DDX1甲基化介導(dǎo)的MATR3 剪接通過啟動染色質(zhì)重編程來調(diào)節(jié)椎間盤退化

   下腰痛（LBP）主要由椎間盤退變（IVDD）驅(qū)動，已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的核心挑戰(zhàn)。RNA結(jié)合蛋白DDX1在RNA代謝中起關(guān)鍵作用，但其在IVDD中的功能尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)DDX1是甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的底物，EZH2對DDX1第234位賴氨酸（K234）的甲基化修飾可促進(jìn)體外和體內(nèi)IVDD進(jìn)程。抑制EZH2能恢復(fù)髓核（NP）細(xì)胞的基質(zhì)穩(wěn)態(tài)并延緩IVDD發(fā)展。DDX1 K234位點(diǎn)的甲基化會破壞其與剪接因子及RNA靶標(biāo)的相互作用，導(dǎo)致MATR3基因外顯子14跳躍。由此產(chǎn)生的截短型MATR3會破壞核結(jié)構(gòu)、增加染色質(zhì)可及性，進(jìn)而激活Wnt等信號通路，引發(fā)NP細(xì)胞衰老和凋亡。值得注意的是，通過陽離子脂質(zhì)納米顆粒遞送過表達(dá)MATR3-L的mRNA可顯著減輕NP細(xì)胞退變并有效緩解IVDD，這為IVDD的發(fā)病機(jī)制研究和潛在治療策略提供了重要依據(jù)。該研究于2025年7月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：15.7。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.椎間盤退變過程中髓核細(xì)胞DDX1的K234甲基化水平升高

   為探究賴氨酸甲基化調(diào)控的關(guān)鍵非組蛋白[17]，本研究獲取腰椎骨折、特發(fā)性脊柱側(cè)凸或IVDD患者的非退變與退變髓核組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，裂解后采用泛賴氨酸甲基化抗體孵育，并通過LC-MS/MS進(jìn)行組分分析（圖1A）?；贛RI影像的Pfirrmann分級評估顯示：隨著IVDD進(jìn)展，T2加權(quán)像的高信號白色區(qū)域逐漸減少并呈現(xiàn)異質(zhì)性，最終被高信號黑色區(qū)域取代，提示髓核組織退變[18]。培養(yǎng)基中水分含量下降而纖維化程度增加，番紅O-固綠染色進(jìn)一步證實退變髓核組織的表型變化——基質(zhì)降解、鈣化、軟骨樣增生及細(xì)胞簇狀聚集現(xiàn)象在嚴(yán)重退變組（IV級）尤為顯著[19]（附圖1A）。免疫組化結(jié)果顯示退變髓核組織中Ⅱ型膠原陽性（合成代謝）細(xì)胞減少，而MMP3表達(dá)（分解代謝）細(xì)胞相應(yīng)增加（附圖1B、E）。值得注意的是，質(zhì)譜分析在退變髓核組織中特異性鑒定出DDX1衍生肽段，其SPRY結(jié)構(gòu)域（231-240aa）內(nèi)進(jìn)化保守的賴氨酸殘基（K234）存在甲基化修飾（附圖1C）。鑒于SPRY結(jié)構(gòu)域的功能重要性，該位點(diǎn)甲基化可能具有生物學(xué)意義。LC-MS證實K234為單甲基化修飾（圖1B），且該位點(diǎn)在多個物種DDX1蛋白中高度保守（附圖1D），暗示其潛在功能價值。在髓核細(xì)胞和HEK-293T工具細(xì)胞中均檢測到K234甲基化（圖1C、D，附圖1F）。由于DDX1作為RNA結(jié)合蛋白，其功能可能受賴氨酸甲基化調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)信號通路和基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

   為研究氧化應(yīng)激損傷是否導(dǎo)致DDX1 K234甲基化差異表達(dá)[20]，我們采用叔丁基過氧化物（TBHP）處理髓核細(xì)胞構(gòu)建體外退變模型。TBHP處理后，Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖表達(dá)下降，而MMP3和ADAMTS5呈現(xiàn)相反趨勢（附圖1H、I）。免疫熒光顯示TBHP處理的髓核細(xì)胞中Ⅱ型膠原陽性信號減少、MMP3增加（圖1E，附圖1G），證實該模型能模擬IVDD的退變特征[21,22]。值得注意的是，TBHP處理的髓核細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞中DDX1 K234甲基化水平顯著升高（圖1F，附圖1J）。為進(jìn)一步驗證，我們將SPRY結(jié)構(gòu)域第234位賴氨酸替換為精氨酸構(gòu)建DDX1突變體[23,24]——精氨酸（R）在保留正電荷的同時可阻斷甲基化，從而模擬非甲基化蛋白狀態(tài)。在TBHP處理的HEK-293T細(xì)胞中，DDX1 K234R突變體始終未檢測到甲基化（圖1G）。這些結(jié)果共同證實SPRY結(jié)構(gòu)域Lys234是DDX1特異的甲基化位點(diǎn)，且與髓核細(xì)胞退變密切相關(guān)。

