組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L 引發(fā)骨生態(tài)位中巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和代謝重編程

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2025-07-03
組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L在男性前列腺癌患者中存在基因擴(kuò)增現(xiàn)象,并且是骨轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵調(diào)控因子。ASH1L通過重塑組蛋白甲基化修飾......


   骨轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因,然而驅(qū)動這一過程的表觀遺傳學(xué)決定因素仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn),組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L在男性前列腺癌患者中存在基因擴(kuò)增現(xiàn)象,并且是骨轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵調(diào)控因子。ASH1L通過重塑組蛋白甲基化修飾,與HIF-1α協(xié)同作用誘導(dǎo)侵襲性癌細(xì)胞形成促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組,導(dǎo)致單核細(xì)胞分化為脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞(LA-TAM),并增強(qiáng)這些細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中的促腫瘤表型。我們鑒定出IGF-2作為ASH1L/HIF-1α的直接靶標(biāo),通過重編程氧化磷酸化過程介導(dǎo)LA-TAM的分化與表型改變。在臨床前模型中,藥物抑制ASH1L-HIF-1α-巨噬細(xì)胞軸可引發(fā)顯著的抗轉(zhuǎn)移反應(yīng)。本研究揭示了癌細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)改變通過重編程代謝機(jī)制調(diào)控髓系細(xì)胞特征,從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移灶生長的分子機(jī)制,確立了ASH1L作為表觀遺傳驅(qū)動因子在骨微環(huán)境中啟動轉(zhuǎn)移和巨噬細(xì)胞可塑性的關(guān)鍵作用,為轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤提供了可靠的治療靶點。該研究于2025年5月發(fā)表在《Nature Communications》,IF:15.7。

技術(shù)路線:

 


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主要研究結(jié)果:

1.ASH1L在轉(zhuǎn)移性癌癥中存在基因擴(kuò)增及過表達(dá)現(xiàn)象

   通過對人類癌癥的薈萃分析,我們發(fā)現(xiàn)ASH1L基因的擴(kuò)增及增益現(xiàn)象在>40%的轉(zhuǎn)移性前列腺癌(PCa)中出現(xiàn),其頻率顯著高于局限性腫瘤(圖1a)。高水平的ASH1L mRNA與基因擴(kuò)增狀態(tài)相關(guān),且與轉(zhuǎn)移性疾病密切相關(guān)(附圖1a, b)。此外,ASH1L基因擴(kuò)增與轉(zhuǎn)移性PCa患者較差的總生存期相關(guān)(附圖1c),而ASH1L mRNA高表達(dá)的人前列腺腫瘤組織呈現(xiàn)富集的癌癥轉(zhuǎn)移特征譜(附圖1d)。對人PCa腫瘤組織的免疫組化(IHC)分析顯示,ASH1L蛋白水平與癌癥進(jìn)展及侵襲性呈正相關(guān)(圖1b及附圖1e)。在人PCa細(xì)胞系中,源自PC-3的轉(zhuǎn)移性變異株P(guān)C-3M表現(xiàn)出ASH1L表達(dá)上調(diào)(附圖1f)。我們前期研究建立的PB-Cre驅(qū)動Pten/Smad4/Trp53聯(lián)合缺失(PbPPS)轉(zhuǎn)基因小鼠模型26,27,可發(fā)展為伴有淋巴結(jié)、肺和肝轉(zhuǎn)移的侵襲性前列腺腺癌(附圖1g)。研究發(fā)現(xiàn)雄性PbPPS小鼠的侵襲性癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)移瘤中ASH1L高表達(dá)(圖1c及附圖1h)。除PCa外,其他惡性腫瘤中也普遍存在ASH1L基因擴(kuò)增(附圖1i)。具有高轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌和黑色素瘤細(xì)胞相較親本細(xì)胞同樣呈現(xiàn)ASH1L表達(dá)升高(附圖1j)。綜上,通過人類樣本、轉(zhuǎn)基因模型及癌細(xì)胞系的系統(tǒng)研究,我們證實組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L在轉(zhuǎn)移性PCa及其他惡性腫瘤中存在基因擴(kuò)增和過表達(dá)特征。

   我們隨后利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除PC-3M細(xì)胞中的ASH1L基因(圖1d),發(fā)現(xiàn)ASH1L缺失對細(xì)胞增殖或腫瘤生長僅產(chǎn)生適度影響(附圖2a, b),但顯著降低PC-3M細(xì)胞的遷移能力(附圖2c)。通過二維和三維侵襲實驗證實,ASH1L缺失能明顯抑制PCa細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲能力——這是轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的關(guān)鍵步驟(圖1e及附圖2d)。在另一轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞系DU145中也觀察到類似現(xiàn)象(附圖2e-g)。

   為評估ASH1L缺失對骨轉(zhuǎn)移的影響(80%晚期PCa患者會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致高致殘率28),我們向裸鼠心內(nèi)注射表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)和熒光素酶的對照組及ASH1L缺失型PC-3M細(xì)胞。生物發(fā)光成像顯示,ASH1L缺失可抑制癌細(xì)胞向脛骨、股骨或下頜骨的轉(zhuǎn)移(圖1f)。值得注意的是,ASH1L缺失顯著延長小鼠的總生存期和無轉(zhuǎn)移生存期(圖1g及附圖2h)。離體熒光成像顯示對照組PC-3M細(xì)胞在小鼠骨骼的轉(zhuǎn)移率為67%(12只中8只),而ASH1L敲除組未檢測到骨轉(zhuǎn)移(附圖2i)。PC-3M細(xì)胞建立的骨轉(zhuǎn)移模型通常會在骨微環(huán)境中形成溶骨性腫瘤29,組織學(xué)分析表明ASH1L缺失能抑制PC-3M細(xì)胞在骨骼的定植、減少破骨細(xì)胞數(shù)量并減輕溶骨性病變(圖1h及附圖2j)。這些體內(nèi)外實驗證實ASH1L對PCa侵襲及骨轉(zhuǎn)移具有決定性作用。

