組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L 引發(fā)骨生態(tài)位中巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和代謝重編程

   骨轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因，然而驅(qū)動這一過程的表觀遺傳學(xué)決定因素仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L在男性前列腺癌患者中存在基因擴(kuò)增現(xiàn)象，并且是骨轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵調(diào)控因子。ASH1L通過重塑組蛋白甲基化修飾，與HIF-1α協(xié)同作用誘導(dǎo)侵襲性癌細(xì)胞形成促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組，導(dǎo)致單核細(xì)胞分化為脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞（LA-TAM），并增強(qiáng)這些細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中的促腫瘤表型。我們鑒定出IGF-2作為ASH1L/HIF-1α的直接靶標(biāo)，通過重編程氧化磷酸化過程介導(dǎo)LA-TAM的分化與表型改變。在臨床前模型中，藥物抑制ASH1L-HIF-1α-巨噬細(xì)胞軸可引發(fā)顯著的抗轉(zhuǎn)移反應(yīng)。本研究揭示了癌細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)改變通過重編程代謝機(jī)制調(diào)控髓系細(xì)胞特征，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移灶生長的分子機(jī)制，確立了ASH1L作為表觀遺傳驅(qū)動因子在骨微環(huán)境中啟動轉(zhuǎn)移和巨噬細(xì)胞可塑性的關(guān)鍵作用，為轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤提供了可靠的治療靶點。該研究于2025年5月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：15.7。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.ASH1L在轉(zhuǎn)移性癌癥中存在基因擴(kuò)增及過表達(dá)現(xiàn)象

   通過對人類癌癥的薈萃分析，我們發(fā)現(xiàn)ASH1L基因的擴(kuò)增及增益現(xiàn)象在>40%的轉(zhuǎn)移性前列腺癌（PCa）中出現(xiàn)，其頻率顯著高于局限性腫瘤（圖1a）。高水平的ASH1L mRNA與基因擴(kuò)增狀態(tài)相關(guān)，且與轉(zhuǎn)移性疾病密切相關(guān)（附圖1a, b）。此外，ASH1L基因擴(kuò)增與轉(zhuǎn)移性PCa患者較差的總生存期相關(guān)（附圖1c），而ASH1L mRNA高表達(dá)的人前列腺腫瘤組織呈現(xiàn)富集的癌癥轉(zhuǎn)移特征譜（附圖1d）。對人PCa腫瘤組織的免疫組化（IHC）分析顯示，ASH1L蛋白水平與癌癥進(jìn)展及侵襲性呈正相關(guān)（圖1b及附圖1e）。在人PCa細(xì)胞系中，源自PC-3的轉(zhuǎn)移性變異株P(guān)C-3M表現(xiàn)出ASH1L表達(dá)上調(diào)（附圖1f）。我們前期研究建立的PB-Cre驅(qū)動Pten/Smad4/Trp53聯(lián)合缺失（PbPPS）轉(zhuǎn)基因小鼠模型26,27，可發(fā)展為伴有淋巴結(jié)、肺和肝轉(zhuǎn)移的侵襲性前列腺腺癌（附圖1g）。研究發(fā)現(xiàn)雄性PbPPS小鼠的侵襲性癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)移瘤中ASH1L高表達(dá)（圖1c及附圖1h）。除PCa外，其他惡性腫瘤中也普遍存在ASH1L基因擴(kuò)增（附圖1i）。具有高轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌和黑色素瘤細(xì)胞相較親本細(xì)胞同樣呈現(xiàn)ASH1L表達(dá)升高（附圖1j）。綜上，通過人類樣本、轉(zhuǎn)基因模型及癌細(xì)胞系的系統(tǒng)研究，我們證實組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L在轉(zhuǎn)移性PCa及其他惡性腫瘤中存在基因擴(kuò)增和過表達(dá)特征。

   我們隨后利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除PC-3M細(xì)胞中的ASH1L基因（圖1d），發(fā)現(xiàn)ASH1L缺失對細(xì)胞增殖或腫瘤生長僅產(chǎn)生適度影響（附圖2a, b），但顯著降低PC-3M細(xì)胞的遷移能力（附圖2c）。通過二維和三維侵襲實驗證實，ASH1L缺失能明顯抑制PCa細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲能力——這是轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的關(guān)鍵步驟（圖1e及附圖2d）。在另一轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞系DU145中也觀察到類似現(xiàn)象（附圖2e-g）。

   為評估ASH1L缺失對骨轉(zhuǎn)移的影響（80%晚期PCa患者會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致高致殘率28），我們向裸鼠心內(nèi)注射表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）和熒光素酶的對照組及ASH1L缺失型PC-3M細(xì)胞。生物發(fā)光成像顯示，ASH1L缺失可抑制癌細(xì)胞向脛骨、股骨或下頜骨的轉(zhuǎn)移（圖1f）。值得注意的是，ASH1L缺失顯著延長小鼠的總生存期和無轉(zhuǎn)移生存期（圖1g及附圖2h）。離體熒光成像顯示對照組PC-3M細(xì)胞在小鼠骨骼的轉(zhuǎn)移率為67%（12只中8只），而ASH1L敲除組未檢測到骨轉(zhuǎn)移（附圖2i）。PC-3M細(xì)胞建立的骨轉(zhuǎn)移模型通常會在骨微環(huán)境中形成溶骨性腫瘤29，組織學(xué)分析表明ASH1L缺失能抑制PC-3M細(xì)胞在骨骼的定植、減少破骨細(xì)胞數(shù)量并減輕溶骨性病變（圖1h及附圖2j）。這些體內(nèi)外實驗證實ASH1L對PCa侵襲及骨轉(zhuǎn)移具有決定性作用。