   鑒于K234甲基化是通過非偏向性質(zhì)譜分析鑒定的內(nèi)源性修飾，我們進(jìn)一步探究其單甲基化如何影響DDX1功能并促進(jìn)IVDD。為驗證SPRY結(jié)構(gòu)域甲基化的生物學(xué)效應(yīng)，我們在DDX1敲低的髓核細(xì)胞中外源性表達(dá)野生型DDX1（WT）和甲基化缺陷突變體（K234R）。與對照組（siControl）相比，DDX1敲除可逆轉(zhuǎn)TBHP誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞合成代謝下降與分解代謝升高；而重新表達(dá)DDX1（而非K234R突變體）則顯著加劇TBHP誘導(dǎo)的細(xì)胞退變（附圖1K、L）。為避免脫靶效應(yīng)，我們通過Western blot驗證了另一種siDDX1在髓核細(xì)胞中的敲低效率（附圖2B、C），同時檢測到DDX1 WT和K234R突變體的重新過表達(dá)量均達(dá)到對照組的約兩倍。

   為探究賴氨酸甲基化的體內(nèi)作用，我們建立了SD大鼠針穿刺誘導(dǎo)的IVDD動物模型[25,26]。通過攜帶DDX1靶向shRNA的慢病毒（shDDX1-LV）在體內(nèi)敲低DDX1后，每周向尾椎間盤髓核區(qū)注射shRNA抗性的DDX1 WT-LV或DDX1 K234R-LV，持續(xù)4周[27]（圖1H、J）。X射線和CT分析顯示，shDDX1-LV顯著緩解尾椎間盤狹窄和軟骨下骨破壞，而重新表達(dá)DDX1-LV（非K234R-LV）會導(dǎo)致椎間盤高度進(jìn)一步喪失（圖1K、L）。更敏感的MRI檢測顯示，DDX1敲低組尾椎間盤T2加權(quán)信號增強(qiáng)[28]，表明椎間盤水分得以保留；而重新表達(dá)野生型（非精氨酸突變體）則導(dǎo)致水分減少（圖1M）。HE和SO&FG染色證實，慢病毒介導(dǎo)的DDX1缺失可緩解椎間盤退變表型——改善退變椎間盤中紊亂的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、纖維環(huán)（AF）與髓核的模糊界面，并減少纖維環(huán)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤（圖1I、N、O，附圖1M）。免疫組化顯示shDDX1-LV組椎間盤Ⅱ型膠原增加而MMP3減少，提示IVDD進(jìn)程被抑制（附圖1N、O）。值得注意的是，重新注射DDX1 WT-LV（非K234R-LV）會導(dǎo)致髓核組織萎縮、髓核與纖維環(huán)邊界模糊、基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，并加速尾椎間盤進(jìn)行性退變（圖1I）。此外，野生型DDX1的重新表達(dá)（非K234R突變體）還引起Ⅱ型膠原陽性髓核細(xì)胞減少和MMP3陽性細(xì)胞增加（附圖1N、O）。通過免疫組化驗證另一種shDDX1-LV在椎間盤中的敲低效率以排除脫靶效應(yīng)（附圖2H、I），同時檢測到DDX1 K234R-LV按預(yù)期實現(xiàn)過表達(dá)（約為對照組的2倍）。這些結(jié)果共同證實，DDX1 K234甲基化可能通過誘導(dǎo)髓核退變在體內(nèi)外促進(jìn)IVDD進(jìn)展。

圖1.椎間盤退變過程中髓核細(xì)胞DDX1的K234甲基化水平升高

2.DDX1通過EZH2介導(dǎo)的賴氨酸234位點(diǎn)甲基化

   為鑒定調(diào)控該修飾的生理性甲基轉(zhuǎn)移酶，我們在HEK-293T細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀（Co-IP）實驗篩選DDX1互作蛋白。根據(jù)豐度>10且P值<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，確定KMT5A、SMYD3、SETD7、EZH2和G9a為候選賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（圖2A、B）。隨后在EZH2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞中，抗DDX1免疫沉淀物顯示出顯著的賴氨酸甲基化信號（圖2C）。通過Flag抗體IP結(jié)合DDX1免疫印跡（IB）分析發(fā)現(xiàn)，EZH2與DDX1的相互作用最強(qiáng)（圖2D）。

   EZH2在骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中均存在異常激活[29,30]，但其在IVDD中的調(diào)控作用尚不明確。我們發(fā)現(xiàn)，TBHP誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞體外退變模型中，氧化應(yīng)激可顯著上調(diào)EZH2表達(dá)（圖2E、I，附圖2F）。免疫組化顯示退變髓核組織中EZH2陽性細(xì)胞呈梯度增加（圖2G、H），提示IVDD進(jìn)程中髓核細(xì)胞的退變狀態(tài)與EZH2表達(dá)升高相關(guān)。免疫熒光證實TBHP處理的退變髓核細(xì)胞中，DDX1與EZH2在細(xì)胞核內(nèi)共定位（圖2F，附圖2G）。

