失巢凋亡相關(guān)特征的風(fēng)險(xiǎn)模型表明RAC3是肝細(xì)胞癌中一種新的腫瘤啟動(dòng)子基因

肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞中的失巢凋亡抵抗可提高存活率和轉(zhuǎn)移率。本研究旨在建立一個(gè)基于失巢凋亡相關(guān)基因（ARGs）的模型來(lái)預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后，并探討關(guān)鍵ARGs的臨床病理意義和功能。HCC隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式由TCGA、GEO和ICGC匯編而成。進(jìn)行單變量和LASSO多變量分析以篩查預(yù)后ARG。采用功能獲得和喪失研究、RNA測(cè)序和質(zhì)譜來(lái)闡明ARG在HCC中的潛在機(jī)制。我們建立了HCC預(yù)后的五基因ARGs風(fēng)險(xiǎn)模型，1年生存期的AUC值為0.812。在這五個(gè)基因中，Rac家族小GTP酶3（RAC3）在HCC中相對(duì)于鄰近的正常組織上調(diào)，與HCC患者的總體生存率和無(wú)病生存率呈負(fù)相關(guān)。RAC3在HCC細(xì)胞中的沉默導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞增殖和侵襲減少。從機(jī)制上講，我們發(fā)現(xiàn)RAC3與SOX6的結(jié)合通過(guò)NNMT介導(dǎo)的cAMP/MAPK/Rap1信號(hào)的刺激促進(jìn)HCC細(xì)胞的進(jìn)展。特別是，靶向RAC3的小分子抑制劑EHop-016顯著抑制HCC的進(jìn)展。該研究于2025年3月發(fā)表在《MedComm》，IF 10.7分。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1、具有臨床意義的ARGs篩查

   研究分析了從TCGA_LIHC數(shù)據(jù)集中獲取的480個(gè)抗凋亡相關(guān)基因（ARGs）的mRNA表達(dá)譜，并在癌癥基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）中識(shí)別出118個(gè)在肝細(xì)胞癌（HCC）組織與相鄰正常組織之間表達(dá)差異顯著的基因。其中，113個(gè)基因在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1A），熱圖顯示了代表性差異表達(dá)基因（DEGs）（圖1B）。通過(guò)將HCC數(shù)據(jù)集GSE14520與118個(gè)DEGs進(jìn)行交集分析，發(fā)現(xiàn)105個(gè)基因在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均有出現(xiàn)（圖1C），這些基因被選為構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型的基礎(chǔ)。為了探究這105個(gè)基因的臨床意義，首先，我們將TCGA_LIHC中的370例HCC病例隨機(jī)分為兩組：包含222例的訓(xùn)練隊(duì)列和包含148例的測(cè)試隊(duì)列，兩組的臨床特征保持平衡（表S1）；隨后，我們對(duì)訓(xùn)練隊(duì)列應(yīng)用單變量Cox回歸分析以確定預(yù)后ARGs，發(fā)現(xiàn)105個(gè)ARGs中有58個(gè)與總生存（OS）顯著相關(guān)（圖1D）。

圖1：為HCC患者構(gòu)建ARG特征

2、基于ARGs的HCC患者無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)

   我們利用58個(gè)ARGs對(duì)HCC患者進(jìn)行亞型分類(lèi)。通過(guò)逐步增加聚類(lèi)變量（k）的值，從2到9，觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)k=2時(shí)，組內(nèi)相似性（組內(nèi)相關(guān)性）最高，組間相似性（組間相關(guān)性）最低。這一最佳點(diǎn)表明，基于58個(gè)ARGs的表達(dá)譜，370例HCC患者可以被有效劃分為兩個(gè)不同的聚類(lèi)群（C1和C2）（圖S1A）。C1聚類(lèi)群中ARGs表達(dá)較低的患者比C2聚類(lèi)群中ARGs表達(dá)較高的患者具有更長(zhǎng)的總生存期（OS）（圖S1B）（p < 0.001）。熱圖展示了C1和C2聚類(lèi)群中58個(gè)ARGs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜（圖S1C）。進(jìn)一步分析了C1和C2聚類(lèi)群之間的差異表達(dá)基因（DEGs），共鑒定出2430個(gè)DEGs（圖S1D）。這些DEGs主要涉及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞周期和細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用等通路（圖S1E）?；蚣患治觯℅SEA）顯示，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等通路在C2聚類(lèi)群中顯著富集，而脂肪酸代謝通路主要富集在C1聚類(lèi)群中（圖S1F）。這些結(jié)果表明，基于ARGs的表達(dá)，不同亞型組的HCC患者在HCC進(jìn)展過(guò)程中表現(xiàn)出不同的分子模式。

