàn)中,HUVECsmiR-365a-5p的異位表達(dá)也增加了管的數(shù)量,而miR-365a-5p的敲低則減少了管的數(shù)量(圖6g)。這些結(jié)果驗(yàn)證了來自HCC細(xì)胞的miR-365a-5pmiR-365-1-5p)足以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)血管通透性和血管生成。

隨后,進(jìn)行體內(nèi)fitc -葡聚糖通透性測(cè)定,以評(píng)估外泌體miR-365a-5p對(duì)血管通透性的影響。每隔一天通過尾靜脈注射外泌體,持續(xù)26。與PBSMock/Exo組相比,miR-365-1-5p- oe /Exo組中的FITC‐葡聚糖更容易從肺血管外滲(圖6hi),這意味著外泌體miR-365-1-5p可以通過培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞來破壞肺血管完整性。同時(shí),miR-365-1-5p- oe /Exo組肺組織中CD31表達(dá)增強(qiáng)(圖6j,k)。上述結(jié)果表明,外泌體miR-365a-5pmiR-365-1-5p)有助于肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的血管生成和血管通透性。

基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體miR-365a-5p有效調(diào)節(jié)血管生成和血管通透性,從而影響肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中的葡萄糖富集
7.外泌體miR-365a-5p通過滅活TRPC4AP/Ca2+/CaMKII/ERK5/KLF2/4途徑增加血管生成和血管通透性

使用三種公開可用的生物信息學(xué)工具(TargetScan、miRWalkmiRTarBase),我們獲得了miR-365a-5p97個(gè)常見靶蛋白(圖7a)。在這些候選靶蛋白中,我們選擇TRPC4AP作為miR-365a-5p的靶蛋白,是因?yàn)殁}內(nèi)流對(duì)血管功能的影響很大,而且在TCGA分析中,TRPC4APTJP1ZO-1的基因名稱)或CDH5VE-cadherin的基因名稱)呈正相關(guān)如圖7b所示,miR-365a-5p模擬物顯著下調(diào)TRPC4AP的表達(dá),而miR-365a-5p抑制劑在HUVECs中顯著上調(diào)TRPC4AP的表達(dá),表明miR-365a-5p與其靶蛋白TRPC4AP之間存在負(fù)調(diào)控作用。此外,熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示,在TRPC4AP 3utr - wtmiR-365a-5p mimic共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,熒光素酶活性顯著降低,但在TRPC4AP 3utr -mutmiR-365a-5p mimic共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,熒光素酶活性保持不變(圖7c),進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-365a-5p對(duì)TRPC4AP表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)作用。TRPC4AP是一種鈣離子通道相關(guān)蛋白,可與TRPC4相互作用,增強(qiáng)儲(chǔ)存操作的Ca2+進(jìn)入并增加細(xì)胞內(nèi)鈣。為了揭示miR-365a-5p是否調(diào)節(jié)trpc4ap誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流,我們使用Ca2+敏感染料Fluo-4 AM檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-365a-5p模擬物或抑制劑的HUVECs中的Ca2+內(nèi)流。我們發(fā)現(xiàn)miR-365a-5p模擬物顯著降低了HUVECs細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度,而miR-365a-5p抑制劑明顯提高了熒光強(qiáng)度(圖7d),這表明miR-365a-5p可以抑制TRPC4AP的表達(dá),減少HUVECs中的鈣內(nèi)流。

隨著細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加,CaMKII(一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶)經(jīng)常被激活磷酸化下游分子,如MAPK、AMPK、AKTSRC。在一份報(bào)告中,抑制CaMKII可以通過MEKK3/MEK5/ERK5信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)piezo1誘導(dǎo)的原發(fā)性HUVECsKLF2/4的表達(dá)。KLF2通常通過抑制VEGFR2的表達(dá)負(fù)向調(diào)節(jié)血管生成,而KLF4則通過激活ZO-1VE-cadherin表達(dá)參與維持血管完整性。因此,我們推測(cè)miR-365a-5p通過抑制CaMKII/ERK5通路逆轉(zhuǎn)trpc4ap激活的KLF2/4表達(dá)。我們檢測(cè)了CaMKII/ERK5/KLF2/4在具有miR-365a-5p模擬物或抑制劑的HUVECs中的激活狀態(tài),發(fā)現(xiàn)miR-365a-5p模擬物顯著抑制CaMKIIERK5的磷酸化水平以及KLF2KLF4的表達(dá)水平(圖7e)。相反,miR-365a-5p抑制劑明顯逆轉(zhuǎn)了上述變化(圖7e),表明miR-365a-5p確實(shí)通過抑制TRPC4AP來破壞CaMKII/ERK5/KLF2/4的激活。接下來,我們將TRPC4AP- oe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到具有miR-365a-5p模擬物的HUVECs中,并進(jìn)一步確定miR-365a-5p是否通過滅活TRPC4AP/Ca2+/CaMKII/ERK5/KLF2/4途徑增加血管生成和血管通透性。如圖7f所示,miR-365a-5p mimic顯著增加了VEGFR2的表達(dá),降低了ZO-1VE-cadherin的表達(dá),而TRPC4AP上調(diào)阻止了miR-365a-5pCaMKII/ERK5/KLF2/4通路中的失活作用(圖7f)。值得注意的是,KLF4沉默減弱了miR-365a-5p抑制劑對(duì)ZO-1VE-cadherin表達(dá)的促進(jìn)作用(圖7g),KLF2沉默逆轉(zhuǎn)了miR-365a-5p抑制劑對(duì)VEGFR2表達(dá)的抑制作用(圖7h)。總的來說,外泌體miR-365a-5p抑制TRPC4AP表達(dá),使CaMKII/ERK5/KLF2/4信號(hào)失活,從而促進(jìn)血管生成和血管通透性。