   進(jìn)一步通過His標(biāo)簽DDX1與GST-EZH2的pull-down實驗驗證了兩者的直接物理結(jié)合（圖2L，附圖2A）。在髓核細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞中，內(nèi)源性與外源性DDX1均能與EZH2強(qiáng)烈互作（圖2J、K、N），表明二者存在直接關(guān)聯(lián)。這種互作提示甲基化調(diào)控的可能性——siEZH2處理的髓核細(xì)胞中，泛甲基化抗體檢測顯示DDX1甲基化水平降低（圖2O）；反之，EZH2過表達(dá)細(xì)胞中DDX1賴氨酸甲基化顯著增強(qiáng)（圖2P）。

   鑒于DDX1在SPRY結(jié)構(gòu)域K234位點(diǎn)發(fā)生單甲基化，我們預(yù)測EZH2的甲基化位點(diǎn)即為此位點(diǎn)。通過將賴氨酸234替換為精氨酸構(gòu)建DDX1突變體，Co-IP結(jié)合抗賴氨酸甲基化抗體證實該突變顯著減弱DDX1甲基化（圖2Q）。值得注意的是，K234R和K234M突變均未影響EZH2與DDX1的相互作用（圖2M），這表明EZH2作為DDX1的甲基轉(zhuǎn)移酶，特異性負(fù)責(zé)其K234位點(diǎn)的甲基化修飾。

圖2.DDX1通過EZH2介導(dǎo)的賴氨酸234位點(diǎn)甲基化

3.EZH2介導(dǎo)的DDX1 K234甲基化促進(jìn)椎間盤退變進(jìn)程

   為探究EZH2依賴性DDX1甲基化在IVDD調(diào)控中的作用，我們在NP/siDDX1細(xì)胞中重新表達(dá)DDX1 WT或K234M突變體。值得注意的是，賴氨酸（K）替換為甲硫氨酸（M）可模擬蛋白質(zhì)的甲基化狀態(tài)[13,14,23]。與對照組相比，EZH2敲低能逆轉(zhuǎn)TBHP誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞合成代謝下降與分解代謝升高；而重新表達(dá)DDX1 K234M突變體（非野生型）則顯著加劇TBHP驅(qū)動的髓核細(xì)胞退變（圖3A-D）。

   為深入解析EZH2依賴性DDX1甲基化在IVDD中的影響，我們采用shEZH2慢病毒敲低SD大鼠體內(nèi)EZH2后，每周向尾椎間盤髓核區(qū)注射DDX1 WT-LV或K234M-LV，持續(xù)4周（圖3E、I）。實驗顯示shEZH2-LV顯著緩解尾椎間盤高度丟失和軟骨下骨破壞，而重新表達(dá)DDX1 K234M-LV（非野生型）會導(dǎo)致椎間盤高度進(jìn)一步喪失（圖3F、G、J）。MRI檢測表明EZH2敲低后椎間盤T2加權(quán)信號增強(qiáng)（提示水分保留），但K234M突變體重表達(dá)（非野生型）則引起水分丟失（圖3H）。HE與SO&FG染色證實，慢病毒介導(dǎo)的EZH2缺失可挽救尾椎間盤退變表型——改善纖維環(huán)與髓核間紊亂的ECM結(jié)構(gòu)及模糊界面，并減少纖維環(huán)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤（圖3K-M）。

   與體內(nèi)結(jié)果一致，shEZH2-LV處理的椎間盤表現(xiàn)為Ⅱ型膠原陽性細(xì)胞增加和MMP3陽性細(xì)胞減少，提示IVDD進(jìn)程被抑制（圖3N、O）。關(guān)鍵的是，重新注射攜帶DDX1 K234M突變體的慢病毒（非野生型）會導(dǎo)致髓核組織萎縮、髓核-纖維環(huán)邊界模糊、ECM結(jié)構(gòu)破壞，并加速尾椎間盤退變（圖3K）。此外，K234M突變體（非野生型）的重表達(dá)會抑制Ⅱ型膠原陽性細(xì)胞而促進(jìn)MMP3陽性細(xì)胞（圖3N、O）。這些結(jié)果證實，EZH2依賴性DDX1甲基化可通過誘導(dǎo)髓核退變在體內(nèi)外促進(jìn)IVDD進(jìn)展。