3、基于ARGs的風(fēng)險(xiǎn)模型的建立與驗(yàn)證

   為探索HCC的ARGs特征，我們采用逐步方法，將58個(gè)ARGs納入LASSO Cox回歸和多變量Cox回歸，以建立用于預(yù)測(cè)HCC患者生存結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)模型。通過(guò)交叉驗(yàn)證，最終從58個(gè)與OS強(qiáng)相關(guān)的ARGs中篩選出5個(gè)基因（S期激酶相關(guān)蛋白2 [SKP2]、ETS變體轉(zhuǎn)錄因子4 [ETV4]、溶質(zhì)載體家族2成員1 [SLC2A1]、分泌型磷酸蛋白1 [SPP1]和RAC3），用于構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建方式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 =（0.415×SKP2表達(dá)量）+（0.134×ETV4表達(dá)量）+（0.226×SLC2A1表達(dá)量）+（0.110×SPP1表達(dá)量）+（0.314×RAC3表達(dá)量）（圖1G）。在TCGA_LIHC訓(xùn)練隊(duì)列中，計(jì)算得出的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為0.911；評(píng)分低于此閾值的患者被劃分為低風(fēng)險(xiǎn)組，而評(píng)分達(dá)到或超過(guò)0.911的患者被歸為高風(fēng)險(xiǎn)組。高風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列中這五個(gè)ARGs的表達(dá)水平更高，且隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的升高，總生存（OS）呈下降趨勢(shì)（圖1H）。當(dāng)將該風(fēng)險(xiǎn)模型應(yīng)用于測(cè)試隊(duì)列和整個(gè)隊(duì)列（TCGA_LIHC 370例）時(shí)，結(jié)果與訓(xùn)練隊(duì)列一致，從而驗(yàn)證其可靠性（圖1I、J）。

   高風(fēng)險(xiǎn)組的個(gè)體在所有三個(gè)隊(duì)列中均顯示出顯著較差的總生存（OS），與低風(fēng)險(xiǎn)組的個(gè)體相比（圖2A）。在訓(xùn)練隊(duì)列中進(jìn)行的接收者操作特征（ROC）分析顯示，該風(fēng)險(xiǎn)模型具有強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力，其曲線(xiàn)下面積（AUC）值分別為0.812、0.733和0.705，用于預(yù)測(cè)1年、3年和5年的生存率。相應(yīng)地，在測(cè)試隊(duì)列中，AUC值分別為0.754、0.607和0.602，用于相同的生存期，而在整個(gè)隊(duì)列中，AUC值分別為0.782、0.692和0.671（圖2B）。為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的診斷預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，我們使用外部數(shù)據(jù)集ICGC_LIRI和GSE14520進(jìn)行額外驗(yàn)證，結(jié)果與初始訓(xùn)練隊(duì)列一致（圖2C、D）。

圖2：ARG特征預(yù)測(cè)HCC診斷和預(yù)后

4、ARGs信號(hào)作為HCC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子

   我們接下來(lái)研究ARGs特征與HCC患者的臨床特征之間的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間，腫瘤分期、腫瘤分級(jí)和生存情況存在顯著差異（圖2E）。此外，ROC分析證實(shí)，風(fēng)險(xiǎn)模型顯示出優(yōu)越的預(yù)測(cè)能力，其AUC值為0.782，優(yōu)于其他臨床特征，包括年齡、性別、分級(jí)和分期，在TCGA_LIHC隊(duì)列中（圖2F）。

