RNA甲基化修飾（m6A）研究
RNA甲基化修飾（m6A）研究
RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)microRNA，circRNA,rRNA, tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。 m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定[1]?！熬幋a器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶，目前已知這個(gè)復(fù)合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉(zhuǎn)甲基化；m6A由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別，目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白（讀碼器）有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。
m6A酶系統(tǒng)
METTL3是早先被鑒定為結(jié)合SAM的組件，其缺失引起小鼠胚胎干細(xì)胞、Hela細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞中m6Apeaks的減少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細(xì)胞核內(nèi)亞細(xì)胞器－核小斑（Nuclear speckle）上，顯示ｍ６Ａ修飾可能和ＲＮＡ的剪切加工相關(guān)。WTAP與METTL3–METTL14 二聚體相互作用，并共定位于核小斑，影響甲基化效率，參與mRNA剪。而KIAA1429作為候選的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的新亞基，是整體甲基化進(jìn)程所必須的[2]。FTO是ALKB家族的成員，作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶，可影響剪切因子SRSF2的RNA結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)控pre-mRNA的剪切加工過(guò)程[3]。目前已發(fā)現(xiàn)FTO調(diào)節(jié)異常與肥胖、大腦畸形和生長(zhǎng)遲緩相關(guān)， 揭示m6A可能對(duì)這些疾病具有重要的調(diào)節(jié)功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被發(fā)現(xiàn)具有去甲基作用的另一個(gè)成員，以RNase A敏感的方式與核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7].此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影響新生mRNA合的成和剪切效率[7]， 且ALKBH5敲除雄性小鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常，這可能是精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)改變的結(jié)果[7]。m6A mRNA修飾執(zhí)行其功能主要通過(guò)兩個(gè)途徑： 精細(xì)調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，以阻止或誘使蛋白-RNA 相互作用；或被直接由 m6A 結(jié)合蛋白識(shí)別，誘發(fā)后續(xù)反應(yīng)。目前一類含有YTH功能結(jié)構(gòu)域的蛋白被鑒定為m6A修飾的結(jié)合蛋白。其中YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2己被證實(shí)是ｍ６Ａ的結(jié)合蛋白.YTHDF1主要影響ｍ６Ａ修飾基因的翻譯，YTHDF2主要影響ｍ６Ａ修飾基因的降解，而YTHDC1結(jié)合ｍ６Ａ修飾的基因后影響其剪接。HNRNPC是一種豐富的核RNA結(jié)合蛋白，參與pre-mRNA的加工[8]，且研究表明HNRNPC通過(guò)m6A與 RNA結(jié)合調(diào)控目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的豐度和選擇性剪切[9].
圖 1 m6A修飾的酶系統(tǒng)[10]
m6A生物學(xué)功能
越來(lái)越多的證據(jù)表明m6A修飾在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮重要的生物功能。例如，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控RNA的穩(wěn)定性[11]、定位[12]、運(yùn)輸、剪切[13]和翻譯[14]。Claudio R. 等發(fā)現(xiàn)依賴METTL3的pri-miRNA甲基化，會(huì)促進(jìn)DGCR8識(shí)別和加工，從而促進(jìn)microRNA的成熟[15]。此外，m6A識(shí)別蛋白 HNRNPA2B1促進(jìn) pri-miRNA 加工成 pre-miRNA[16]。另外，環(huán)狀RNA上m6A的修飾能促進(jìn)環(huán)狀RNA的翻譯[17]。m6A修飾在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用，其調(diào)控機(jī)制的異?？