   為鑒于ASH1L基因在轉(zhuǎn)移性疾病中存在擴(kuò)增和過表達(dá)現(xiàn)象,我們進(jìn)一步探究了ASH1L過表達(dá)對PCa細(xì)胞遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響。與其他高分子量組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶類似30,在哺乳動物細(xì)胞中外源表達(dá)全長ASH1L蛋白存在技術(shù)挑戰(zhàn)31,32。為此,我們構(gòu)建了三個分別編碼人ASH1L蛋白1-882(F1)、883-1890(F2)和1891-2969(F3)氨基酸片段的質(zhì)粒(附圖3a, b)。值得注意的是,F(xiàn)3片段包含ASH1L蛋白所有功能域(附圖3a),并能逆轉(zhuǎn)ASH1L缺失型PC-3M細(xì)胞中H3K36me3和H3K4me3的缺失(附圖3c)。此外,在二維和三維培養(yǎng)體系中回補(bǔ)ASH1L-F3片段可部分恢復(fù)ASH1L缺失型PC-3M細(xì)胞的遷移和侵襲能力(附圖3d, e),表明F3片段對維持ASH1L的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性具有必要性和充分性。

   我們將ASH1L-F3導(dǎo)入低轉(zhuǎn)移潛能、低表達(dá)ASH1L的LNCaP細(xì)胞系,證實其能顯著增強(qiáng)H3K36和H3K4位點的組蛋白甲基化活性(圖1i)。雖然ASH1L-F3過表達(dá)不影響細(xì)胞生長,但可顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲,而F1或F2片段對細(xì)胞遷移幾乎無影響(附圖3f-i)。為研究ASH1L過表達(dá)的體內(nèi)效應(yīng),我們將攜帶空載或ASH1L-F3的LNCaP細(xì)胞注射至裸鼠脛骨,每周進(jìn)行生物發(fā)光成像。如圖1j所示,ASH1L-F3過表達(dá)顯著促進(jìn)PCa在骨骼中的轉(zhuǎn)移灶生長。ASH1L-F3組小鼠總生存期較對照組明顯縮短(圖1k)。離體熒光及組織學(xué)分析進(jìn)一步證實,ASH1L-F3過表達(dá)不僅促進(jìn)PCa骨轉(zhuǎn)移灶生長,還伴隨新骨形成(附圖3j-l)。


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圖1.ASH1L在轉(zhuǎn)移性癌癥中存在基因擴(kuò)增及過表達(dá)現(xiàn)象

2.ASH1L通過H3K4和H3K36甲基化誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組

   為探究ASH1L促轉(zhuǎn)移機(jī)制,我們通過RNA測序(RNA-seq)對比分析了對照組與ASH1L缺失型PC-3M細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。差異基因表達(dá)分析顯示,ASH1L缺失導(dǎo)致1378個基因下調(diào)及307個基因上調(diào)(錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR≤0.05,且兩個靶向ASH1L的sgRNA均顯示倍數(shù)變化FC≥2)(圖2a-c、附圖4a,b及補(bǔ)充數(shù)據(jù)1),進(jìn)一步證實ASH1L在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活作用。Ingenuity通路分析(IPA)表明,這些差異表達(dá)基因(DEGs)與EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、整合素信號、血管生成通路及HIF-1α信號等轉(zhuǎn)移相關(guān)通路顯著相關(guān)(圖2b)。

   已有研究表明,ASH1L通過催化H3K36me2/3和維持H3K4me3參與表觀遺傳重編程[16-18,20],這些修飾與轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)[33-35]。在轉(zhuǎn)移性PC-3M細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)ASH1L缺失導(dǎo)致H3K36和H3K4甲基化水平整體降低(圖1d),而過表達(dá)ASH1L則增加這些組蛋白修飾標(biāo)記(圖1i)。為深入解析ASH1L對組蛋白甲基化景觀的影響,我們采用核酸酶靶向切割與釋放測序技術(shù)(CUT&RUN-seq)[36],檢測了ASH1L缺失前后PC-3M細(xì)胞中H3K4me3和H3K36me3的基因組分布。

   根據(jù)ASH1L缺失引起的組蛋白修飾變化,我們將所有蛋白編碼基因分為五個集群(圖2d,e及附圖4c,d):集群1(C1,占全部基因的3%)顯示兩種組蛋白修飾信號均降低;集群2(C2,5.3%)僅H3K4me3減少;集群3(C3,3.8%)僅H3K36me3減少;集群4(C4,2%)包含H3K4和/或H3K36甲基化增加的基因;兩種修飾均無變化的基因歸入集群5(C5,86%)。與預(yù)期一致,H3K4me3在全基因組范圍內(nèi)主要富集于基因啟動子區(qū)(圖2d,e及附圖4c,d)。ASH1L缺失后,1622個基因(C1+C2,8.3%)的H3K4me3信號強(qiáng)度顯著降低(FDR≤0.05;FC≥1.5)(圖2d,e及補(bǔ)充數(shù)據(jù)2)。而H3K36me3信號則分布于基因體區(qū),從轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)開始向轉(zhuǎn)錄終止位點(TES)逐漸增強(qiáng)(圖2d,e及附圖4c,d)。ASH1L缺失使1330個基因(C1+C3,6.8%)基因體區(qū)的H3K36me3信號顯著減弱(FDR≤0.05;FC≥1.5)(圖2d,e及補(bǔ)充數(shù)據(jù)3)。