   為鑒于ASH1L基因在轉(zhuǎn)移性疾病中存在擴(kuò)增和過表達(dá)現(xiàn)象，我們進(jìn)一步探究了ASH1L過表達(dá)對PCa細(xì)胞遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響。與其他高分子量組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶類似30，在哺乳動物細(xì)胞中外源表達(dá)全長ASH1L蛋白存在技術(shù)挑戰(zhàn)31,32。為此，我們構(gòu)建了三個分別編碼人ASH1L蛋白1-882（F1）、883-1890（F2）和1891-2969（F3）氨基酸片段的質(zhì)粒（附圖3a, b）。值得注意的是，F(xiàn)3片段包含ASH1L蛋白所有功能域（附圖3a），并能逆轉(zhuǎn)ASH1L缺失型PC-3M細(xì)胞中H3K36me3和H3K4me3的缺失（附圖3c）。此外，在二維和三維培養(yǎng)體系中回補(bǔ)ASH1L-F3片段可部分恢復(fù)ASH1L缺失型PC-3M細(xì)胞的遷移和侵襲能力（附圖3d, e），表明F3片段對維持ASH1L的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性具有必要性和充分性。

   我們將ASH1L-F3導(dǎo)入低轉(zhuǎn)移潛能、低表達(dá)ASH1L的LNCaP細(xì)胞系，證實其能顯著增強(qiáng)H3K36和H3K4位點的組蛋白甲基化活性（圖1i）。雖然ASH1L-F3過表達(dá)不影響細(xì)胞生長，但可顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，而F1或F2片段對細(xì)胞遷移幾乎無影響（附圖3f-i）。為研究ASH1L過表達(dá)的體內(nèi)效應(yīng)，我們將攜帶空載或ASH1L-F3的LNCaP細(xì)胞注射至裸鼠脛骨，每周進(jìn)行生物發(fā)光成像。如圖1j所示，ASH1L-F3過表達(dá)顯著促進(jìn)PCa在骨骼中的轉(zhuǎn)移灶生長。ASH1L-F3組小鼠總生存期較對照組明顯縮短（圖1k）。離體熒光及組織學(xué)分析進(jìn)一步證實，ASH1L-F3過表達(dá)不僅促進(jìn)PCa骨轉(zhuǎn)移灶生長，還伴隨新骨形成（附圖3j-l）。

圖1.ASH1L在轉(zhuǎn)移性癌癥中存在基因擴(kuò)增及過表達(dá)現(xiàn)象

2.ASH1L通過H3K4和H3K36甲基化誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組

   為探究ASH1L促轉(zhuǎn)移機(jī)制，我們通過RNA測序（RNA-seq）對比分析了對照組與ASH1L缺失型PC-3M細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。差異基因表達(dá)分析顯示，ASH1L缺失導(dǎo)致1378個基因下調(diào)及307個基因上調(diào)（錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR≤0.05，且兩個靶向ASH1L的sgRNA均顯示倍數(shù)變化FC≥2）（圖2a-c、附圖4a,b及補(bǔ)充數(shù)據(jù)1），進(jìn)一步證實ASH1L在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活作用。Ingenuity通路分析（IPA）表明，這些差異表達(dá)基因（DEGs）與EMT（上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化）、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、整合素信號、血管生成通路及HIF-1α信號等轉(zhuǎn)移相關(guān)通路顯著相關(guān)（圖2b）。

   已有研究表明，ASH1L通過催化H3K36me2/3和維持H3K4me3參與表觀遺傳重編程[16-18,20]，這些修飾與轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)[33-35]。在轉(zhuǎn)移性PC-3M細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)ASH1L缺失導(dǎo)致H3K36和H3K4甲基化水平整體降低（圖1d），而過表達(dá)ASH1L則增加這些組蛋白修飾標(biāo)記（圖1i）。為深入解析ASH1L對組蛋白甲基化景觀的影響，我們采用核酸酶靶向切割與釋放測序技術(shù)（CUT&RUN-seq）[36]，檢測了ASH1L缺失前后PC-3M細(xì)胞中H3K4me3和H3K36me3的基因組分布。

   根據(jù)ASH1L缺失引起的組蛋白修飾變化，我們將所有蛋白編碼基因分為五個集群（圖2d,e及附圖4c,d）：集群1（C1，占全部基因的3%）顯示兩種組蛋白修飾信號均降低；集群2（C2，5.3%）僅H3K4me3減少；集群3（C3，3.8%）僅H3K36me3減少；集群4（C4，2%）包含H3K4和/或H3K36甲基化增加的基因；兩種修飾均無變化的基因歸入集群5（C5，86%）。與預(yù)期一致，H3K4me3在全基因組范圍內(nèi)主要富集于基因啟動子區(qū)（圖2d,e及附圖4c,d）。ASH1L缺失后，1622個基因（C1+C2，8.3%）的H3K4me3信號強(qiáng)度顯著降低（FDR≤0.05；FC≥1.5）（圖2d,e及補(bǔ)充數(shù)據(jù)2）。而H3K36me3信號則分布于基因體區(qū)，從轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）開始向轉(zhuǎn)錄終止位點（TES）逐漸增強(qiáng)（圖2d,e及附圖4c,d）。ASH1L缺失使1330個基因（C1+C3，6.8%）基因體區(qū)的H3K36me3信號顯著減弱（FDR≤0.05；FC≥1.5）（圖2d,e及補(bǔ)充數(shù)據(jù)3）。