   為確定ARGs特征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否可以作為HCC患者的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物，我們對(duì)HCC隊(duì)列進(jìn)行單變量和多變量Cox回歸分析，考慮風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他臨床特征等變量。對(duì)于TCGA_LIHC隊(duì)列，單變量分析表明，年齡、腫瘤分級(jí)、腫瘤分期、血管侵犯或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與總生存（OS）相關(guān)（圖2G），而多變量分析證實(shí)，年齡、腫瘤分級(jí)、腫瘤分期或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以獨(dú)立預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后（圖2H）。對(duì)于GSE14520隊(duì)列，單變量和多變量分析均顯示TNM分期、巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與OS顯著相關(guān)（圖2I、J）。這些結(jié)果共同表明，從ARG特征得出的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分有潛力作為HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。 

5、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和化療敏感性列線(xiàn)圖構(gòu)建與評(píng)價(jià)

   為提高風(fēng)險(xiǎn)模型在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值，我們?cè)赥CGA_LIHC基礎(chǔ)上構(gòu)建一個(gè)預(yù)測(cè)諾莫圖，用于估計(jì)1年、3年和5年的總生存期，該諾莫圖基于臨床特征，包括性別、腫瘤分級(jí)、年齡、腫瘤分期和ARGs特征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖S2A）。ROC分析顯示諾莫圖具有良好的準(zhǔn)確性，AUC值分別為0.752、0.731和0.742（圖S2B），校準(zhǔn)曲線(xiàn)也證實(shí)諾莫圖的高準(zhǔn)確性（圖S2C）。這些結(jié)果表明，諾莫圖可以應(yīng)用于輔助臨床決策制定，并預(yù)測(cè)HCC患者的總生存期。

   HCC患者生存率的差異可能歸因于腫瘤免疫微環(huán)境的復(fù)雜性。我們分析了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫相關(guān)通路的差異，發(fā)現(xiàn)在TCGA_LIHC隊(duì)列中，特別是被歸為高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中，樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著增加（p < 0.05）（圖S2D），而B(niǎo)細(xì)胞、肥大細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞亞群則顯著下調(diào)（p < 0.05）（圖S2D）。在免疫相關(guān)通路方面，高風(fēng)險(xiǎn)組中檢查點(diǎn)和主要組織相容性復(fù)合體I類(lèi)分子的表達(dá)顯著增加（p < 0.05），而I型和II型干擾素反應(yīng)則顯著降低（p < 0.05）（圖S2E）。進(jìn)一步研究高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫亞型的差異發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞耗竭樣本的分布在兩組之間相對(duì)平衡。然而，低風(fēng)險(xiǎn)組中炎癥樣本的頻率更高，與之相比，高風(fēng)險(xiǎn)組中以愈合傷口和干擾素-γ主導(dǎo)的樣本更為常見(jiàn)（圖S2F）。

   此外，在兩組之間對(duì)化療藥物的反應(yīng)也存在顯著差異。高風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)多西他賽和吉非替尼的IC50值顯著更高，表明對(duì)這些藥物的耐藥性更強(qiáng)。相反，高風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)吉西他濱和伊馬替尼的IC50值較低，意味著對(duì)這些藥物更敏感（圖S2G）?？傊?，從ARGs特征得出的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分能夠預(yù)測(cè)HCC患者的生存率以及對(duì)化療藥物的反應(yīng)。

6、RAC3上調(diào)與HCC患者的腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)

   隨后，我們發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)模型中五個(gè)ARGs的mRNA和蛋白水平在HCC組織中顯著高于相鄰正常組織（圖S3A、B）。此外，這五個(gè)ARGs表達(dá)的增加與總生存（OS）的降低顯著相關(guān)（圖S3C）。然而，只有RAC3與無(wú)病生存（DFS）的降低在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著相關(guān)（p=0.026）（圖S3D）。因此，我們接下來(lái)專(zhuān)注于RAC3在HCC發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