圖3.EZH2介導(dǎo)的DDX1 K234甲基化促進(jìn)椎間盤退變進(jìn)程

4.DDX1甲基化促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡

   為了闡明DDX1甲基化的功能意義，我們進(jìn)行了mRNA轉(zhuǎn)錄組測序（bulk RNA-seq）分析，比較了正常培養(yǎng)和TBHP培養(yǎng)的NP細(xì)胞，以及重新表達(dá)siRNA抗性DDX1 K234M或DDX1 K234R突變的NP/siDDX1和HEK-293T/siDDX1細(xì)胞的基因集合（圖4A）（補(bǔ)充數(shù)據(jù)1）。與對照組相比，在TBHP培養(yǎng)的NP細(xì)胞中共鑒定出3205個下調(diào)基因和3618個上調(diào)基因（補(bǔ)充圖3A）。與DDX1 K234R相比，在DDX1 K234M組的HEK-293T細(xì)胞中確定了217個下調(diào)基因和172個上調(diào)基因（補(bǔ)充圖3B、D）。與DDX1 K234R組相比，在DDX1 K234M組的NP細(xì)胞中鑒定出349個下調(diào)基因（P < 0.05）和486個上調(diào)基因（P < 0.05）（補(bǔ)充圖3C）。綜合分析顯示，正常NP細(xì)胞中66個上調(diào)基因在過表達(dá)DDX1 K234R的NP和HEK-293T細(xì)胞中重疊（補(bǔ)充圖3E），TBHP處理的細(xì)胞中71個上調(diào)基因在過表達(dá)DDX1 K234M的NP和HEK-293T細(xì)胞中重疊（補(bǔ)充圖3F）。隨后，GSEA揭示了細(xì)胞衰老和凋亡通路與TBHP處理的NP細(xì)胞退行性表型之間的明確相關(guān)性（圖4B）。有趣的是，GSEA表明DDX1 K234M過表達(dá)同樣調(diào)控了細(xì)胞衰老和凋亡信號通路（圖4C，補(bǔ)充圖4A、C）。GO分析顯示，DDX1 K234M介導(dǎo)的基因富集于有絲分裂細(xì)胞周期、凋亡調(diào)控、G2/M轉(zhuǎn)換、細(xì)胞增殖和分裂（圖4D，補(bǔ)充圖4B、D）。先前的研究已在多種細(xì)胞類型（包括NP細(xì)胞）中鑒定出數(shù)百至數(shù)千個衰老和凋亡相關(guān)基因。其中，與對照組相比，TBHP刺激的NP細(xì)胞中有29個經(jīng)典的衰老和凋亡相關(guān)基因表達(dá)升高（圖4E）。值得注意的是，這些基因（AIFM1、TNFRSF10A、RELA、BAX、BCL2L1）的表達(dá)水平在NP/siDDX1細(xì)胞和HEK-293T/siDDX1細(xì)胞中重新表達(dá)siRNA抗性DDX1 K234M與DDX1 K234R相比具有相似的趨勢（圖4F，補(bǔ)充圖4E）（補(bǔ)充數(shù)據(jù)2）。這些結(jié)果表明，高水平的DDX1 K234甲基化可能在NP細(xì)胞中發(fā)揮促衰老和促凋亡作用。

   與此一致，我們接下來通過Annexin V-FITC/碘化丙啶-PE染色和流式細(xì)胞術(shù)（FC）檢測了DDX1 K234甲基化介導(dǎo)的NP細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，與對照組相比，siDDX1在體外顯著抑制了NP細(xì)胞凋亡。然而，重新表達(dá)siRNA抗性的正常DDX1（而非K234R突變體）明顯加劇了TBHP誘導(dǎo)的NP細(xì)胞凋亡（圖4G、J，補(bǔ)充圖4G）。HEK-293T細(xì)胞中也觀察到類似現(xiàn)象（圖4H、J）。

   進(jìn)一步通過TUNEL和P53染色發(fā)現(xiàn)：DDX1敲低可抑制TBHP刺激的NP細(xì)胞衰老與凋亡，而重新表達(dá)野生型DDX1（非K234R突變體）會促進(jìn)這兩個過程（補(bǔ)充圖3H、K）。Western blot分析顯示，DDX1失活降低了CASP3和Bax水平，同時增加Bcl-2表達(dá)；而過表達(dá)野生型DDX1（非K234R突變體）則產(chǎn)生相反效應(yīng)（補(bǔ)充圖3G、I）。

   此外，siRNA敲低DDX1減少了TBHP刺激NP細(xì)胞中SA-β-gal染色陽性率，而過表達(dá)野生型DDX1（非K234R突變體）增加了SA-β-gal陽性細(xì)胞，表明DDX1甲基化促進(jìn)溶酶體衰老活性（圖4I，補(bǔ)充圖4F）。蛋白水平分析進(jìn)一步證實，與突變體相比，轉(zhuǎn)染野生型DDX1的NP細(xì)胞中衰老相關(guān)蛋白表達(dá)增加（補(bǔ)充圖3J、L）。

