RNA甲基化修飾（m6A）研究思路及方案設計
RNA甲基化修飾（m6A）研究思路及方案設計
RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發(fā)現microRNA，circRNA, rRNA, tRNA 和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。 m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定[1]?！熬幋a器(Writer)”即甲基轉移酶，目前已知這個復合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉甲基化；m6A由m6A結合蛋白識別，目前發(fā)現m6A結合蛋白（讀碼器）有YTH結構域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。
m6A酶系統(tǒng)
METTL3是早先被鑒定為結合SAM的組件，其缺失引起小鼠胚胎干細胞、Hela細胞和HepG2 細胞中m6A peaks的減少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細胞核內亞細胞器－核小斑（Nuclear speckle）上，顯示ｍ６Ａ修飾可能和ＲＮＡ的剪切加工相關。WTAP與METTL3–METTL14 二聚體相互作用，并共定位于核小斑，影響甲基化效率，參與mRNA剪。而KIAA1429作為候選的甲基轉移酶復合體的新亞基，是整體甲基化進程所必須的[2]。FTO是ALKB家族的成員，作為第一個被發(fā)現的去甲基酶，可影響剪切因子SRSF2的RNA結合能力，進而調控pre-mRNA的剪切加工過程[3]。目前已發(fā)現FTO調節(jié)異常與肥胖、大腦畸形和生長遲緩相關， 揭示m6A可能對這些疾病具有重要的調節(jié)功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被發(fā)現具有去甲基作用的另一個成員，以RNase A敏感的方式與核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7]. 此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影響新生mRNA合的成和剪切效率[7]， 且ALKBH5敲除雄性小鼠表現出精子發(fā)生異常，這可能是精子發(fā)生相關基因表達改變的結果[7]。m6A mRNA修飾執(zhí)行其功能主要通過兩個途徑： 精細調控甲基化轉錄本的結構，以阻止或誘使蛋白-RNA 相互作用；或被直接由 m6A 結合蛋白識別，誘發(fā)后續(xù)反應。目前一類含有YTH功能結構域的蛋白被鑒定為m6A修飾的結合蛋白。其中YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2己被證實是ｍ６Ａ的結合蛋白. YTHDF1主要影響ｍ６Ａ修飾基因的翻譯，YTHDF2主要影響ｍ６Ａ修飾基因的降解，而YTHDC1結合ｍ６Ａ修飾的基因后影響其剪接。HNRNPC是一種豐富的核RNA結合蛋白，參與pre-mRNA的加工[8]，且研究表明HNRNPC通過m6A與 RNA結合調控目標轉錄本的豐度和選擇性剪切[9].
圖 1 m6A修飾的酶系統(tǒng)[10]
m6A生物學功能
越來越多的證據表明m6A修飾在哺乳動物中發(fā)揮重要的生物功能。例如，在轉錄后水平上調控RNA的穩(wěn)定性[11]、定位[12]、運輸、剪切[13]和翻譯[14]。Claudio R. 等發(fā)現依賴METTL3的pri-miRNA甲基化，會促進DGCR8識別和加工，從而促進microRNA的成熟[15]。此外，m6A識別蛋白 HNRNPA2B1促進 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA [16]。另外，環(huán)狀RNA上m6A的修飾能促進環(huán)狀RNA的翻譯[17]。m6A修飾在基因表達調控中起著重要的作用，其調控機制的異?？赡芘c人類疾病或癌癥相關。