   RAC家族包括RAC1、RAC2和RAC3，其中RAC3在HCC中與相鄰正常組織相比顯著上調(diào)（p < 0.001，3.3倍）（圖S4A）。此外，在TCGA泛癌分析中，如膀胱癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CESC）、結(jié)腸癌（COAD）、食管癌（ESCA）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）、腎上腺皮質(zhì)癌（PCPG）、前列腺癌（PRAD）、胃癌（STAD）和子宮內(nèi)膜癌（UCEC）等腫瘤組織中也觀察到RAC3的顯著上調(diào)（圖S4B）。相比之下，RAC3在腎透明細(xì)胞癌（KICH）、腎癌（KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）和甲狀腺癌（THCA）的腫瘤組織中表達(dá)顯著降低（圖S4B）。此外，與低RAC3表達(dá)相比，高RAC3表達(dá)與膀胱癌、KIRC、肉瘤和甲狀腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)，但在乳腺癌和胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）患者中則與更長(zhǎng)的生存期相關(guān)（圖S4C）。

   我們基于GSE14520、GSE22058和ICGC_LIRI數(shù)據(jù)集對(duì)RAC3表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果證實(shí)RAC3 mRNA在HCC組織中顯著高于相鄰正常組織（圖3A）。此外，通過(guò)UALCAN對(duì)CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示，與相鄰正常組織相比，HCC組織中RAC3蛋白顯著上調(diào)（圖3B）。Kaplan–Meier繪圖分析顯示，RAC3高表達(dá)與HCC患者的預(yù)后不良相關(guān)，尤其是在II期和AJCC_T2期患者中（表S2，圖S5）。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，RAC3可以作為HCC患者的有希望的預(yù)后生物標(biāo)志物。

   隨后，我們通過(guò)qRT-PCR和西方印跡分析評(píng)估五種HCC細(xì)胞系中RAC3的表達(dá)水平（圖3C、D）。研究發(fā)現(xiàn)，RAC3在HCCLM3和HLE細(xì)胞中表達(dá)顯著，而在MHCC97H和Huh-7細(xì)胞中表達(dá)較低。此外，我們還對(duì)包含89對(duì)HCC腫瘤及其相鄰正常組織的HCC組織微陣列進(jìn)行了免疫組化染色，以檢測(cè)RAC3的表達(dá)。同樣，我們觀察到RAC3在HCC組織中的表達(dá)顯著高于匹配的正常組織（圖3E、F）。RAC3蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性分析顯示，高RAC3表達(dá)與大于3厘米的腫瘤（p=0.049）、腫瘤復(fù)發(fā)（p=0.034）和總生存期（OS）（p=0.001）之間存在顯著關(guān)聯(lián)（表1）。單變量分析進(jìn)一步表明，腫瘤大小（p=0.016）、腫瘤分級(jí)（p=0.027）、腫瘤包膜完整性（p=0.045）、TNM分期（p=0.006）和RAC3表達(dá)（p=0.005）與OS顯著相關(guān)（表S3）。我們進(jìn)一步進(jìn)行多變量Cox回歸分析，納入單變量分析中有顯著意義的變量，結(jié)果證實(shí)RAC3蛋白表達(dá)是OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（p=0.044）（表S4）。Kaplan–Meier生存曲線(xiàn)顯示，RAC3蛋白表達(dá)越高，預(yù)后越差（p=0.002）（圖3G），累積無(wú)復(fù)發(fā)生存率越高（p=0.044）（圖3H）。總之，這些結(jié)果表明，RAC3表達(dá)的升高在HCC的惡性程度和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。

