RNA甲基化修飾（m6A）研究思路及方案設(shè)計(jì)
RNA甲基化修飾（m6A）研究思路及方案設(shè)計(jì)
RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)microRNA，circRNA, rRNA, tRNA 和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。 m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定[1]?！熬幋a器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶，目前已知這個(gè)復(fù)合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉(zhuǎn)甲基化；m6A由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別，目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白（讀碼器）有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。
m6A酶系統(tǒng)
METTL3是早先被鑒定為結(jié)合SAM的組件，其缺失引起小鼠胚胎干細(xì)胞、Hela細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞中m6A peaks的減少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細(xì)胞核內(nèi)亞細(xì)胞器－核小斑（Nuclear speckle）上，顯示ｍ６Ａ修飾可能和ＲＮＡ的剪切加工相關(guān)。WTAP與METTL3–METTL14 二聚體相互作用，并共定位于核小斑，影響甲基化效率，參與mRNA剪。而KIAA1429作為候選的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的新亞基，是整體甲基化進(jìn)程所必須的[2]。FTO是ALKB家族的成員，作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶，可影響剪切因子SRSF2的RNA結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)控pre-mRNA的剪切加工過程[3]。目前已發(fā)現(xiàn)FTO調(diào)節(jié)異常與肥胖、大腦畸形和生長遲緩相關(guān)， 揭示m6A可能對(duì)這些疾病具有重要的調(diào)節(jié)功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被發(fā)現(xiàn)具有去甲基作用的另一個(gè)成員，以RNase A敏感的方式與核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7]. 此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影響新生mRNA合的成和剪切效率[7]， 且ALKBH5敲除雄性小鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常，這可能是精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)改變的結(jié)果[7]。m6A mRNA修飾執(zhí)行其功能主要通過兩個(gè)途徑： 精細(xì)調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，以阻止或誘使蛋白-RNA 相互作用；或被直接由 m6A 結(jié)合蛋白識(shí)別，誘發(fā)后續(xù)反應(yīng)。目前一類含有YTH功能結(jié)構(gòu)域的蛋白被鑒定為m6A修飾的結(jié)合蛋白。其中YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2己被證實(shí)是ｍ６Ａ的結(jié)合蛋白. YTHDF1主要影響ｍ６Ａ修飾基因的翻譯，YTHDF2主要影響ｍ６Ａ修飾基因的降解，而YTHDC1結(jié)合ｍ６Ａ修飾的基因后影響其剪接。HNRNPC是一種豐富的核RNA結(jié)合蛋白，參與pre-mRNA的加工[8]，且研究表明HNRNPC通過m6A與 RNA結(jié)合調(diào)控目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的豐度和選擇性剪切[9].
圖 1 m6A修飾的酶系統(tǒng)[10]
m6A生物學(xué)功能
越來越多的證據(jù)表明m6A修飾在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮重要的生物功能。例如，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控RNA的穩(wěn)定性[11]、定位[12]、運(yùn)輸、剪切[13]和翻譯[14]。Claudio R. 等發(fā)現(xiàn)依賴METTL3的pri-miRNA甲基化，會(huì)促進(jìn)DGCR8識(shí)別和加工，從而促進(jìn)microRNA的成熟[15]。此外，m6A識(shí)別蛋白 HNRNPA2B1促進(jìn) pri-miRNA 加工成 pre-miRNA [16]。另外，環(huán)狀RNA上m6A的修飾能促進(jìn)環(huán)狀RNA的翻譯[17]。