赡芘c人類疾病或癌癥相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)m6A可能會(huì)影響精子發(fā)育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2）、發(fā)育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)（METTL3，F(xiàn)TO）、腫瘤生成（YTHDF2）或轉(zhuǎn)移（METTL14）、干細(xì)胞更新（METTL14）、脂肪分化（FTO）、生物節(jié)律、細(xì)胞發(fā)育分化、細(xì)胞分裂及其它的一些生命過(guò)程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6)A修飾，其特點(diǎn)是凋亡影響減數(shù)分裂中期的精子細(xì)胞，引起生育能力受損[7]。METTL3和METTL14增加弱精癥精子的m6A水平[18]，在生殖細(xì)胞中，METTL3的敲除嚴(yán)重抑制精子分化和減數(shù)分裂的發(fā)生，轉(zhuǎn)錄組和m6A分析顯示 精子發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)和選擇性剪接發(fā)生了改變[19]。YTHDC2可促進(jìn)靶基因的翻譯效率，并降低其mRNA的豐度，在精子發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用。當(dāng)減數(shù)分裂開(kāi)始時(shí)YTHDC2表達(dá)上調(diào)，YTHDC2敲除小鼠的生殖細(xì)胞沒(méi)有經(jīng)過(guò)偶線期的發(fā)育導(dǎo)致小鼠不育[20]。在DNA損傷反應(yīng)中，METTL3可促進(jìn)DNA聚合酶κ（Pol κ）與核酸剪切修復(fù)途徑快速定位到UV引起的DNA損傷位點(diǎn)，當(dāng)缺失METTL3時(shí)，細(xì)胞無(wú)法迅速修復(fù)UV照射引起的突變，并且對(duì)UV照射更加敏感[25]。在淋巴細(xì)胞性小鼠過(guò)繼轉(zhuǎn)移模型中， Mettl3缺陷通過(guò)影響mRNA m6A修飾，降低SOCS家族mRNA衰減，增加mRNA和蛋白表達(dá)水平，從而抑制IL-7介導(dǎo)的 STAT5活性和T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)增殖和分化，進(jìn)而抑制腸炎的發(fā)生[21]。在肝癌中，METTL14 通過(guò)調(diào)控pri-miRNA的m6A修飾，影響MiR-126的生成加工，從而抑制肝癌的轉(zhuǎn)移[22]。在乳腺癌細(xì)胞中，低氧刺激能促進(jìn)依賴低氧誘導(dǎo)因子HIF的ALKBH5的表達(dá)，而ALKBH5過(guò)表達(dá)降低了NANOG mRNA的m6A修飾，從而穩(wěn)定mRNA提高NANOG的表達(dá)水平，最終增加乳腺癌干細(xì)胞所占的比例[23]。 此外，低氧誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中依賴ZNF217的NANOG 和KLF4 的mRNA m6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除顯著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移[24]。在肺癌中，METTL3能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、生存和侵襲，但還不清楚它是否作為 m6A 調(diào)節(jié)器或效應(yīng)器發(fā)揮作用[25]。在急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）患者中，m (6) A 調(diào)控基因的突變或拷貝數(shù)變化與TP53 突變存在密切聯(lián)系，且m (6) A 調(diào)控基因的改變與AML不良預(yù)后相關(guān)[26]。此外，F(xiàn)TO在AML中高表達(dá)，它通過(guò)降低mRNA轉(zhuǎn)錄本中的m(6)水平，調(diào)節(jié)ASB2和RARA等靶點(diǎn)的表達(dá)，增強(qiáng)了白血病癌基因介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和白血病形成，并抑制全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化[27]。在脂肪形成過(guò)程中，F(xiàn)TO表達(dá)與m6A水平成負(fù)相關(guān)，促進(jìn)脂肪形成[3]。在膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣細(xì)胞中，ALKBH5通過(guò)lncRNA FOXM1介導(dǎo)FOXM1基因pre-mRNA上的m6A修飾維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成瘤性[28]。此外，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3或METTL14的敲除，能夠改變m6A的富集和ADAM19的表達(dá)，極大地促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、自我更新和腫瘤形成[29]。
圖2 m6A RNA修飾和介導(dǎo)的功能[30]
m6A 的研究方向
主要是通過(guò)研究 m6A修飾相關(guān)的甲基化、去甲基化酶和識(shí)別蛋白的功能，進(jìn)而研究m6A修飾的生物學(xué)功能和作用機(jī)制：一般通過(guò)敲除m6A酶分子，研究下游功能基因分子的表達(dá)和m6A甲基化情況，通過(guò)介導(dǎo)相關(guān)基因異常（可變剪切、穩(wěn)定性、翻譯、miRNA 調(diào)控）影響細(xì)胞表型和功能特征。
m6A修飾圖譜構(gòu)建及作用機(jī)制：通過(guò)m6A甲基化測(cè)序（MeRIP-Seq, miCLIP）構(gòu)建疾病細(xì)胞模型或者發(fā)病組織的 m6A 修飾譜，分析m6A的motif, peaks數(shù)量及分布，Peak 關(guān)聯(lián)基因的特征，聯(lián)合RNA-seq研究m6A甲基化與表達(dá)的關(guān)系。
m6A研究思路