   通過維恩圖分析發(fā)現(xiàn),下調(diào)的差異表達(dá)基因(DEGs)與H3K4me3或H3K36me3信號減弱顯著相關(guān)。具體而言,46%和35%的下調(diào)DEGs(FDR≤0.05;FC≥1.5)分別呈現(xiàn)H3K4me3和H3K36me3信號降低(重疊p值<1e-300,F(xiàn)isher精確檢驗)(圖2f),提示這些基因(n=1180)很可能是ASH1L在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中的直接靶標(biāo)(補(bǔ)充數(shù)據(jù)4)。熱圖和箱線圖分析顯示,集群1-3中H3K4me3或H3K36me3的減少與mRNA水平下調(diào)強(qiáng)烈相關(guān),其中集群1的基因表達(dá)下降最為顯著(圖2d,g及附圖4e)。值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)移相關(guān)基因是ASH1L的直接靶標(biāo)(補(bǔ)充數(shù)據(jù)4中高亮顯示)。ASH1L缺失后,多數(shù)靶標(biāo)基因表現(xiàn)為兩種修飾信號同時減弱(如PLAU),但部分基因僅顯示H3K4me3(如MMP14)或H3K36me3信號(如VEGFC)的急劇下降(圖2h)。需特別指出的是,這三種組蛋白甲基化模式均與促轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)(圖2h)。

   這些轉(zhuǎn)錄組與表觀遺傳學(xué)研究證實,ASH1L通過重編程H3K4和H3K36位點的組蛋白甲基化,調(diào)控侵襲性癌細(xì)胞中促轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄激活。值得關(guān)注的是,雖然在白血病中ASH1L通過激活HOX家族基因促進(jìn)白血病發(fā)生[20-23],但在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中,ASH1L缺失既不影響HOX基因簇的表達(dá),也不改變其H3K4me3/H3K36me3修飾水平(圖2h),表明ASH1L對靶基因的調(diào)控具有高度選擇性和環(huán)境特異性。


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圖2.ASH1L通過H3K4和H3K36甲基化誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組

3.ASH1L與HIF-1α協(xié)同誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移基因表達(dá)并增強(qiáng)侵襲能力

   作為缺氧信號通路的核心調(diào)控因子,轉(zhuǎn)錄因子HIFs能夠激活介導(dǎo)血管生成、細(xì)胞運動、EMT、細(xì)胞外基質(zhì)降解、侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因表達(dá)[38]。HIFs是由氧敏感亞基(HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α)與組成型表達(dá)亞基HIF-1β構(gòu)成的異源二聚體。通路分析顯示ASH1L與HIF-1α信號通路存在關(guān)聯(lián)(圖2b)?;蚣患治觯℅SEA)進(jìn)一步證實,ASH1L缺失會導(dǎo)致缺氧通路及HIF-1α靶基因顯著下調(diào)(圖3a-d),尤其是參與癌細(xì)胞侵襲(Snail、TGFB和MET)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑(MMPs和PLAU)以及血管生成(VEGFs)的基因。CUT&RUN分析驗證了ASH1L缺失后HIF-1α靶基因上H3K4me3和/或H3K36me3修飾標(biāo)記的顯著減少(圖3d),表明ASH1L通過調(diào)控組蛋白甲基化參與HIF-1α轉(zhuǎn)錄程序。

   通過對PC-3細(xì)胞已發(fā)表的HIF-1α ChIP測序數(shù)據(jù)集(GSE106305)[39]的分析,我們發(fā)現(xiàn)83.2%(1180個中的982個)ASH1L直接靶基因(補(bǔ)充數(shù)據(jù)4)的啟動子區(qū)域存在HIF-1α蛋白結(jié)合,其中包括與癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因(附圖5a及補(bǔ)充數(shù)據(jù)5)。這些結(jié)果表明,HIF-1α是ASH1L調(diào)控前列腺癌促轉(zhuǎn)移基因的重要協(xié)同因子。

   此外,qPCR實驗顯示ASH1L敲除顯著下調(diào)PC-3M細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)HIF-1α靶基因的mRNA水平,而回補(bǔ)ASH1L-F3片段可完全恢復(fù)其表達(dá)(圖3e和附圖5b)。在常氧條件下培養(yǎng)的LNCaP細(xì)胞因蛋白降解活躍而HIF-1α水平較低,但骨轉(zhuǎn)移灶中的低氧環(huán)境能穩(wěn)定HIF-1α蛋白(附圖5c)。為模擬這種缺氧條件,我們用CoCl2處理對照和ASH1L-F3過表達(dá)的LNCaP細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)ASH1L-F3顯著誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移基因表達(dá)(圖3f),這與體外和體內(nèi)觀察到的侵襲表型一致(圖1j,k及附圖3)。相比之下,F(xiàn)2260A突變體誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)錄的活性明顯受損(附圖5d),表明ASH1L的作用依賴其組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