圖4. DDX1甲基化促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡

5.甲基化導(dǎo)致DDX1在RNA上的結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組減少

   為了構(gòu)建賴氨酸甲基化介導(dǎo)的DDX1-RNA相互作用的基因組圖譜，我們在正常和TBHP處理的髓核細(xì)胞中對正常和甲基化DDX1進(jìn)行了RNA免疫沉淀結(jié)合新一代測序（RIP-seq）[33]。對照RIP組共獲得6,724,986條reads，而TBHP-RIP組獲得5,783,158條reads。值得注意的是，Ctrl-RIP組中93.75%的reads和TBHP-RIP組中95.86%的reads被比對到注釋的人類基因組上。由于RNA降解，可能無法在轉(zhuǎn)錄本上獲得reads的均勻分布，這表明與非結(jié)合位點(diǎn)相比，蛋白質(zhì)在其直接結(jié)合位點(diǎn)相對富集，這也使得RIP-seq可以通過peak calling進(jìn)行分析。peak分布分析顯示DDX1在外顯子、3'UTR和5'UTR區(qū)域富集（圖5A、B），最高富集位于外顯子5'UTR末端附近（圖5C、G）。RIP-seq共在對照組和退變組髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本中分別鑒定出22,477和10,517個DDX1富集peak（排除了轉(zhuǎn)錄本自發(fā)表達(dá)減少引起的誤差）（圖5D）。隨后使用RPKM對基因表達(dá)進(jìn)行定量。聚類分析顯示，與未甲基化DDX1相比，甲基化DDX1結(jié)合的注釋人類基因數(shù)量減少了約2000個（圖5E）?？紤]到非特異性序列結(jié)合[34]，蛋白質(zhì)-RNA相互作用位點(diǎn)分析表明，相對于TBHP-RIP，Ctrl-RIP在共享結(jié)合區(qū)域表現(xiàn)出更強(qiáng)的富集（圖5F、G）。RIP-seq與RNA-seq數(shù)據(jù)的相關(guān)性探索進(jìn)一步表明，DDX1優(yōu)先結(jié)合在外顯子-內(nèi)含子連接處附近，特別是在3'和5'剪接位點(diǎn)周圍，其結(jié)合強(qiáng)度受賴氨酸甲基化調(diào)節(jié)（圖5H）。

   為闡明DDX1富集峰的功能意義，GO分析顯示甲基化介導(dǎo)的DDX1差異靶基因主要定位于細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)及核仁區(qū)域，這些基因通過結(jié)合多種底物在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞分裂及細(xì)胞周期等過程中顯著富集（圖5I、J、M）。為進(jìn)一步解析DDX1-RNA相互作用，采用HOMER算法鑒定了DDX1結(jié)合的RNA基序，發(fā)現(xiàn)AGUGGAA七聚體[35]是最顯著富集的元件（圖5K、L、P）。值得注意的是，超過81.5%的這些基序位于外顯子和內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)（圖5N）。在得分最高的四個基序中，基序1和4富集于5'剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子-外顯子連接處附近，而基序2和3則定位于外顯子內(nèi)部（圖5O）。這些結(jié)果共同表明賴氨酸甲基化會減弱DDX1與前mRNA底物的直接結(jié)合能力。

圖5. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示ASH1L調(diào)控轉(zhuǎn)移性骨微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可塑性

6.甲基化DDX1減少剪接因子招募并促進(jìn)MATR3外顯子14跳躍

   為探究DDX1調(diào)控的可變剪接（AS），我們對正常和TBHP處理的NP細(xì)胞、以及重新表達(dá)siRNA抗性DDX1 K234M和K234R突變的HEK-293T/siDDX1與NP/siDDX1細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。AS變異事件包括外顯子跳躍（SE）、內(nèi)含子保留（RI）、5'和3'位點(diǎn)選擇性切換（A5SS和A3SS）以及外顯子互斥（MEX）表達(dá)模式（圖6A）。在TBHP處理的NP細(xì)胞中，外顯子跳躍事件占主導(dǎo)（72%），而在過表達(dá)DDX1 K234M的HEK-293T細(xì)胞和NP細(xì)胞中分別降至68%和67%（圖6B，補(bǔ)充圖5A）。值得注意的是，兩類基因譜中第二常見的AS事件均為占比相同（17%）的互斥外顯子。總體而言，NP細(xì)胞與HEK-293T細(xì)胞中各類AS事件比例相似。

   通過整合DDX1結(jié)合基因與SE相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組及RIP數(shù)據(jù)，我們篩選出與椎間盤退變（IVDD）相關(guān)的功能靶點(diǎn)。綜合分析顯示，僅六個外顯子跳躍基因在TBHP處理的NP細(xì)胞、以及過表達(dá)DDX1 K234M的NP和HEK-293T細(xì)胞中與DDX1結(jié)合存在重疊（圖6C）（補(bǔ)充數(shù)據(jù)3）。鑒于RNA-seq結(jié)合功能實驗已證實DDX1賴氨酸甲基化通過激活衰老和凋亡信號通路導(dǎo)致NP細(xì)胞退變，同時基于RIP-seq的GO分析發(fā)現(xiàn)DDX1靶基因富集于核周區(qū)域的生物學(xué)過程（BP），如DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞分裂與周期調(diào)控（圖5I，J）。