目前發(fā)現m6A可能會影響精子發(fā)育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2）、發(fā)育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV誘導的DNA損傷反應（METTL3，FTO）、腫瘤生成（YTHDF2）或轉移（METTL14）、干細胞更新（METTL14）、脂肪分化（FTO）、生物節(jié)律、細胞發(fā)育分化、細胞分裂及其它的一些生命過程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6)A修飾，其特點是凋亡影響減數分裂中期的精子細胞，引起生育能力受損[7]。METTL3和METTL14增加弱精癥精子的m6A水平[18]， 在生殖細胞中，METTL3的敲除嚴重抑制精子分化和減數分裂的發(fā)生，轉錄組和m6A分析顯示 精子發(fā)生相關基因的表達和選擇性剪接發(fā)生了改變[19]。YTHDC2可促進靶基因的翻譯效率，并降低其mRNA的豐度，在精子發(fā)生過程中起關鍵作用。當減數分裂開始時YTHDC2表達上調，YTHDC2敲除小鼠的生殖細胞沒有經過偶線期的發(fā)育導致小鼠不育[20]。在DNA損傷反應中，METTL3可促進DNA聚合酶κ（Pol κ）與核酸剪切修復途徑快速定位到UV引起的DNA損傷位點，當缺失METTL3時，細胞無法迅速修復UV照射引起的突變，并且對UV照射更加敏感[25]。在淋巴細胞性小鼠過繼轉移模型中， Mettl3缺陷通過影響mRNA m6A修飾，降低SOCS家族mRNA衰減，增加mRNA和蛋白表達水平，從而抑制IL-7介導的 STAT5活性和T細胞內穩(wěn)態(tài)增殖和分化，進而抑制腸炎的發(fā)生[21]。在肝癌中，METTL14 通過調控pri-miRNA的m6A修飾，影響MiR-126的生成加工，從而抑制肝癌的轉移[22]。在乳腺癌細胞中，低氧刺激能促進依賴低氧誘導因子HIF的ALKBH5的表達，而ALKBH5過表達降低了NANOG mRNA的m6A修飾，從而穩(wěn)定mRNA提高NANOG的表達水平，最終增加乳腺癌干細胞所占的比例[23]。 此外， 低氧誘導乳腺癌細胞中依賴ZNF217的NANOG 和 KLF4 的mRNA m6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除顯著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺轉移[24]。在肺癌中，METTL3能夠促進肺腺癌細胞的生長、生存和侵襲，但還不清楚它是否作為 m6A 調節(jié)器或效應器發(fā)揮作用[25]。在急性髓細胞白血病（AML）患者中，m (6) A 調控基因的突變或拷貝數變化與TP53 突變存在密切聯系，且m (6) A 調控基因的改變與AML不良預后相關[26]。此外，FTO在AML中高表達，它通過降低mRNA轉錄本中的m(6)水平，調節(jié)ASB2和RARA等靶點的表達，增強了白血病癌基因介導的細胞轉化和白血病形成，并抑制全反式維甲酸(ATRA)誘導的AML細胞分化[27]。在脂肪形成過程中，FTO表達與m6A水平成負相關，促進脂肪形成[3]。在膠質細胞瘤樣細胞中，ALKBH5 通過lncRNA FOXM1介導FOXM1基因pre-mRNA上的m6A修飾維持膠質瘤細胞的成瘤性[28]。此外，甲基轉移酶METTL3或METTL14的敲除，能夠改變m6A的富集和ADAM19的表達，極大地促進了膠質瘤細胞的生長、自我更新和腫瘤形成[29]。
圖2 m6A RNA修飾和介導的功能[30]
m6A 的研究方向
（1） 主要是通過研究 m6A修飾相關的甲基化、去甲基化酶和識別蛋白的功能，進而研究m6A修飾的生物學功能和作用機制：一般通過敲除m6A酶分子，研究下游功能基因分子的表達和m6A甲基化情況，通過介導相關基因異常（可變剪切、穩(wěn)定性、翻譯、miRNA 調控）影響細胞表型和功能特征。
（2） m6A修飾圖譜構建及作用機制：通過m6A甲基化測序（MeRIP-Seq, miCLIP）構建疾病細胞模型或者發(fā)病組織的 m6A 修飾譜，分析m6A的motif, peaks數量及分布，Peak 關聯基因的特征，聯合RNA-seq研究m6A甲基化與表達的關系。
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