   重要的是,內(nèi)源性免疫共沉淀(co-IP)和無細(xì)胞蛋白下拉實驗證實ASH1L-F3直接與HIF-1α蛋白相互作用(圖3g和附圖5e),強(qiáng)化了ASH1L與HIF-1α在轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞中形成功能復(fù)合體的觀點。通過分析已發(fā)表的人類原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤樣本的批量RNA-seq及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[40,41],我們發(fā)現(xiàn)HIF家族成員中HIF-1α在上皮成分中與ASH1L的共表達(dá)最為顯著(附圖5f-h)。與ASH1L低表達(dá)組相比,高表達(dá)ASH1L的PCa腫瘤上皮成分顯示HIF-1α轉(zhuǎn)錄組水平升高(圖3h和附圖5i)。

   為闡明HIF-1α在ASH1L驅(qū)動的促轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)錄及侵襲中的作用,我們在表達(dá)ASH1L-F3的LNCaP細(xì)胞中使用siRNA或小分子化合物抑制HIF-1α。結(jié)果顯示,與對照細(xì)胞相比,ASH1L-F3過表達(dá)在缺氧條件下引起促轉(zhuǎn)移基因上調(diào),但該效應(yīng)可被HIF1A敲除所消除(圖3i)。同樣,用小分子抑制劑(LW6、2-MeOE2和PX-478)靶向HIF-1α能顯著削弱ASH1L-F3過表達(dá)驅(qū)動的LNCaP細(xì)胞遷移(圖3j),而HIF-2α抑制劑(PT2399)對細(xì)胞遷移影響甚微(附圖5j)。

   我們的機(jī)制研究共同表明,組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L通過與轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α相互作用,激活促轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的侵襲能力。值得注意的是,ASH1L在白血病細(xì)胞中也與HIF-1α共定位于基因啟動子區(qū)(附圖5k,l及補(bǔ)充數(shù)據(jù)5),但僅有32.5%(3482個中的1132個)ASH1L靶基因與HIF-1α共享,且不同于轉(zhuǎn)移性PCa中的靶基因(附圖5k,l及補(bǔ)充數(shù)據(jù)5)。這表明ASH1L/HIF-1α相互作用是基因表達(dá)的普適調(diào)控機(jī)制,但其靶基因可能因細(xì)胞環(huán)境而異。


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圖3.ASH1L與HIF-1α協(xié)同誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移基因表達(dá)并增強(qiáng)侵襲能力

4.在免疫健全環(huán)境中解析ASH1L的功能

   既往研究表明,HIF信號通路在調(diào)控原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的基質(zhì)與免疫組分中起關(guān)鍵作用[38,42,43]。鑒于ASH1L能促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)HIF-1α轉(zhuǎn)錄組,我們提出假說:除了重編程侵襲性癌細(xì)胞的促轉(zhuǎn)移基因外,ASH1L還可能通過細(xì)胞外作用重塑骨微環(huán)境?;谇捌趶腜bPPS轉(zhuǎn)移性前列腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型(附圖1g)中建立的同源PCa細(xì)胞系DX1[44,45],我們通過脛骨內(nèi)注射DX1細(xì)胞至C57BL/6J雄性小鼠構(gòu)建了同種異體移植模型(圖4a),模擬PCa骨轉(zhuǎn)移灶生長。

   接種2-3周后,DX1細(xì)胞在骨組織中形成兼具溶骨/成骨特征的轉(zhuǎn)移灶(圖4b,c及附圖6a),重現(xiàn)了PCa患者的骨轉(zhuǎn)移特征。組織病理學(xué)分析顯示,轉(zhuǎn)移灶中皮質(zhì)骨顯著吸收并伴隨大量編織骨新生,同時破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞明顯富集(圖4c-g及附圖6a)。

   為探究ASH1L在免疫健全環(huán)境中對轉(zhuǎn)移灶生長及骨微環(huán)境的影響,我們通過sgRNA-CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除DX1細(xì)胞中的ASH1L基因(附圖6b),并將表達(dá)熒光素酶的對照組與ASH1L缺失型細(xì)胞注射至C57BL/6J雄性小鼠單側(cè)脛骨(圖4a)?;铙w成像(IVIS)及離體GFP熒光成像顯示,癌細(xì)胞中ASH1L的基因敲除顯著抑制骨內(nèi)腫瘤生長(圖4b及附圖6c)。X射線成像與組織病理學(xué)分析表明,侵襲性癌細(xì)胞中ASH1L的缺失可保護(hù)皮質(zhì)骨免于吸收,并減少新生編織骨形成(圖4c-e及附圖6d)。ASHL1敲除后,骨轉(zhuǎn)移灶中的破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞數(shù)量均減少(圖4c,f,g)。使用shRNA敲低ASH1L也觀察到類似效應(yīng)(附圖6e-k)。結(jié)合異種移植轉(zhuǎn)移模型的發(fā)現(xiàn),這些同源模型實驗結(jié)果確立了ASH1L作為骨轉(zhuǎn)移灶生長的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控因子。


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圖4在免疫健全環(huán)境中解析ASH1L的功能

5.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示ASH1L調(diào)控轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可塑性