圖3：RAC3在HCC組織中的表達(dá)和預(yù)后意義

7、RAC3促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性表型

   基于TCGA_LIHC的GSEA富集分析顯示，RAC3表達(dá)與凋亡（ES=0.54，p=0.00）、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（ES=0.68，p=0.00）和細(xì)胞黏附分子CAMs（ES=0.62，p=0.00）呈正相關(guān)（圖S6A），表明其在抗凋亡抵抗中的潛在功能。此外，為評(píng)估RAC3在HCC中的作用，我們?cè)贖uh-7細(xì)胞系中建立了穩(wěn)定的RAC3過(guò)表達(dá)，并在HCCLM3和HLE細(xì)胞系中進(jìn)行RAC3敲低。RAC3的敲低顯著抑制體外細(xì)胞增殖和侵襲，而RAC3的過(guò)表達(dá)則促進(jìn)這些行為（圖4A、B）。此外，我們?cè)贖CCLM3細(xì)胞系中建立穩(wěn)定的RAC3敲低（圖S6B），并發(fā)現(xiàn)RAC3的敲低抑制細(xì)胞增殖和侵襲（圖S6C、D）。凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，RAC3抑制后凋亡率顯著增加（圖4C）。

   然后，我們構(gòu)建一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移模型，將穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的MHCC97H或HCCLM3細(xì)胞（RAC3穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或沉默）通過(guò)尾靜脈注射到NCG（NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt）小鼠中。我們發(fā)現(xiàn)，RAC3過(guò)表達(dá)使肺部的熒光素酶強(qiáng)度顯著增加，而RAC3敲低則使其降低（圖4D）。裸鼠皮下接種穩(wěn)定過(guò)表達(dá)RAC3的Huh-7細(xì)胞和穩(wěn)定敲低RAC3的HCCLM3細(xì)胞。如圖4E所示，RAC3過(guò)表達(dá)顯著增加第21天的腫瘤質(zhì)量。相反，RAC3敲低顯著降低第14天的皮下腫瘤形成。免疫組化分析證實(shí)，在RAC3過(guò)表達(dá)的腫瘤組織中檢測(cè)到高表達(dá)的Ki-67，而在RAC3敲低組中則相反（圖S7A、B）。

   此外，qRT-PCR分析顯示，RAC3的敲低導(dǎo)致抗凋亡標(biāo)志物（包括Bcl-2、SNAI1、NFKB1和TWIST1）的表達(dá)降低，而在RAC3過(guò)表達(dá)的Huh-7細(xì)胞中則相反（圖4F）。最后，西方印跡分析顯示，RAC3的敲低導(dǎo)致增殖標(biāo)志物PCNA、抗凋亡標(biāo)志物Bcl-2的表達(dá)降低，以及caspase介導(dǎo)的凋亡增加，而在RAC3過(guò)表達(dá)的Huh-7細(xì)胞中則相反（圖4G）?？傊琑AC3在啟動(dòng)和促進(jìn)HCC中起著關(guān)鍵作用。

圖4：RAC3促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性表型 

8、RAC3通過(guò)上調(diào)NNMT激活cAMP/MAPK/Rap1信號(hào)傳導(dǎo)