   通過維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的差異表達(dá)基因（DEGs）與H3K4me3或H3K36me3信號減弱顯著相關(guān)。具體而言，46%和35%的下調(diào)DEGs（FDR≤0.05；FC≥1.5）分別呈現(xiàn)H3K4me3和H3K36me3信號降低（重疊p值<1e-300，F(xiàn)isher精確檢驗）（圖2f），提示這些基因（n=1180）很可能是ASH1L在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中的直接靶標(biāo)（補(bǔ)充數(shù)據(jù)4）。熱圖和箱線圖分析顯示，集群1-3中H3K4me3或H3K36me3的減少與mRNA水平下調(diào)強(qiáng)烈相關(guān)，其中集群1的基因表達(dá)下降最為顯著（圖2d,g及附圖4e）。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)移相關(guān)基因是ASH1L的直接靶標(biāo)（補(bǔ)充數(shù)據(jù)4中高亮顯示）。ASH1L缺失后，多數(shù)靶標(biāo)基因表現(xiàn)為兩種修飾信號同時減弱（如PLAU），但部分基因僅顯示H3K4me3（如MMP14）或H3K36me3信號（如VEGFC）的急劇下降（圖2h）。需特別指出的是，這三種組蛋白甲基化模式均與促轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)（圖2h）。

   這些轉(zhuǎn)錄組與表觀遺傳學(xué)研究證實，ASH1L通過重編程H3K4和H3K36位點的組蛋白甲基化，調(diào)控侵襲性癌細(xì)胞中促轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄激活。值得關(guān)注的是，雖然在白血病中ASH1L通過激活HOX家族基因促進(jìn)白血病發(fā)生[20-23]，但在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，ASH1L缺失既不影響HOX基因簇的表達(dá)，也不改變其H3K4me3/H3K36me3修飾水平（圖2h），表明ASH1L對靶基因的調(diào)控具有高度選擇性和環(huán)境特異性。

圖2.ASH1L通過H3K4和H3K36甲基化誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄組

3.ASH1L與HIF-1α協(xié)同誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移基因表達(dá)并增強(qiáng)侵襲能力

   作為缺氧信號通路的核心調(diào)控因子，轉(zhuǎn)錄因子HIFs能夠激活介導(dǎo)血管生成、細(xì)胞運動、EMT、細(xì)胞外基質(zhì)降解、侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因表達(dá)[38]。HIFs是由氧敏感亞基（HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α）與組成型表達(dá)亞基HIF-1β構(gòu)成的異源二聚體。通路分析顯示ASH1L與HIF-1α信號通路存在關(guān)聯(lián)（圖2b）?；蚣患治觯℅SEA）進(jìn)一步證實，ASH1L缺失會導(dǎo)致缺氧通路及HIF-1α靶基因顯著下調(diào)（圖3a-d），尤其是參與癌細(xì)胞侵襲（Snail、TGFB和MET）、細(xì)胞外基質(zhì)重塑（MMPs和PLAU）以及血管生成（VEGFs）的基因。CUT&RUN分析驗證了ASH1L缺失后HIF-1α靶基因上H3K4me3和/或H3K36me3修飾標(biāo)記的顯著減少（圖3d），表明ASH1L通過調(diào)控組蛋白甲基化參與HIF-1α轉(zhuǎn)錄程序。

   通過對PC-3細(xì)胞已發(fā)表的HIF-1α ChIP測序數(shù)據(jù)集（GSE106305）[39]的分析，我們發(fā)現(xiàn)83.2%（1180個中的982個）ASH1L直接靶基因（補(bǔ)充數(shù)據(jù)4）的啟動子區(qū)域存在HIF-1α蛋白結(jié)合，其中包括與癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（附圖5a及補(bǔ)充數(shù)據(jù)5）。這些結(jié)果表明，HIF-1α是ASH1L調(diào)控前列腺癌促轉(zhuǎn)移基因的重要協(xié)同因子。

   此外，qPCR實驗顯示ASH1L敲除顯著下調(diào)PC-3M細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)HIF-1α靶基因的mRNA水平，而回補(bǔ)ASH1L-F3片段可完全恢復(fù)其表達(dá)（圖3e和附圖5b）。在常氧條件下培養(yǎng)的LNCaP細(xì)胞因蛋白降解活躍而HIF-1α水平較低，但骨轉(zhuǎn)移灶中的低氧環(huán)境能穩(wěn)定HIF-1α蛋白（附圖5c）。為模擬這種缺氧條件，我們用CoCl2處理對照和ASH1L-F3過表達(dá)的LNCaP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ASH1L-F3顯著誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移基因表達(dá)（圖3f），這與體外和體內(nèi)觀察到的侵襲表型一致（圖1j,k及附圖3）。相比之下，F(xiàn)2260A突變體誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)錄的活性明顯受損（附圖5d），表明ASH1L的作用依賴其組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