   在DDX1結(jié)合且發(fā)生可變剪接的轉(zhuǎn)錄本中，核基質(zhì)蛋白編碼基因MATR3（Matrin3）引起了我們的關(guān)注。Matrin3蛋白在細(xì)胞核內(nèi)具有維持核基質(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、參與mRNA代謝、DNA修復(fù)及凋亡調(diào)控等關(guān)鍵功能，其異?？赡芗觿《喾N疾病發(fā)生發(fā)展。RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，TBHP處理和DDX1 K234M過表達(dá)（NP與HEK-293T細(xì)胞）均促進(jìn)外顯子14跳躍，產(chǎn)生更短的MATR3亞型（MATR3-S）。RIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示DDX1結(jié)合于MATR3外顯子14鄰近區(qū)域，證實MATR3是DDX1的直接靶標(biāo)（圖6D，E；補(bǔ)充圖5C，D）。

   序列分析表明，外顯子14跳躍導(dǎo)致讀碼框移位但未引入提前終止密碼子，提示該亞型通過結(jié)構(gòu)而非表達(dá)量變化影響功能（圖6F）。使用亞型特異性引物檢測發(fā)現(xiàn)，TBHP處理顯著降低NP細(xì)胞中MATR3-L/MATR3-S比值，DDX1 K234M過表達(dá)產(chǎn)生相同效應(yīng)（圖6G，補(bǔ)充圖5B）。半定量RT-PCR證實TBHP處理增加外顯子14跳躍率，生成更多MATR3-S而減少全長亞型，該現(xiàn)象在DDX1 K234M過表達(dá)組中同樣存在（圖6H，補(bǔ)充圖5E）。這些結(jié)果共同證實DDX1通過直接結(jié)合pre-mRNA調(diào)控MATR3可變剪接。

   為闡明DDX1調(diào)控可變剪接（AS）的機(jī)制，我們在過表達(dá)DDX1 K234R和K234M突變的siDDX1/HEK-293T細(xì)胞中，通過DDX1抗體免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜（MS）進(jìn)行分析。GO富集分析顯示，DDX1互作蛋白顯著富集于剪接體介導(dǎo)的mRNA剪接及RNA剪接調(diào)控相關(guān)通路（圖6I）。與甲基化DDX1相比，正常DDX1中多種RNA剪接因子（如HNRNPA2B1、RBM26和SF3B2）豐度更高（圖6J，補(bǔ)充圖5F-H）。已知DDX1互作蛋白HNRNPK2和DHX36在兩種條件下均被富集，驗證了數(shù)據(jù)可靠性（圖6J）。

   RNA解旋酶通過水解ATP獲得能量來解開RNA雙鏈或二級結(jié)構(gòu)。通過檢測反應(yīng)體系中ATP的消耗速率，可間接評估解旋酶活性或RNA結(jié)合蛋白對解鏈過程的調(diào)控作用。K234R和K234M突變體對非特異性結(jié)合RNA探針的解旋酶活性無影響，但DDX1 K234M與MATR3的相互作用較野生型（WT）和K234R顯著減弱（補(bǔ)充圖5I）。值得注意的是，基于GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，DDX1 K234R鄰近蛋白在mRNA剪接通路中呈現(xiàn)更高富集度（圖6K-M），而rRNA加工相關(guān)蛋白在K234R與K234M間無顯著差異，表明DDX1與剪接調(diào)控因子的相互作用獨(dú)立于其解旋酶活性。這些結(jié)果共同證明，甲基化通過阻礙DDX1招募mRNA加工相關(guān)蛋白來調(diào)控可變剪接過程