   為解析ASH1L對侵襲性癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境的影響,我們對對照組(n=3)和ASH1L缺失組(n=4)同源骨腫瘤進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理與質(zhì)控流程(方法部分),共獲得30,850個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜。聚類分析鑒定出10個主要細(xì)胞群(AC1-AC10,每個群含760-6999個細(xì)胞;附圖6l)。對照組與ASH1L缺失組骨腫瘤細(xì)胞分布于所有10個集群,且每個集群均包含7個樣本的細(xì)胞(附圖6m)。通過整合差異基因表達(dá)分析和已知細(xì)胞譜系標(biāo)志物(附圖6l,n),我們明確了各集群的細(xì)胞身份:成纖維細(xì)胞群AC3高表達(dá)Col1a2,內(nèi)皮細(xì)胞群AC4呈現(xiàn)Pecam1特征,免疫細(xì)胞群AC5-AC10高表達(dá)各譜系標(biāo)志物,重現(xiàn)了人類樣本的免疫景觀。AC1和AC2均顯示管腔上皮細(xì)胞標(biāo)志物Krt8高表達(dá),提示為癌細(xì)胞群,但僅AC1集群顯著高表達(dá)HIF-1α轉(zhuǎn)錄組特征,且該特征在ASH1L缺失腫瘤中明顯減弱(附圖6o),強(qiáng)化了ASH1L在調(diào)控侵襲性癌細(xì)胞HIF-1α轉(zhuǎn)錄組中的關(guān)鍵作用。

  為可視化ASH1L缺失對骨微環(huán)境免疫組分的影響,我們對17,423個免疫細(xì)胞進(jìn)行亞群分析,鑒定出9個主要免疫細(xì)胞亞群(圖4h-l及補(bǔ)充數(shù)據(jù)6):T/NK細(xì)胞(C1:Cd3ehigh/Cd3dhigh/Nkg7high)、B/漿細(xì)胞(C2:Cd79ahigh/Igkchigh)、單核細(xì)胞(C3:Itgam+/F13a1high/Ly6c2high)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM(C4:Itgam+/Csf1rhigh/Cd68high/Mrc1high/Trem2high)、樹突狀細(xì)胞(C5:H2-Aahigh/Tcf4high/Runx3high)、前中性粒細(xì)胞(C6:Itgam+/Mpohigh/Elanehigh)、髓源性抑制細(xì)胞MDSC_1(C7:Itgam+/S100a8high/Cxcr2high/Ly6c2low)和MDSC_2(C8:Itgam+/S100a8high/Ly6c2high/Cxcr2mid)。值得注意的是,ASH1L缺失增加了B細(xì)胞(C2)和單核細(xì)胞(C3)的浸潤,卻顯著減少了TAM(C4)的數(shù)量(圖4j-l),表明ASH1L參與調(diào)控轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中的單核髓系細(xì)胞。

   既往研究顯示,腫瘤浸潤單核細(xì)胞與TAM在微環(huán)境中具有異質(zhì)性,并在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮不同功能[7,8,10,12,46,47]。為明確其亞型特征與活化狀態(tài),并解析ASH1L的影響,我們對對照組和ASH1L缺失組骨腫瘤中的單核細(xì)胞(C3)與TAM(C4)進(jìn)行聚類和差異基因表達(dá)分析,最終鑒定出7個特征性亞群(圖5a,b及補(bǔ)充數(shù)據(jù)7):經(jīng)典單核細(xì)胞(MC1)、非經(jīng)典單核細(xì)胞(MC2)、單核/TAM中間態(tài)細(xì)胞(MC3)、促血管生成TAM(MC4)、脂質(zhì)相關(guān)TAM(MC5)、炎性TAM(MC6)和增殖型TAM(MC7)。對照組與ASH1L缺失組細(xì)胞以不同比例分布于所有7個亞群中(圖5c,d及附圖7a)。

   在這些亞群中,MC1和MC2均為單核細(xì)胞。與MC2相比,MC1在骨微環(huán)境中占主導(dǎo)地位,表達(dá)經(jīng)典單核細(xì)胞標(biāo)志物(如Ly6c2、F13a1、Mgst1和Ccr2);而MC2僅占單核/TAM總數(shù)的1-2%,呈現(xiàn)非經(jīng)典單核細(xì)胞特征基因(如Ace、Adgre、Treml4和Cd36)(圖5a-d)。亞群MC4-MC7雖均表達(dá)巨噬細(xì)胞譜系標(biāo)志物(Csf1r和Cd68),但具有截然不同的轉(zhuǎn)錄組特征與活化狀態(tài)(圖5a,b,e,附圖7b-d及補(bǔ)充數(shù)據(jù)7)。MC4亞群高表達(dá)促血管生成基因(包括Spp1、Vegfa、Arg1和Mif),故命名為促血管生成TAM;MC5細(xì)胞高表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)TAM標(biāo)志物(Apoe、C1qc和Trem2)及促腫瘤標(biāo)志物Mrc1;MC7雖與脂質(zhì)相關(guān)TAM(MC5)共享多數(shù)標(biāo)志物,但呈現(xiàn)高增殖特征(Mki67、Cdk1和Top2a);MC6亞群則富集抗原呈遞分子(H2-aa、H2-ab1和Cd40)、干擾素信號通路(IL1rn、Jak2、Stat1、Irf1和Nfkb1)以及T細(xì)胞招募/活化相關(guān)細(xì)胞因子(Cxcl9和Tnf)。值得注意的是,我們還鑒定出MC3亞群,其同時表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(Csf1r和Cd68)與單核細(xì)胞標(biāo)志物(F13a1和Ly6c2)。軌跡與擬時序分析表明,MC1中的經(jīng)典單核細(xì)胞是其他六個亞群的譜系前體,而MC3細(xì)胞處于單核細(xì)胞向TAM分化的中間狀態(tài)(圖5f)。