   重要的是，內(nèi)源性免疫共沉淀（co-IP）和無細(xì)胞蛋白下拉實驗證實ASH1L-F3直接與HIF-1α蛋白相互作用（圖3g和附圖5e），強(qiáng)化了ASH1L與HIF-1α在轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞中形成功能復(fù)合體的觀點。通過分析已發(fā)表的人類原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤樣本的批量RNA-seq及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[40,41]，我們發(fā)現(xiàn)HIF家族成員中HIF-1α在上皮成分中與ASH1L的共表達(dá)最為顯著（附圖5f-h）。與ASH1L低表達(dá)組相比，高表達(dá)ASH1L的PCa腫瘤上皮成分顯示HIF-1α轉(zhuǎn)錄組水平升高（圖3h和附圖5i）。

   為闡明HIF-1α在ASH1L驅(qū)動的促轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)錄及侵襲中的作用，我們在表達(dá)ASH1L-F3的LNCaP細(xì)胞中使用siRNA或小分子化合物抑制HIF-1α。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，ASH1L-F3過表達(dá)在缺氧條件下引起促轉(zhuǎn)移基因上調(diào)，但該效應(yīng)可被HIF1A敲除所消除（圖3i）。同樣，用小分子抑制劑（LW6、2-MeOE2和PX-478）靶向HIF-1α能顯著削弱ASH1L-F3過表達(dá)驅(qū)動的LNCaP細(xì)胞遷移（圖3j），而HIF-2α抑制劑（PT2399）對細(xì)胞遷移影響甚微（附圖5j）。

   我們的機(jī)制研究共同表明，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L通過與轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α相互作用，激活促轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的侵襲能力。值得注意的是，ASH1L在白血病細(xì)胞中也與HIF-1α共定位于基因啟動子區(qū)（附圖5k,l及補(bǔ)充數(shù)據(jù)5），但僅有32.5%（3482個中的1132個）ASH1L靶基因與HIF-1α共享，且不同于轉(zhuǎn)移性PCa中的靶基因（附圖5k,l及補(bǔ)充數(shù)據(jù)5）。這表明ASH1L/HIF-1α相互作用是基因表達(dá)的普適調(diào)控機(jī)制，但其靶基因可能因細(xì)胞環(huán)境而異。

圖3.ASH1L與HIF-1α協(xié)同誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移基因表達(dá)并增強(qiáng)侵襲能力

4.在免疫健全環(huán)境中解析ASH1L的功能

   既往研究表明，HIF信號通路在調(diào)控原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的基質(zhì)與免疫組分中起關(guān)鍵作用[38,42,43]。鑒于ASH1L能促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)HIF-1α轉(zhuǎn)錄組，我們提出假說：除了重編程侵襲性癌細(xì)胞的促轉(zhuǎn)移基因外，ASH1L還可能通過細(xì)胞外作用重塑骨微環(huán)境?；谇捌趶腜bPPS轉(zhuǎn)移性前列腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型（附圖1g）中建立的同源PCa細(xì)胞系DX1[44,45]，我們通過脛骨內(nèi)注射DX1細(xì)胞至C57BL/6J雄性小鼠構(gòu)建了同種異體移植模型（圖4a），模擬PCa骨轉(zhuǎn)移灶生長。

   接種2-3周后，DX1細(xì)胞在骨組織中形成兼具溶骨/成骨特征的轉(zhuǎn)移灶（圖4b,c及附圖6a），重現(xiàn)了PCa患者的骨轉(zhuǎn)移特征。組織病理學(xué)分析顯示，轉(zhuǎn)移灶中皮質(zhì)骨顯著吸收并伴隨大量編織骨新生，同時破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞明顯富集（圖4c-g及附圖6a）。

   為探究ASH1L在免疫健全環(huán)境中對轉(zhuǎn)移灶生長及骨微環(huán)境的影響，我們通過sgRNA-CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除DX1細(xì)胞中的ASH1L基因（附圖6b），并將表達(dá)熒光素酶的對照組與ASH1L缺失型細(xì)胞注射至C57BL/6J雄性小鼠單側(cè)脛骨（圖4a）?；铙w成像（IVIS）及離體GFP熒光成像顯示，癌細(xì)胞中ASH1L的基因敲除顯著抑制骨內(nèi)腫瘤生長（圖4b及附圖6c）。X射線成像與組織病理學(xué)分析表明，侵襲性癌細(xì)胞中ASH1L的缺失可保護(hù)皮質(zhì)骨免于吸收，并減少新生編織骨形成（圖4c-e及附圖6d）。ASHL1敲除后，骨轉(zhuǎn)移灶中的破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞數(shù)量均減少（圖4c,f,g）。使用shRNA敲低ASH1L也觀察到類似效應(yīng)（附圖6e-k）。結(jié)合異種移植轉(zhuǎn)移模型的發(fā)現(xiàn)，這些同源模型實驗結(jié)果確立了ASH1L作為骨轉(zhuǎn)移灶生長的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控因子。

圖4在免疫健全環(huán)境中解析ASH1L的功能

5.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示ASH1L調(diào)控轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可塑性