外泌體miR-365a-5p通過滅活TRPC4AP/Ca2+/CaMKII/ERK5/KLF2/4途徑增加血管生成和血管通透性
8. HCC組織中COL1high/LOXhighlet-7d-5p、miR-365a-5p的關(guān)系及其臨床意義

基質(zhì)硬化主要是由于I型膠原(COL1)等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過度沉積和交聯(lián)所致。賴基氧氧化酶(LOX)能有效提高細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的交聯(lián)水平。因此,COL1LOX的表達(dá)水平常被用來指示肝基質(zhì)僵硬程度。以腫瘤組織中COL1LOX的中位數(shù)表達(dá)為閾值,將HCC患者分為兩組:COL1low/LOXlow組(低剛度組,24例)和COL1high/LOX high組(高剛度組,24例)。我們通過FISH檢測(cè)肝癌組織中let-7d-5pmiR-365a-5p的表達(dá),發(fā)現(xiàn)COL1high/LOX high組中let-7d-5pmiR-365a-5p的表達(dá)水平均明顯高于COL1low/LOX low組(圖8a,b),表明基質(zhì)硬度與let-7d-5pmiR-365a-5p表達(dá)呈正相關(guān)(圖8a,b)。接下來,我們分析COL1/LOX表達(dá)與臨床病理指標(biāo)如腫瘤大小、結(jié)果發(fā)現(xiàn),COL1high/LOX highHCC組織中let-7d-5pmiR-365a-5p水平較高,腫瘤分化程度較差,COL1high/LOX highHCC患者腫瘤復(fù)發(fā)率較高。生存分析顯示,COL1high/LOX highHCC患者的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)較差(圖8c)。根據(jù)let-7d-5pmiR-365a-5p的中位表達(dá)水平,我們進(jìn)一步將HCC患者分為let-7d-5p low/miR-365a-5p low組(16例)和let-7d-5p high/miR-365a-5p high組(16例)。我們發(fā)現(xiàn)let-7d-5p high/miR-365a-5p highHCC患者在生存分析中有不利的OSDFS(圖8d)。在TCGA肝癌患者隊(duì)列中,我們還發(fā)現(xiàn)let-7d- high/ miR-365a- high表明不利的OSDFS。因此,這些數(shù)據(jù)表明,HCC組織中高基質(zhì)剛度與let-7d-5pmiR-365a-5p表達(dá)增加密切相關(guān),與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。高基質(zhì)剛度和高表達(dá)let-7d-5p/ miR-365a-5p能更好地預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后不良及腫瘤復(fù)發(fā)。

8 HCC組織中COL1high/LOXhighlet-7d-5pmiR-365a-5p的關(guān)聯(lián)及其臨床意義
結(jié)論

總之,本研究提出,葡萄糖富集是由基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體miRNA引發(fā)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的新特征,對(duì)于HCC細(xì)胞的定植和存活以及轉(zhuǎn)移灶的形成至關(guān)重要。據(jù)我們所知,這是第一篇探討基質(zhì)硬度對(duì)HCC中葡萄糖富集的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的影響及其相關(guān)機(jī)制的報(bào)道。本研究結(jié)果將豐富和更新腫瘤轉(zhuǎn)移前生態(tài)位理論,為今后腫瘤轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的干預(yù)提供新的方向。

實(shí)驗(yàn)方法:

小RNA測(cè)序、熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定、ChIP-qPCR、TargetScan、miRWalk和miRTarBase分析、TCGA數(shù)據(jù)庫分析、代謝組學(xué)、慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)或RNAi技術(shù)、qRT-PCR、miRNA qRT-PCR、Western blot、雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)、ELISA、細(xì)胞培養(yǎng)、共培養(yǎng)、細(xì)胞死亡檢測(cè)、葡萄糖攝取和消耗試驗(yàn)、細(xì)胞粘附試驗(yàn)、跨內(nèi)皮浸潤試驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)分析、雞胚絨毛膜尿囊膜、試管形成試驗(yàn)、小鼠實(shí)驗(yàn)、肺組織解離和單細(xì)胞懸液分離、外泌體分離、鑒定和跟蹤、葡萄糖、抑制劑、激動(dòng)劑和功能阻斷抗體的干預(yù)、骨髓細(xì)胞(BMCs)的分離和分化、FITC-葡聚糖漏性試驗(yàn)、蘇木精-伊紅(HE)和周期性酸-希夫(PAS)染色、免疫熒光共聚焦成像、病理切片、免疫組化分析

參考文獻(xiàn):

Zhao, Y., Yu, H., Li, J., Qian, J., Li, M., Zhang, X., Wang, M., Wang, Y., Dong, Y., You, Y., Zhou, Q., Gao, D., Zhao, Y., Liu, B., Chen, R., Ren, Z., Wang, Z., Zhang, K., & Cui, J. (2025). A glucose-enriched lung pre-metastatic niche triggered by matrix stiffness-tuned exosomal miRNAs in hepatocellular carcinoma. Nature communications, 16(1), 1736. https://doi.org/10.1038/s41467-025-56878-