   為探索RAC3促進(jìn)HCC進(jìn)展的機(jī)制，我們進(jìn)行RNA測(cè)序結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以確定RAC3調(diào)控的基因。在RAC3過(guò)表達(dá)后，有236個(gè)基因和27個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)，而226個(gè)基因和35個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)（圖5A、B）。代表性DEGs以熱圖形式展示（圖5C、D）。基于RNA-seq數(shù)據(jù)的KEGG分析顯示，Rap1信號(hào)通路（p=3.16e-2）、MAPK信號(hào)通路（p=3.14e-2）和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（p=5.71e-3）顯著富集（圖5E）。基于蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的KEGG分析顯示，cAMP信號(hào)通路（p=1.70e-2）、趨化因子信號(hào)通路（p=3.92e-2）和MAPK信號(hào)通路（p=5.02e-2）顯著富集（圖5F）。此外，我們對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)中的462個(gè)DEGs和蛋白質(zhì)組中的62個(gè)DEGs進(jìn)行交集分析，發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因（GBP1、NAT1和NNMT）共同被RAC3過(guò)表達(dá)上調(diào)（圖5G）。隨后，我們通過(guò)qRT-PCR對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，NNMT在RAC3過(guò)表達(dá)下的上調(diào)最為顯著，考慮到p值和倍數(shù)變化（圖5H）。先前的研究表明，NNMT在HCC中表達(dá)上調(diào)，能夠增強(qiáng)HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與預(yù)后不良相關(guān)。此外，NNMT還被報(bào)道能夠增強(qiáng)結(jié)直腸癌對(duì)ROS誘導(dǎo)凋亡的抵抗。因此，我們假設(shè)NNMT可能作為RAC3介導(dǎo)的HCC進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過(guò)cAMP/MAPK/Rap1信號(hào)通路發(fā)揮作用。

   為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們建立一個(gè)原位肝HCC模型，通過(guò)原位注射穩(wěn)定過(guò)表達(dá)熒光素酶和RAC3的MHCC97H細(xì)胞，并敲除NNMT。我們發(fā)現(xiàn)，NNMT的敲除逆轉(zhuǎn)了RAC3在促進(jìn)HCC生長(zhǎng)中的作用（圖5I、J），并抑制RAC3過(guò)表達(dá)HCC組織中Ki67和Bcl-2的表達(dá)（圖S8A、B）。此外，我們還進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證NNMT敲除在體外增加了RAC3過(guò)表達(dá)HCC細(xì)胞的凋亡（圖5K）。此外，我們驗(yàn)證三種NNMT siRNAs的效率，并選擇si1-NNMT進(jìn)行NNMT拯救實(shí)驗(yàn)（圖S8C）。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)RAC3過(guò)表達(dá)在HCC細(xì)胞中上調(diào)的PRKACB（cAMP信號(hào)的關(guān)鍵分子）、p-ERK/ERK（MAPK信號(hào)的關(guān)鍵分子）和Rap1b（Rap1信號(hào)的關(guān)鍵分子）可以通過(guò)NNMT敲除被抑制（圖5L）。此外，西方印跡分析還表明，抗凋亡和EMT標(biāo)志物被RAC3過(guò)表達(dá)激活，這一作用可以被NNMT敲除所抵消（圖5L）?？傊?，這些結(jié)果表明，RAC3可能作為腫瘤促進(jìn)因子，通過(guò)NNMT激活cAMP/MAPK/Rap1信號(hào)通路，從而驅(qū)動(dòng)肝癌的發(fā)生和HCC的惡性程度。

圖5：RAC3通過(guò)上調(diào)NNMT激活cAMP/MAPK/Rap1信號(hào)傳導(dǎo)

9、RAC3與SOX6轉(zhuǎn)錄激活NNMT相互作用

   據(jù)報(bào)道，RAC3通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子相互作用間接激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，我們假設(shè)RAC3可能作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，增強(qiáng)NNMT的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)HCC的進(jìn)展。因此，我們?cè)谶^(guò)表達(dá)RAC3的Huh-7細(xì)胞中進(jìn)行了共免疫沉淀（Co-IP）結(jié)合質(zhì)譜分析，以篩選與RAC3相互作用的轉(zhuǎn)錄因子（表S5）。在與RAC3相互作用的蛋白質(zhì)中，SOX6是僅有的被注釋的轉(zhuǎn)錄因子，且通過(guò)Jaspar數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步預(yù)測(cè)為NNMT結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。然后，我們通過(guò)Co-IP在HCC細(xì)胞系中驗(yàn)證了RAC3與SOX6之間的相互作用（圖6A）。由于Jaspar數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有人SOX6的結(jié)合位點(diǎn)，我們預(yù)測(cè)了可能結(jié)合到小鼠NNMT啟動(dòng)子區(qū)域的小鼠SOX6的核心結(jié)合位點(diǎn)（圖6B）。我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)小鼠NNMT啟動(dòng)子的DNA序列與人類(lèi)同源，可能結(jié)合到SOX6（圖6C，圖S9）。我們突變了這兩個(gè)序列（命名為mut 1和mut 2），并設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（target 1和target 2），使用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）-qPCR檢測(cè)這兩個(gè)序列（圖6D）。結(jié)果表明，SOX6可以直接結(jié)合到NNMT啟動(dòng)子（-345/-338 bp）（圖6E）。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，RAC3增強(qiáng)SOX6調(diào)節(jié)的NNMT轉(zhuǎn)錄，這一作用可以通過(guò)NNMT啟動(dòng)子mut1（-345/-338 bp）顯著抑制（圖6F）。總之，RAC3作為SOX6的轉(zhuǎn)錄共激活因子，促進(jìn)NNMT轉(zhuǎn)錄。