圖6.甲基化DDX1減少剪接因子招募并促進(jìn)MATR3外顯子14跳躍

7.MATR3-S通過觸發(fā)染色質(zhì)過度開放參與衰老和凋亡區(qū)域調(diào)控

   為評估MATR3外顯子14跳躍的功能意義，我們通過ATAC-seq檢測了過表達(dá)MATR3-L（含外顯子14）或MATR3-S（缺失外顯子14）的NP細(xì)胞基因組染色質(zhì)可及性。兩種NP細(xì)胞的ATAC-seq數(shù)據(jù)集均顯示約200 bp的相似片段長度，雙峰分布提示存在不同的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或特定DNA序列區(qū)域（圖7A）。與轉(zhuǎn)錄研究一致，過表達(dá)MATR3-S的NP細(xì)胞染色質(zhì)peak變化數(shù)量顯著多于MATR3-L組，且MATR3-L組人類NP細(xì)胞中重復(fù)元件的ATAC peak信號較弱，表明其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)更為致密（圖7B，補(bǔ)充圖6A）?；诳杉叭旧|(zhì)peak的主成分分析（PCA）和相關(guān)分析明確區(qū)分了兩類NP細(xì)胞（補(bǔ)充圖6B、C）。染色質(zhì)peak主要定位于內(nèi)含子、外顯子、啟動子和遠(yuǎn)端區(qū)域（通常包含增強(qiáng)子等非編碼調(diào)控元件）（圖7C）。值得注意的是，NP細(xì)胞中受MATR3亞型變化影響的染色質(zhì)peak幾乎全部位于遠(yuǎn)端區(qū)域（補(bǔ)充圖6D），提示非編碼調(diào)控元件對MATR3亞型變化具有特殊響應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)，MATR3亞型對NP細(xì)胞染色質(zhì)可及性動態(tài)變化具有相反效應(yīng)：隨著MATR3-L增加，多數(shù)動態(tài)染色質(zhì)peak呈現(xiàn)關(guān)閉狀態(tài)；而MATR3-S增加則導(dǎo)致這些peak開放（圖7D-F）。這些數(shù)據(jù)表明，在NP細(xì)胞退變過程中，MATR3-L誘導(dǎo)抑制性染色質(zhì)狀態(tài)，而MATR3-S導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松弛化。網(wǎng)絡(luò)分析揭示W(wǎng)nt通路作為細(xì)胞周期、凋亡和分化等生物過程的核心調(diào)控樞紐，與MAPK通路存在復(fù)雜交叉對話（圖7G）。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）激活后可轉(zhuǎn)位并與轉(zhuǎn)錄因子互作，促進(jìn)Cyclin D1等細(xì)胞周期基因表達(dá)，驅(qū)動細(xì)胞進(jìn)入S期。雖然Wnt/β-catenin通常促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖，但其過度激活在某些條件下可誘導(dǎo)凋亡。

   GO和KEGG分析顯示，過表達(dá)MATR3-S的退變NP細(xì)胞中，衰老與凋亡相關(guān)區(qū)域（包括"應(yīng)激激活的MAPK級聯(lián)"、"Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)"、"Wnt信號通路"及"Wnt介導(dǎo)的細(xì)胞間信號"）的染色質(zhì)可及性普遍升高（圖7I，補(bǔ)充圖6E）。相反，過表達(dá)MATR3-L的正常NP細(xì)胞中，抑制細(xì)胞周期與生長發(fā)育相關(guān)區(qū)域（如"有絲分裂細(xì)胞周期G/M轉(zhuǎn)換"、"細(xì)胞形態(tài)發(fā)生"和"骨骼系統(tǒng)發(fā)育"）的染色質(zhì)可及性顯著降低（圖7J，補(bǔ)充圖6F）。網(wǎng)絡(luò)分析揭示W(wǎng)nt通路作為細(xì)胞周期、凋亡和分化等生物過程的核心調(diào)控樞紐，與MAPK通路存在復(fù)雜交叉對話（圖7G）。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）激活后可轉(zhuǎn)位并與轉(zhuǎn)錄因子互作，促進(jìn)Cyclin D1等細(xì)胞周期基因表達(dá)，驅(qū)動細(xì)胞進(jìn)入S期。雖然Wnt/β-catenin通常促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖，但其過度激活在某些條件下可誘導(dǎo)凋亡。

   GO和KEGG分析顯示，過表達(dá)MATR3-S的退變NP細(xì)胞中，衰老與凋亡相關(guān)區(qū)域（包括"應(yīng)激激活的MAPK級聯(lián)"、"Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)"、"Wnt信號通路"及"Wnt介導(dǎo)的細(xì)胞間信號"）的染色質(zhì)可及性普遍升高（圖7I，補(bǔ)充圖6E）。相反，過表達(dá)MATR3-L的正常NP細(xì)胞中，抑制細(xì)胞周期與生長發(fā)育相關(guān)區(qū)域（如"有絲分裂細(xì)胞周期G/M轉(zhuǎn)換"、"細(xì)胞形態(tài)發(fā)生"和"骨骼系統(tǒng)發(fā)育"）的染色質(zhì)可及性顯著降低（圖7J，補(bǔ)充圖6F）。具體而言，過表達(dá)MATR3-S的NP細(xì)胞呈現(xiàn)以下特征：Wnt通路相關(guān)區(qū)域（如WNT2/3、CTNNB1、GSK3B）染色質(zhì)開放度增加（圖7H、K-N；補(bǔ)充圖6J）；MAPK通路成員（MAPK1/3）調(diào)控區(qū)域可及性上升（圖7K）；促凋亡基因（RIPK1、CASPASE3）調(diào)控元件可及性增強(qiáng)（補(bǔ)充圖6K、M）；細(xì)胞周期相關(guān)基因（如CDK1）染色質(zhì)可及性下降（補(bǔ)充圖6L）。而過表達(dá)MATR3-L的NP細(xì)胞在上述調(diào)控區(qū)域呈現(xiàn)完全相反的染色質(zhì)可及性變化（補(bǔ)充圖6G-I）。這些結(jié)果表明，MATR3不同亞型通過塑造相反的染色質(zhì)景觀，對衰老和凋亡相關(guān)調(diào)控區(qū)域產(chǎn)生拮抗性調(diào)控作用。