   與對照組相比,ASH1L缺失的骨腫瘤中脂質(zhì)相關(guān)TAM(MC5)、增殖型TAM(MC7)和促血管生成TAM(MC4)顯著減少,而單核/TAM中間態(tài)細(xì)胞(MC3)急劇增加,經(jīng)典單核細(xì)胞(MC1)也有輕度增多。差異基因表達(dá)分析顯示,在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中敲除ASH1L后,單核細(xì)胞與TAM中除TAM標(biāo)志物外,眾多促腫瘤/轉(zhuǎn)移基因和免疫抑制分子也顯著下調(diào)(圖5e,g,附圖7b,d及補(bǔ)充數(shù)據(jù)8)。盡管炎性TAM(MC6)比例變化不大(圖5d),但ASH1L缺失后TAM中抗原呈遞、干擾素信號和炎癥相關(guān)基因顯著上調(diào)(圖5e,g,附圖7c及補(bǔ)充數(shù)據(jù)8)。這些結(jié)果表明,侵襲性癌細(xì)胞中的ASH1L促進(jìn)骨微環(huán)境中TAM向脂質(zhì)相關(guān)、促血管生成和抗炎狀態(tài)轉(zhuǎn)化。

   為直觀展示單核細(xì)胞與TAM在骨轉(zhuǎn)移灶中的空間分布,我們采用多重免疫組化技術(shù)對單核細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)y6c、總TAM標(biāo)志物F4/80及促腫瘤TAM標(biāo)志物CD206(由Mrc1基因編碼)進(jìn)行共染色。與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析一致,抑制癌細(xì)胞中ASH1L顯著減少促腫瘤表型TAM(F4/80+CD206+),同時增加骨微環(huán)境中腫瘤浸潤單核細(xì)胞(Ly6c+)(圖5h及附圖7e)。反之,癌細(xì)胞過表達(dá)ASH1L可抑制單核細(xì)胞而促進(jìn)促腫瘤TAM(附圖7f)。為驗證轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞與單核細(xì)胞的直接互作,我們從健康人血液中分離單核細(xì)胞,與ASH1L敲除或未敲除的PC-3M細(xì)胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)(圖5i)。結(jié)果顯示,ASH1L缺失細(xì)胞的條件培養(yǎng)基無法誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)/促血管生成TAM標(biāo)志物,但促進(jìn)其高表達(dá)炎性TAM標(biāo)志物(圖5i)。在人單核細(xì)胞系THP-1中也觀察到類似現(xiàn)象(附圖7g)。

   綜合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析與功能驗證,我們揭示侵襲性癌細(xì)胞中的ASH1L通過促進(jìn)單核細(xì)胞分化為脂質(zhì)相關(guān)和促血管生成TAM,并將其重編程為促腫瘤和抗炎狀態(tài),從而重塑轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境。


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圖5 .單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示ASH1L調(diào)控轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可塑性

 6.ASH1L通過IGF-2介導(dǎo)的氧化磷酸化誘導(dǎo)脂質(zhì)相關(guān)TAM形成

   為闡明ASH1L調(diào)控巨噬細(xì)胞分化與可塑性的分子機(jī)制,我們對TAM亞群(MC4-MC7)的差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析。與對照組相比,ASH1L缺失骨腫瘤中的TAM顯示炎癥通路顯著激活,包括干擾素信號、TNF信號、IL-1/2信號、cGAS-STING通路以及抗原加工呈遞通路(圖6a)。同時,ASH1L缺失導(dǎo)致TAM中細(xì)胞衰老與焦亡通路相關(guān)基因顯著上調(diào),而細(xì)胞周期與有絲分裂相關(guān)基因下調(diào)(圖6a)。這表明侵襲性癌細(xì)胞中的ASH1L通過維持TAM的增殖能力、存活狀態(tài)及抗炎表型發(fā)揮作用。值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中ASH1L的缺失會導(dǎo)致氧化磷酸化(OXPHOS)、三羧酸循環(huán)(TCA)、脂肪酸β氧化(FAO)和ATP合成功能下降(圖6a)。在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤的TAM中,OXPHOS特征基因顯著富集(圖6b),這與既往在原發(fā)灶和其他轉(zhuǎn)移部位的研究一致[48,49]。但本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中ASH1L的缺失會顯著降低脂質(zhì)相關(guān)TAM中OXPHOS相關(guān)基因的表達(dá)(圖6b)。這些結(jié)果表明,ASH1L在重編程轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中巨噬細(xì)胞代謝方面起關(guān)鍵作用,促進(jìn)脂質(zhì)相關(guān)TAM的誘導(dǎo)及其促腫瘤表型形成。

   如圖5i和附圖7g所示,ASH1L缺失的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人單核細(xì)胞向脂質(zhì)相關(guān)/促血管生成TAM分化的能力受損,提示分泌因子介導(dǎo)了ASH1L對TAM的調(diào)控。為鑒定該因子,我們整合RNA-seq和CUT&RUN-seq數(shù)據(jù)集(圖3及補(bǔ)充數(shù)據(jù)1-4),篩選出5個TAM相關(guān)分泌蛋白候選分子——它們均是ASH1L/HIF-1α的共同靶基因,且在ASH1L缺失的PC-3M細(xì)胞中顯著下調(diào)(圖6c)。其中僅胰島素樣生長因子2(IGF-2)與巨噬細(xì)胞代謝相關(guān)[50]。圖6a通路分析也顯示,ASH1L缺失骨腫瘤中的TAM呈現(xiàn)IGF下游信號(如AKT和MAPK通路)減弱,提示IGF信號可能參與ASH1L驅(qū)動的TAM可塑性與代謝重編程。