圖6：RAC3與SOX6 相互作用以轉(zhuǎn)錄激活 NNMT 

10、靶向RAC3的特異性抑制劑EHop-016抑制HCC進(jìn)展

   我們隨后研究靶向RAC3的干預(yù)效果。據(jù)報(bào)道，小分子抑制劑EHop-016能夠特異性靶向RAC3 GTPase。隨后，我們用不同濃度的EHop-016處理MHCC97H細(xì)胞24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)EHop-016以濃度依賴(lài)的方式抑制RAC3的酶活性和NNMT的表達(dá)（圖7A）。此外，我們基于RAC3、SOX6和EHop-016的三維（3D）結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接，并發(fā)現(xiàn)RAC3與SOX6之間的氫鍵力約為3埃，表明它們之間的結(jié)合很強(qiáng)（圖7B）。此外，EHop-016結(jié)合到RAC3和SOX6的相互作用界面上，表明EHop-016可能通過(guò)抑制RAC3的活性來(lái)破壞它們的相互作用（圖7C）。為進(jìn)一步評(píng)估EHop-016在體內(nèi)的藥效學(xué)，我們建立一個(gè)原位HCC小鼠模型，通過(guò)腹腔注射EHop-016和生理鹽水（NC）（圖7D）。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)EHop-016處理后，肝臟中熒光素酶的強(qiáng)度和熒光素酶陽(yáng)性病變的數(shù)量顯著減少（圖7E-G）?？傊?，EHop-016被確定為一種有效的化合物，可用于靶向HCC治療中的RAC3。

圖7：靶向RAC3的EHop-016抑制HCC進(jìn)展

結(jié)論：

   總之，我們的研究構(gòu)建了一個(gè)由五個(gè)ARGs組成的HCC患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。我們證明該模型具有高靈敏度和高特異性，為HCC患者的預(yù)后提供一個(gè)強(qiáng)有力的新工具。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)RAC3能夠抑制凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，從而推動(dòng)HCC的進(jìn)展，這為HCC的分子機(jī)制提供新的見(jiàn)解。通過(guò)小分子化合物EHop-016靶向RAC3顯示出對(duì)HCC治療的潛在效果。然而，我們的研究仍存在一些局限性：首先，我們將進(jìn)一步收集并擴(kuò)大HCC患者隊(duì)列，以驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)模型的可靠性；其次，NNMT介導(dǎo)的RAC3激活通路的分子機(jī)制尚未完全明確。

參考文獻(xiàn)：

Wu D, Liu ZK, Sun Y, Gou CH, Shang RZ, Lu M, Zhang RY, Wei HL, Li C, Shi Y, Zhang C, Wang YT, Wei D, Chen ZN, Bian H. Integrated Analysis of the Anoikis-Related Signature Identifies Rac Family Small GTPase 3 as a Novel Tumor-Promoter Gene in Hepatocellular Carcinoma. MedComm (2020). 2025 Mar 22;6(4):e70125. doi: 10.1002/mco2.70125. PMID: 40123831; PMCID: PMC11928873.