m6A修飾在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用，其調(diào)控機(jī)制的異常可能與人類疾病或癌癥相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)m6A可能會(huì)影響精子發(fā)育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2）、發(fā)育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)（METTL3，F(xiàn)TO）、腫瘤生成（YTHDF2）或轉(zhuǎn)移（METTL14）、干細(xì)胞更新（METTL14）、脂肪分化（FTO）、生物節(jié)律、細(xì)胞發(fā)育分化、細(xì)胞分裂及其它的一些生命過程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6)A修飾，其特點(diǎn)是凋亡影響減數(shù)分裂中期的精子細(xì)胞，引起生育能力受損[7]。METTL3和METTL14增加弱精癥精子的m6A水平[18]， 在生殖細(xì)胞中，METTL3的敲除嚴(yán)重抑制精子分化和減數(shù)分裂的發(fā)生，轉(zhuǎn)錄組和m6A分析顯示 精子發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)和選擇性剪接發(fā)生了改變[19]。YTHDC2可促進(jìn)靶基因的翻譯效率，并降低其mRNA的豐度，在精子發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。當(dāng)減數(shù)分裂開始時(shí)YTHDC2表達(dá)上調(diào)，YTHDC2敲除小鼠的生殖細(xì)胞沒有經(jīng)過偶線期的發(fā)育導(dǎo)致小鼠不育[20]。在DNA損傷反應(yīng)中，METTL3可促進(jìn)DNA聚合酶κ（Pol κ）與核酸剪切修復(fù)途徑快速定位到UV引起的DNA損傷位點(diǎn)，當(dāng)缺失METTL3時(shí)，細(xì)胞無法迅速修復(fù)UV照射引起的突變，并且對(duì)UV照射更加敏感[25]。在淋巴細(xì)胞性小鼠過繼轉(zhuǎn)移模型中， Mettl3缺陷通過影響mRNA m6A修飾，降低SOCS家族mRNA衰減，增加mRNA和蛋白表達(dá)水平，從而抑制IL-7介導(dǎo)的 STAT5活性和T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)增殖和分化，進(jìn)而抑制腸炎的發(fā)生[21]。在肝癌中，METTL14 通過調(diào)控pri-miRNA的m6A修飾，影響MiR-126的生成加工，從而抑制肝癌的轉(zhuǎn)移[22]。在乳腺癌細(xì)胞中，低氧刺激能促進(jìn)依賴低氧誘導(dǎo)因子HIF的ALKBH5的表達(dá)，而ALKBH5過表達(dá)降低了NANOG mRNA的m6A修飾，從而穩(wěn)定mRNA提高NANOG的表達(dá)水平，最終增加乳腺癌干細(xì)胞所占的比例[23]。 此外， 低氧誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中依賴ZNF217的NANOG 和 KLF4 的mRNA m6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除顯著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移[24]。在肺癌中，METTL3能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長、生存和侵襲，但還不清楚它是否作為 m6A 調(diào)節(jié)器或效應(yīng)器發(fā)揮作用[25]。在急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）患者中，m (6) A 調(diào)控基因的突變或拷貝數(shù)變化與TP53 突變存在密切聯(lián)系，且m (6) A 調(diào)控基因的改變與AML不良預(yù)后相關(guān)[26]。此外，F(xiàn)TO在AML中高表達(dá)，它通過降低mRNA轉(zhuǎn)錄本中的m(6)水平，調(diào)節(jié)ASB2和RARA等靶點(diǎn)的表達(dá)，增強(qiáng)了白血病癌基因介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和白血病形成，并抑制全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化[27]。在脂肪形成過程中，F(xiàn)TO表達(dá)與m6A水平成負(fù)相關(guān)，促進(jìn)脂肪形成[3]。在膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣細(xì)胞中，ALKBH5 通過lncRNA FOXM1介導(dǎo)FOXM1基因pre-mRNA上的m6A修飾維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成瘤性[28]。此外，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3或METTL14的敲除，能夠改變m6A的富集和ADAM19的表達(dá)，極大地促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、自我更新和腫瘤形成[29]。
圖2 m6A RNA修飾和介導(dǎo)的功能[30]
m6A 的研究方向
（1） 主要是通過研究 m6A修飾相關(guān)的甲基化、去甲基化酶和識(shí)別蛋白的功能，進(jìn)而研究m6A修飾的生物學(xué)功能和作用機(jī)制：一般通過敲除m6A酶分子，研究下游功能基因分子的表達(dá)和m6A甲基化情況，通過介導(dǎo)相關(guān)基因異常（可變剪切、穩(wěn)定性、翻譯、miRNA 調(diào)控）影響細(xì)胞表型和功能特征。
（2） m6A修飾圖譜構(gòu)建及作用機(jī)制：通過m6A甲基化測序（MeRIP-Seq, miCLIP）構(gòu)建疾病細(xì)胞模型或者發(fā)病組織的 m6A 修飾譜，分析m6A的motif, peaks數(shù)量及分布，Peak 關(guān)聯(lián)基因的特征，聯(lián)合RNA-seq研究m6A甲基化與表達(dá)的關(guān)系。
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