圖7. MATR3-S通過觸發(fā)染色質(zhì)過度開放參與衰老和凋亡區(qū)域調(diào)控

8.陽離子LNP遞送MATR3-L mRNA有效延緩椎間盤退變進(jìn)程

   鑒于MATR3核苷酸序列較長且可行包裝方案有限，結(jié)合脂質(zhì)納米顆粒（LNP）在相鄰細(xì)胞間側(cè)向轉(zhuǎn)運(yùn)中的優(yōu)異性能，我們基于微流控技術(shù)構(gòu)建了過表達(dá)MATR3-L或MATR3-S的陽離子脂質(zhì)LNP（補(bǔ)充圖7A）。微流控技術(shù)通過精確分配納升級體積、以軸向擴(kuò)散混合為主及低體積連續(xù)操作等特性，可有效控制粒徑并生成多種LNP類型。該體系中：DOTAP通過靜電相互作用直接結(jié)合細(xì)胞表面，膽固醇增強(qiáng)脂質(zhì)穩(wěn)定性，DOPE提高核酸遞送效率，聚乙二醇（PEG）則通過限制血漿蛋白結(jié)合與非特異性攝取延長體內(nèi)循環(huán)半衰期。

   為構(gòu)建功能性mRNA轉(zhuǎn)錄本，我們制備了含MATR3基因的DNA載體。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中MATR3-L長度約2544個核苷酸，MATR3-S約2385個核苷酸，與預(yù)測長度一致。透射電鏡（TEM）顯示MATR3-L-LNP、MATR3-S-LNP及空載體LNP均呈分散良好的不規(guī)則球形或杯狀形態(tài)，與其粒徑分布相符（圖8A）。為評估m(xù)RNA轉(zhuǎn)錄本克服核酸酶敏感性、抗原呈遞障礙及載體介導(dǎo)遞送效率等挑戰(zhàn)的能力，瓊脂糖凝膠電泳證實當(dāng)陽離子脂質(zhì)體與mRNA重量比（w/w）＞8:1時，MATR3-L與MATR3-S可實現(xiàn)完全包裹（圖8B）。納米顆粒追蹤分析（NTA）顯示：空載體LNP平均粒徑80.94±12.28 nm，Zeta電位59.56±5.41 mV；MATR3-L-LNP平均粒徑193.73±10.30 nm，Zeta電位27.56±7.81 mV；MATR3-S-LNP平均粒徑168.19±11.61 nm，Zeta電位35.78±6.11 mV（圖8C、D）。

圖8. 陽離子LNP遞送MATR3-L mRNA有效延緩椎間盤退變進(jìn)程

8.分子機(jī)制

   在退變的髓核細(xì)胞中，上調(diào)的EZH2增強(qiáng)了DDX1第234位賴氨酸的甲基化修飾。甲基化DDX1與MATR3的相互作用減弱，導(dǎo)致剪接位點(diǎn)處剪接因子富集度降低，從而通過外顯子14跳躍促進(jìn)MATR3-S亞型的生成。MATR3-S通過過度開放染色質(zhì)可及性，異常激活Wnt信號通路進(jìn)而促進(jìn)髓核細(xì)胞衰老與凋亡?；陉栯x子脂質(zhì)納米顆粒遞送過表達(dá)MATR3-L mRNA的治療策略，可有效延緩椎間盤退變進(jìn)程。

結(jié)論：

   本研究發(fā)現(xiàn)EZH2介導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白DDX1在賴氨酸234位點(diǎn)的甲基化，通過削弱其與剪接因子的相互作用，促進(jìn)MATR3基因外顯子14跳躍，產(chǎn)生短型MATR3-S，進(jìn)而引發(fā)椎間盤髓核細(xì)胞染色質(zhì)過度開放，激活Wnt等衰老凋亡信號通路，加速椎間盤退變；而利用陽離子脂質(zhì)納米顆粒遞送MATR3長型mRNA可逆轉(zhuǎn)這一過程，為椎間盤退變的基因治療提供了新策略。

參考文獻(xiàn)：

Zhu D, Liang H, Tong B, Du Z, Li G, Zhang W, Wu D, Zhou X, Lei J, Zhang X, Ma L, Wang B, Feng X, Wang K, Tan L, Song Y, Yang C. DDX1 methylation mediated MATR3 splicing regulates intervertebral disc degeneration by initiating chromatin reprogramming. Nat Commun. 2025 Jul 4;16(1):6153.