   為解析ASH1L對侵襲性癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境的影響，我們對對照組（n=3）和ASH1L缺失組（n=4）同源骨腫瘤進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理與質(zhì)控流程（方法部分），共獲得30,850個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜。聚類分析鑒定出10個主要細(xì)胞群（AC1-AC10，每個群含760-6999個細(xì)胞；附圖6l）。對照組與ASH1L缺失組骨腫瘤細(xì)胞分布于所有10個集群，且每個集群均包含7個樣本的細(xì)胞（附圖6m）。通過整合差異基因表達(dá)分析和已知細(xì)胞譜系標(biāo)志物（附圖6l,n），我們明確了各集群的細(xì)胞身份：成纖維細(xì)胞群AC3高表達(dá)Col1a2，內(nèi)皮細(xì)胞群AC4呈現(xiàn)Pecam1特征，免疫細(xì)胞群AC5-AC10高表達(dá)各譜系標(biāo)志物，重現(xiàn)了人類樣本的免疫景觀。AC1和AC2均顯示管腔上皮細(xì)胞標(biāo)志物Krt8高表達(dá)，提示為癌細(xì)胞群，但僅AC1集群顯著高表達(dá)HIF-1α轉(zhuǎn)錄組特征，且該特征在ASH1L缺失腫瘤中明顯減弱（附圖6o），強(qiáng)化了ASH1L在調(diào)控侵襲性癌細(xì)胞HIF-1α轉(zhuǎn)錄組中的關(guān)鍵作用。

  為可視化ASH1L缺失對骨微環(huán)境免疫組分的影響，我們對17,423個免疫細(xì)胞進(jìn)行亞群分析，鑒定出9個主要免疫細(xì)胞亞群（圖4h-l及補(bǔ)充數(shù)據(jù)6）：T/NK細(xì)胞（C1：Cd3ehigh/Cd3dhigh/Nkg7high）、B/漿細(xì)胞（C2：Cd79ahigh/Igkchigh）、單核細(xì)胞（C3：Itgam+/F13a1high/Ly6c2high）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM（C4：Itgam+/Csf1rhigh/Cd68high/Mrc1high/Trem2high）、樹突狀細(xì)胞（C5：H2-Aahigh/Tcf4high/Runx3high）、前中性粒細(xì)胞（C6：Itgam+/Mpohigh/Elanehigh）、髓源性抑制細(xì)胞MDSC_1（C7：Itgam+/S100a8high/Cxcr2high/Ly6c2low）和MDSC_2（C8：Itgam+/S100a8high/Ly6c2high/Cxcr2mid）。值得注意的是，ASH1L缺失增加了B細(xì)胞（C2）和單核細(xì)胞（C3）的浸潤，卻顯著減少了TAM（C4）的數(shù)量（圖4j-l），表明ASH1L參與調(diào)控轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中的單核髓系細(xì)胞。

   既往研究顯示，腫瘤浸潤單核細(xì)胞與TAM在微環(huán)境中具有異質(zhì)性，并在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮不同功能[7,8,10,12,46,47]。為明確其亞型特征與活化狀態(tài)，并解析ASH1L的影響，我們對對照組和ASH1L缺失組骨腫瘤中的單核細(xì)胞（C3）與TAM（C4）進(jìn)行聚類和差異基因表達(dá)分析，最終鑒定出7個特征性亞群（圖5a,b及補(bǔ)充數(shù)據(jù)7）：經(jīng)典單核細(xì)胞（MC1）、非經(jīng)典單核細(xì)胞（MC2）、單核/TAM中間態(tài)細(xì)胞（MC3）、促血管生成TAM（MC4）、脂質(zhì)相關(guān)TAM（MC5）、炎性TAM（MC6）和增殖型TAM（MC7）。對照組與ASH1L缺失組細(xì)胞以不同比例分布于所有7個亞群中（圖5c,d及附圖7a）。

   在這些亞群中，MC1和MC2均為單核細(xì)胞。與MC2相比，MC1在骨微環(huán)境中占主導(dǎo)地位，表達(dá)經(jīng)典單核細(xì)胞標(biāo)志物（如Ly6c2、F13a1、Mgst1和Ccr2）；而MC2僅占單核/TAM總數(shù)的1-2%，呈現(xiàn)非經(jīng)典單核細(xì)胞特征基因（如Ace、Adgre、Treml4和Cd36）（圖5a-d）。亞群MC4-MC7雖均表達(dá)巨噬細(xì)胞譜系標(biāo)志物（Csf1r和Cd68），但具有截然不同的轉(zhuǎn)錄組特征與活化狀態(tài)（圖5a,b,e，附圖7b-d及補(bǔ)充數(shù)據(jù)7）。MC4亞群高表達(dá)促血管生成基因（包括Spp1、Vegfa、Arg1和Mif），故命名為促血管生成TAM；MC5細(xì)胞高表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)TAM標(biāo)志物（Apoe、C1qc和Trem2）及促腫瘤標(biāo)志物Mrc1；MC7雖與脂質(zhì)相關(guān)TAM（MC5）共享多數(shù)標(biāo)志物，但呈現(xiàn)高增殖特征（Mki67、Cdk1和Top2a）；MC6亞群則富集抗原呈遞分子（H2-aa、H2-ab1和Cd40）、干擾素信號通路（IL1rn、Jak2、Stat1、Irf1和Nfkb1）以及T細(xì)胞招募/活化相關(guān)細(xì)胞因子（Cxcl9和Tnf）。值得注意的是，我們還鑒定出MC3亞群，其同時表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（Csf1r和Cd68）與單核細(xì)胞標(biāo)志物（F13a1和Ly6c2）。軌跡與擬時序分析表明，MC1中的經(jīng)典單核細(xì)胞是其他六個亞群的譜系前體，而MC3細(xì)胞處于單核細(xì)胞向TAM分化的中間狀態(tài)（圖5f）。