   IGF家族成員(IGF-1和IGF-2)通過結(jié)合受體在細(xì)胞增殖、存活、蛋白翻譯和代謝中起關(guān)鍵作用[51]。在轉(zhuǎn)移性PC-3M細(xì)胞中,IGF-2啟動子區(qū)富含H3K4me3修飾,但該信號在ASH1L缺失后完全消失(圖6d),而IGF-2基因體區(qū)未檢測到H3K36me3信號,表明ASH1L通過調(diào)控H3K4三甲基化調(diào)節(jié)IGF-2表達(dá)。ASH1L缺失還顯著降低PC-3M細(xì)胞中IGF-2 mRNA水平(圖6d,e),反之ASH1L-F3過表達(dá)可提升LNCaP細(xì)胞IGF-2表達(dá)(圖6f)。相比之下,PC-3M細(xì)胞中IGF-1基因表達(dá)極低,且其啟動子和基因體均無H3K4me3或H3K36me3修飾(圖6d)。ChIP-seq分析顯示HIF-1α直接結(jié)合PC-3細(xì)胞中IGF-2啟動子區(qū)(附圖8a),而siRNA敲低HIF-1α可消除LNCaP細(xì)胞中ASH1L-F3對IGF-2的誘導(dǎo)(附圖8b),證實IGF-2是轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中ASH1L/HIF-1α復(fù)合體的直接靶標(biāo)。

   單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析顯示,轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中ASH1L缺失導(dǎo)致TAM中OXPHOS復(fù)合體I、III、IV和V核心亞基轉(zhuǎn)錄水平下降(圖6g),這些復(fù)合體是催化OXPHOS和ATP合成的關(guān)鍵組分。在ASH1L缺失的PC-3M條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的人單核細(xì)胞中也驗證了這一現(xiàn)象(圖6h及附圖8c)。在自身免疫疾病中,IGF-2可通過增強(qiáng)OXPHOS使成熟巨噬細(xì)胞獲得抗炎表型[50]。使用IGF-2重組蛋白處理人單核細(xì)胞后,我們同樣觀察到AKT-GSK3b-mTOR信號激活、OXPHOS基因上調(diào)及脂質(zhì)相關(guān)TAM標(biāo)志物表達(dá)增加(附圖8d,e)。重要的是,補(bǔ)充IGF-2重組蛋白可基本挽救ASH1L缺失導(dǎo)致的TAM中OXPHOS基因表達(dá)及抗炎/促腫瘤表型缺陷(圖6h及附圖8c)。在轉(zhuǎn)移性PCa患者中,IGF-2表達(dá)也與脂質(zhì)相關(guān)TAM標(biāo)志物及促腫瘤表型標(biāo)志物呈正相關(guān)(附圖8f,g)。這些機(jī)制研究證實,作為轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中ASH1L/HIF-1α復(fù)合體的直接靶標(biāo),IGF-2通過增強(qiáng)OXPHOS介導(dǎo)單核細(xì)胞向脂質(zhì)相關(guān)TAM分化,并維持其促腫瘤和抗炎表型。


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圖6. ASH1L通過IGF-2介導(dǎo)的氧化磷酸化誘導(dǎo)脂質(zhì)相關(guān)TAM形成

 7.抑制ASH1L-HIF-1α-TAM軸可遏制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移

    為驗證TAM是否在ASH1L驅(qū)動的骨轉(zhuǎn)移灶生長中起關(guān)鍵作用,我們開展了體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除實驗(圖7a)。向C57BL/6J雄性小鼠脛骨注射表達(dá)熒光素酶的對照或ASH1L敲低型DX1細(xì)胞后,每周通過腹腔注射CSF1R單抗或IgG對照抗體(300μg/次)清除巨噬細(xì)胞,并進(jìn)行生物發(fā)光成像。與ASH1L缺失表型一致,CSF1R阻斷顯著抑制前列腺癌骨內(nèi)生長(圖7b,c及附圖9a)。值得注意的是,ASH1L抑制僅在巨噬細(xì)胞存在時才能削弱骨腫瘤生長,而巨噬細(xì)胞清除后該效應(yīng)消失(圖7b,c及附圖9a),表明TAM是ASH1L促轉(zhuǎn)移作用的必要條件。免疫熒光染色不僅證實CSF1R阻斷后骨腫瘤中總TAM(F4/80+CD206+與F4/80+CD206-)被清除,還驗證了ASH1L抑制對骨微環(huán)境中促腫瘤TAM(F4/80+CD206+)的削減作用(圖7d及附圖9b)。

    近期研究發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑AS-99可靶向ASH1L并具有抗白血病活性[52]。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)AS-99以劑量依賴性方式降低H3K4和H3K36位點的組蛋白甲基化水平(附圖9c),并削弱體外細(xì)胞遷移能力(附圖9d)。在乳腺癌細(xì)胞中也觀察到類似效應(yīng)(附圖9e)。隨后我們評估了AS-99在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移臨床前模型中的療效:將PC-3M細(xì)胞注射至裸鼠左心室14天后,分別給予溶劑對照和AS-99治療(腹腔注射,25 mg/kg,每周5次,持續(xù)3周)(圖7e)。結(jié)果顯示AS-99治療顯著抑制骨轉(zhuǎn)移并延長小鼠總生存期(圖7e,f)。與對照組相比,AS-99治療的轉(zhuǎn)移瘤中促腫瘤TAM(F4/80+CD206+)數(shù)量減少(圖7g及附圖9f)。這些臨床前研究證實了靶向ASH1L在轉(zhuǎn)移性疾病中的治療潛力。