   與對照組相比，ASH1L缺失的骨腫瘤中脂質(zhì)相關(guān)TAM（MC5）、增殖型TAM（MC7）和促血管生成TAM（MC4）顯著減少，而單核/TAM中間態(tài)細(xì)胞（MC3）急劇增加，經(jīng)典單核細(xì)胞（MC1）也有輕度增多。差異基因表達(dá)分析顯示，在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中敲除ASH1L后，單核細(xì)胞與TAM中除TAM標(biāo)志物外，眾多促腫瘤/轉(zhuǎn)移基因和免疫抑制分子也顯著下調(diào)（圖5e,g，附圖7b,d及補(bǔ)充數(shù)據(jù)8）。盡管炎性TAM（MC6）比例變化不大（圖5d），但ASH1L缺失后TAM中抗原呈遞、干擾素信號和炎癥相關(guān)基因顯著上調(diào)（圖5e,g，附圖7c及補(bǔ)充數(shù)據(jù)8）。這些結(jié)果表明，侵襲性癌細(xì)胞中的ASH1L促進(jìn)骨微環(huán)境中TAM向脂質(zhì)相關(guān)、促血管生成和抗炎狀態(tài)轉(zhuǎn)化。

   為直觀展示單核細(xì)胞與TAM在骨轉(zhuǎn)移灶中的空間分布，我們采用多重免疫組化技術(shù)對單核細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)y6c、總TAM標(biāo)志物F4/80及促腫瘤TAM標(biāo)志物CD206（由Mrc1基因編碼）進(jìn)行共染色。與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析一致，抑制癌細(xì)胞中ASH1L顯著減少促腫瘤表型TAM（F4/80+CD206+），同時增加骨微環(huán)境中腫瘤浸潤單核細(xì)胞（Ly6c+）（圖5h及附圖7e）。反之，癌細(xì)胞過表達(dá)ASH1L可抑制單核細(xì)胞而促進(jìn)促腫瘤TAM（附圖7f）。為驗證轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞與單核細(xì)胞的直接互作，我們從健康人血液中分離單核細(xì)胞，與ASH1L敲除或未敲除的PC-3M細(xì)胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)（圖5i）。結(jié)果顯示，ASH1L缺失細(xì)胞的條件培養(yǎng)基無法誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)/促血管生成TAM標(biāo)志物，但促進(jìn)其高表達(dá)炎性TAM標(biāo)志物（圖5i）。在人單核細(xì)胞系THP-1中也觀察到類似現(xiàn)象（附圖7g）。

   綜合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析與功能驗證，我們揭示侵襲性癌細(xì)胞中的ASH1L通過促進(jìn)單核細(xì)胞分化為脂質(zhì)相關(guān)和促血管生成TAM，并將其重編程為促腫瘤和抗炎狀態(tài)，從而重塑轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境。

圖5 .單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示ASH1L調(diào)控轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可塑性

 6.ASH1L通過IGF-2介導(dǎo)的氧化磷酸化誘導(dǎo)脂質(zhì)相關(guān)TAM形成

   為闡明ASH1L調(diào)控巨噬細(xì)胞分化與可塑性的分子機(jī)制，我們對TAM亞群（MC4-MC7）的差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析。與對照組相比，ASH1L缺失骨腫瘤中的TAM顯示炎癥通路顯著激活，包括干擾素信號、TNF信號、IL-1/2信號、cGAS-STING通路以及抗原加工呈遞通路（圖6a）。同時，ASH1L缺失導(dǎo)致TAM中細(xì)胞衰老與焦亡通路相關(guān)基因顯著上調(diào)，而細(xì)胞周期與有絲分裂相關(guān)基因下調(diào)（圖6a）。這表明侵襲性癌細(xì)胞中的ASH1L通過維持TAM的增殖能力、存活狀態(tài)及抗炎表型發(fā)揮作用。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中ASH1L的缺失會導(dǎo)致氧化磷酸化（OXPHOS）、三羧酸循環(huán)（TCA）、脂肪酸β氧化（FAO）和ATP合成功能下降（圖6a）。在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤的TAM中，OXPHOS特征基因顯著富集（圖6b），這與既往在原發(fā)灶和其他轉(zhuǎn)移部位的研究一致[48,49]。但本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中ASH1L的缺失會顯著降低脂質(zhì)相關(guān)TAM中OXPHOS相關(guān)基因的表達(dá)（圖6b）。這些結(jié)果表明，ASH1L在重編程轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中巨噬細(xì)胞代謝方面起關(guān)鍵作用，促進(jìn)脂質(zhì)相關(guān)TAM的誘導(dǎo)及其促腫瘤表型形成。

   如圖5i和附圖7g所示，ASH1L缺失的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人單核細(xì)胞向脂質(zhì)相關(guān)/促血管生成TAM分化的能力受損，提示分泌因子介導(dǎo)了ASH1L對TAM的調(diào)控。為鑒定該因子，我們整合RNA-seq和CUT&RUN-seq數(shù)據(jù)集（圖3及補(bǔ)充數(shù)據(jù)1-4），篩選出5個TAM相關(guān)分泌蛋白候選分子——它們均是ASH1L/HIF-1α的共同靶基因，且在ASH1L缺失的PC-3M細(xì)胞中顯著下調(diào)（圖6c）。其中僅胰島素樣生長因子2（IGF-2）與巨噬細(xì)胞代謝相關(guān)[50]。圖6a通路分析也顯示，ASH1L缺失骨腫瘤中的TAM呈現(xiàn)IGF下游信號（如AKT和MAPK通路）減弱，提示IGF信號可能參與ASH1L驅(qū)動的TAM可塑性與代謝重編程。

   IGF家族成員（IGF-1和IGF-2）通過結(jié)合受體在細(xì)胞增殖、存活、蛋白翻譯和代謝中起關(guān)鍵作用[51]。在轉(zhuǎn)移性PC-3M細(xì)胞中，IGF-2啟動子區(qū)富含H3K4me3修飾，但該信號在ASH1L缺失后完全消失（圖6d），而IGF-2基因體區(qū)未檢測到H3K36me3信號，表明ASH1L通過調(diào)控H3K4三甲基化調(diào)節(jié)IGF-2表達(dá)。ASH1L缺失還顯著降低PC-3M細(xì)胞中IGF-2 mRNA水平（圖6d,e），反之ASH1L-F3過表達(dá)可提升LNCaP細(xì)胞IGF-2表達(dá)（圖6f）。相比之下，PC-3M細(xì)胞中IGF-1基因表達(dá)極低，且其啟動子和基因體均無H3K4me3或H3K36me3修飾（圖6d）。ChIP-seq分析顯示HIF-1α直接結(jié)合PC-3細(xì)胞中IGF-2啟動子區(qū)（附圖8a），而siRNA敲低HIF-1α可消除LNCaP細(xì)胞中ASH1L-F3對IGF-2的誘導(dǎo)（附圖8b），證實IGF-2是轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中ASH1L/HIF-1α復(fù)合體的直接靶標(biāo)。

   單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析顯示，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中ASH1L缺失導(dǎo)致TAM中OXPHOS復(fù)合體I、III、IV和V核心亞基轉(zhuǎn)錄水平下降（圖6g），這些復(fù)合體是催化OXPHOS和ATP合成的關(guān)鍵組分。在ASH1L缺失的PC-3M條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的人單核細(xì)胞中也驗證了這一現(xiàn)象（圖6h及附圖8c）。在自身免疫疾病中，IGF-2可通過增強(qiáng)OXPHOS使成熟巨噬細(xì)胞獲得抗炎表型[50]。使用IGF-2重組蛋白處理人單核細(xì)胞后，我們同樣觀察到AKT-GSK3b-mTOR信號激活、OXPHOS基因上調(diào)及脂質(zhì)相關(guān)TAM標(biāo)志物表達(dá)增加（附圖8d,e）。重要的是，補(bǔ)充IGF-2重組蛋白可基本挽救ASH1L缺失導(dǎo)致的TAM中OXPHOS基因表達(dá)及抗炎/促腫瘤表型缺陷（圖6h及附圖8c）。在轉(zhuǎn)移性PCa患者中，IGF-2表達(dá)也與脂質(zhì)相關(guān)TAM標(biāo)志物及促腫瘤表型標(biāo)志物呈正相關(guān)（附圖8f,g）。這些機(jī)制研究證實，作為轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中ASH1L/HIF-1α復(fù)合體的直接靶標(biāo)，IGF-2通過增強(qiáng)OXPHOS介導(dǎo)單核細(xì)胞向脂質(zhì)相關(guān)TAM分化，并維持其促腫瘤和抗炎表型。

圖6. ASH1L通過IGF-2介導(dǎo)的氧化磷酸化誘導(dǎo)脂質(zhì)相關(guān)TAM形成

 7.抑制ASH1L-HIF-1α-TAM軸可遏制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移

    為驗證TAM是否在ASH1L驅(qū)動的骨轉(zhuǎn)移灶生長中起關(guān)鍵作用，我們開展了體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除實驗（圖7a）。向C57BL/6J雄性小鼠脛骨注射表達(dá)熒光素酶的對照或ASH1L敲低型DX1細(xì)胞后，每周通過腹腔注射CSF1R單抗或IgG對照抗體（300μg/次）清除巨噬細(xì)胞，并進(jìn)行生物發(fā)光成像。與ASH1L缺失表型一致，CSF1R阻斷顯著抑制前列腺癌骨內(nèi)生長（圖7b,c及附圖9a）。值得注意的是，ASH1L抑制僅在巨噬細(xì)胞存在時才能削弱骨腫瘤生長，而巨噬細(xì)胞清除后該效應(yīng)消失（圖7b,c及附圖9a），表明TAM是ASH1L促轉(zhuǎn)移作用的必要條件。免疫熒光染色不僅證實CSF1R阻斷后骨腫瘤中總TAM（F4/80+CD206+與F4/80+CD206-）被清除，還驗證了ASH1L抑制對骨微環(huán)境中促腫瘤TAM（F4/80+CD206+）的削減作用（圖7d及附圖9b）。