    鑒于HIF-1α是ASH1L在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中的關(guān)鍵協(xié)同因子,且靶向HIF-1α的藥物已進(jìn)入臨床研究階段[38,53],我們進(jìn)一步評估了HIF-1α抑制劑PX-478在骨轉(zhuǎn)移模型中的療效。通過向C57BL/6J雄性小鼠單側(cè)脛骨注射對照或ASH1L缺失型DX1細(xì)胞后,給予溶劑或PX-478治療(腹腔注射40 mg/kg,每周3次,持續(xù)3周)?;铙w成像(IVIS)與離體熒光成像顯示,ASH1L缺失雖能顯著抑制骨內(nèi)腫瘤生長,但該效應(yīng)可被PX-478治療所抵消(圖7h及附圖9g)。值得注意的是,HIF-1α抑制僅在對照組中表現(xiàn)出抗腫瘤效果,而在ASH1L缺失組無效(圖7h及附圖9g)。多重免疫組化染色進(jìn)一步證實,HIF-1α抑制劑能顯著減少表達(dá)ASH1L的腫瘤中促腫瘤TAM(F4/80+CD206+)的浸潤(圖7i及附圖9h)。這些結(jié)果揭示HIF-1α在ASH1L驅(qū)動的骨轉(zhuǎn)移灶生長及TAM可塑性中起關(guān)鍵作用,提示靶向HIF-1α對轉(zhuǎn)移性PCa患者的治療潛力。

    最后,我們分析了ASH1L與TAM在人類轉(zhuǎn)移性PCa中的相關(guān)性。通過對13例轉(zhuǎn)移性PCa患者的24,433個非上皮細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析[41],鑒定出代表髓系細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的18個亞群(圖7j及附圖10a,b)。研究發(fā)現(xiàn)人類轉(zhuǎn)移性腫瘤中的髓系成分主要為單核細(xì)胞和TAM,且所有三個TAM亞群均高表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)TAM標(biāo)志物(APOE、C1QA和TREM2),并呈現(xiàn)CD206(MRC1)陽性的促腫瘤表型(圖7j及附圖10b,c)。根據(jù)上皮細(xì)胞中ASH1L表達(dá)水平,將13例轉(zhuǎn)移瘤分為ASH1L高表達(dá)組(n=5)和低表達(dá)組(n=8)(附圖10d)。與低表達(dá)組相比,ASH1L高表達(dá)的轉(zhuǎn)移瘤中脂質(zhì)相關(guān)TAM更富集(圖7k,l),同時癌細(xì)胞中HIF-1α轉(zhuǎn)錄組特征也更顯著(附圖10e)。此外,通過CIBERSORT算法對208例轉(zhuǎn)移性PCa患者的批量RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示,存在ASH1L基因增益或擴(kuò)增的轉(zhuǎn)移瘤含有更高比例的TAM(附圖10f)。這些人類樣本研究為ASH1L促進(jìn)轉(zhuǎn)移微環(huán)境中TAM(尤其是脂質(zhì)相關(guān)TAM)的作用提供了關(guān)鍵證據(jù)。


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圖7 抑制ASH1L-HIF-1α-TAM軸可遏制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移

 8.分子機(jī)制


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   ASH1L在前列腺癌中基因擴(kuò)增并過表達(dá),通過重編程組蛋白甲基化修飾(如H3K4me3和H3K36me3),與HIF-1α合作,誘導(dǎo)癌細(xì)胞中促轉(zhuǎn)移基因表達(dá),促使單核細(xì)胞分化為脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞(LA-TAM),增強(qiáng)其促腫瘤表型。此外,ASH1L通過IGF-2介導(dǎo)的氧化磷酸化重編程,促進(jìn)LA-TAMs的分化和表型變化,從而在骨轉(zhuǎn)移生態(tài)位中重塑免疫微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長。

結(jié)論:

   組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L是骨轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵表觀遺傳驅(qū)動因子。它通過與HIF-1α合作,重編程組蛋白甲基化修飾,誘導(dǎo)癌細(xì)胞中促轉(zhuǎn)移基因的表達(dá),并促使單核細(xì)胞分化為脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞(LA-TAM),增強(qiáng)其促腫瘤表型。此外,ASH1L通過IGF-2介導(dǎo)的氧化磷酸化重編程,促進(jìn)LA-TAMs的分化和表型變化,從而在骨轉(zhuǎn)移生態(tài)位中重塑免疫微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長。研究還表明,靶向ASH1L-HIF-1α-巨噬細(xì)胞軸的藥物治療能夠顯著抑制骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生和進(jìn)展,為骨轉(zhuǎn)移的治療提供了新的靶點和潛在的治療策略。

參考文獻(xiàn):

Meng C, Lin K, Shi W, Teng H, Wan X, DeBruine A, Wang Y, Liang X, Leo J, Chen F, Gu Q, Zhang J, Van V, Maldonado KL, Gan B, Ma L, Lu Y, Zhao D. Histone methyltransferase ASH1L primes metastases and metabolic reprogramming of macrophages in the bone niche. Nat Commun. 2025 May 20;16(1):4681.