    近期研究發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑AS-99可靶向ASH1L并具有抗白血病活性[52]。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)AS-99以劑量依賴性方式降低H3K4和H3K36位點的組蛋白甲基化水平（附圖9c），并削弱體外細(xì)胞遷移能力（附圖9d）。在乳腺癌細(xì)胞中也觀察到類似效應(yīng)（附圖9e）。隨后我們評估了AS-99在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移臨床前模型中的療效：將PC-3M細(xì)胞注射至裸鼠左心室14天后，分別給予溶劑對照和AS-99治療（腹腔注射，25 mg/kg，每周5次，持續(xù)3周）（圖7e）。結(jié)果顯示AS-99治療顯著抑制骨轉(zhuǎn)移并延長小鼠總生存期（圖7e,f）。與對照組相比，AS-99治療的轉(zhuǎn)移瘤中促腫瘤TAM（F4/80+CD206+）數(shù)量減少（圖7g及附圖9f）。這些臨床前研究證實了靶向ASH1L在轉(zhuǎn)移性疾病中的治療潛力。

    鑒于HIF-1α是ASH1L在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中的關(guān)鍵協(xié)同因子，且靶向HIF-1α的藥物已進(jìn)入臨床研究階段[38,53]，我們進(jìn)一步評估了HIF-1α抑制劑PX-478在骨轉(zhuǎn)移模型中的療效。通過向C57BL/6J雄性小鼠單側(cè)脛骨注射對照或ASH1L缺失型DX1細(xì)胞后，給予溶劑或PX-478治療（腹腔注射40 mg/kg，每周3次，持續(xù)3周）?；铙w成像（IVIS）與離體熒光成像顯示，ASH1L缺失雖能顯著抑制骨內(nèi)腫瘤生長，但該效應(yīng)可被PX-478治療所抵消（圖7h及附圖9g）。值得注意的是，HIF-1α抑制僅在對照組中表現(xiàn)出抗腫瘤效果，而在ASH1L缺失組無效（圖7h及附圖9g）。多重免疫組化染色進(jìn)一步證實，HIF-1α抑制劑能顯著減少表達(dá)ASH1L的腫瘤中促腫瘤TAM（F4/80+CD206+）的浸潤（圖7i及附圖9h）。這些結(jié)果揭示HIF-1α在ASH1L驅(qū)動的骨轉(zhuǎn)移灶生長及TAM可塑性中起關(guān)鍵作用，提示靶向HIF-1α對轉(zhuǎn)移性PCa患者的治療潛力。

    最后，我們分析了ASH1L與TAM在人類轉(zhuǎn)移性PCa中的相關(guān)性。通過對13例轉(zhuǎn)移性PCa患者的24,433個非上皮細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析[41]，鑒定出代表髓系細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的18個亞群（圖7j及附圖10a,b）。研究發(fā)現(xiàn)人類轉(zhuǎn)移性腫瘤中的髓系成分主要為單核細(xì)胞和TAM，且所有三個TAM亞群均高表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)TAM標(biāo)志物（APOE、C1QA和TREM2），并呈現(xiàn)CD206（MRC1）陽性的促腫瘤表型（圖7j及附圖10b,c）。根據(jù)上皮細(xì)胞中ASH1L表達(dá)水平，將13例轉(zhuǎn)移瘤分為ASH1L高表達(dá)組（n=5）和低表達(dá)組（n=8）（附圖10d）。與低表達(dá)組相比，ASH1L高表達(dá)的轉(zhuǎn)移瘤中脂質(zhì)相關(guān)TAM更富集（圖7k,l），同時癌細(xì)胞中HIF-1α轉(zhuǎn)錄組特征也更顯著（附圖10e）。此外，通過CIBERSORT算法對208例轉(zhuǎn)移性PCa患者的批量RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示，存在ASH1L基因增益或擴(kuò)增的轉(zhuǎn)移瘤含有更高比例的TAM（附圖10f）。這些人類樣本研究為ASH1L促進(jìn)轉(zhuǎn)移微環(huán)境中TAM（尤其是脂質(zhì)相關(guān)TAM）的作用提供了關(guān)鍵證據(jù)。

圖7 抑制ASH1L-HIF-1α-TAM軸可遏制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移

 8.分子機(jī)制

   ASH1L在前列腺癌中基因擴(kuò)增并過表達(dá)，通過重編程組蛋白甲基化修飾（如H3K4me3和H3K36me3），與HIF-1α合作，誘導(dǎo)癌細(xì)胞中促轉(zhuǎn)移基因表達(dá)，促使單核細(xì)胞分化為脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞（LA-TAM），增強(qiáng)其促腫瘤表型。此外，ASH1L通過IGF-2介導(dǎo)的氧化磷酸化重編程，促進(jìn)LA-TAMs的分化和表型變化，從而在骨轉(zhuǎn)移生態(tài)位中重塑免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長。

結(jié)論：

   組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L是骨轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵表觀遺傳驅(qū)動因子。它通過與HIF-1α合作，重編程組蛋白甲基化修飾，誘導(dǎo)癌細(xì)胞中促轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)，并促使單核細(xì)胞分化為脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞（LA-TAM），增強(qiáng)其促腫瘤表型。此外，ASH1L通過IGF-2介導(dǎo)的氧化磷酸化重編程，促進(jìn)LA-TAMs的分化和表型變化，從而在骨轉(zhuǎn)移生態(tài)位中重塑免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長。研究還表明，靶向ASH1L-HIF-1α-巨噬細(xì)胞軸的藥物治療能夠顯著抑制骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生和進(jìn)展，為骨轉(zhuǎn)移的治療提供了新的靶點和潛在的治療策略。

參考文獻(xiàn)：

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