方案一
方案二
研究案例
1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
DNA甲基化異常是膠質(zhì)瘤的表觀遺傳調(diào)控因子，但RNA甲基化在腫瘤包括惡性膠質(zhì)瘤（GBM）中的調(diào)控還尚未清楚。為研究m6A調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致GBM患者臨床療效不佳，作者通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)ALKBH5在惡性膠質(zhì)瘤樣干細(xì)胞（GSCs）中高表達(dá)且與GBM 病人不良預(yù)后相關(guān)，干擾ALKBH5 降低GSCs細(xì)胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖，進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證敲除ALKBH5可抑制腫瘤生長(zhǎng)。
為研究ALKBH5的m6A作用機(jī)制，作者利用芯片和m6A-seq篩選到膠質(zhì)瘤增殖相關(guān)的FOXM1，最后通過(guò)qPCR、WB、免疫熒光、核質(zhì)分離WB/qPCR、RIP和MeRIP等實(shí)驗(yàn)證明ALKBH5通過(guò)去甲基化調(diào)節(jié)FOXM1在GSCs中的表達(dá)。
為研究ALKBH5對(duì)FOXM1的作用是否受其他因子的調(diào)節(jié)，作者研究了FOXM1的鄰近基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXM1-AS與FOXM1序列互補(bǔ)，且共表達(dá)、共定位，進(jìn)一步通過(guò)RIP, RNA pull down等實(shí)驗(yàn)證明lncRNA FOXM1-AS促進(jìn)ALKBH5 和FOXM1初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的相互作用。最后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下維持FOXM1的表達(dá)和細(xì)胞增殖，從而維持GSCs的干性。
圖3 ALKBH5敲除細(xì)胞中m6A修飾的特征和基因表達(dá)的變化
2、RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression
through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2. Hepatology,2017.(IF=13.2)
表觀遺傳改變極大地促進(jìn)了人類癌癥的發(fā)生。傳統(tǒng)的表觀遺傳研究主要集中在DNA甲基化，組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)。最近，RNA各種可逆的化學(xué)修飾被認(rèn)為是一種新的表觀遺傳調(diào)控方式。m6A是真核生物mRNA最常見(jiàn)的化學(xué)修飾，在調(diào)控mRNA穩(wěn)定性，剪切和翻譯方面具有重要的作用。
作者使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了METTL3（甲基轉(zhuǎn)移酶3），一種主要的RNA N6-腺苷-甲基轉(zhuǎn)移酶，在人肝細(xì)胞癌（HCC）和多種實(shí)體腫瘤中顯著高表達(dá)。在臨床上，METTL3的過(guò)度表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者不良預(yù)后有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證明敲除METTL3會(huì)顯著抑制HCC細(xì)胞增殖，遷移及克隆形成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明敲除METTL3會(huì)明顯抑制HCC體內(nèi)成瘤和肺轉(zhuǎn)移。另外，使用CRISPR/dCas9-VP 64激活系統(tǒng)，內(nèi)源性高表達(dá)METTL3會(huì)顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞在體外和體內(nèi)生長(zhǎng)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、m6A-Seq、MeRIP-PCR，作者確定了SOCS2（細(xì)胞因子信號(hào)2的抑制因子）作為METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶基因。 敲除METTL3表達(dá)會(huì)消除SOCS2 mRNA m6A修飾并增強(qiáng)SOCS2 mRNA表達(dá)。m6A介導(dǎo)的SOCS2 mRNA降解是依賴于m6A“讀取器”蛋白YTHDF2?？傊?，METTL3在HCC大部分高表達(dá)中,并通過(guò)m6A-YTHDF2依賴機(jī)制抑制SOCS2表達(dá)從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。因此，作者發(fā)現(xiàn)了在肝腫瘤發(fā)生過(guò)程中表觀遺傳改變的一種新機(jī)制。
圖4 RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶METLLT3在肝癌組織中高表達(dá)
（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析）
圖5 RNA-Seq和m6A-seq聯(lián)合鑒定SOCS2是METTL3
介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶基因
3、N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One 2015,
在許多不同種類的RNA中，都已觀察到N6 -腺苷(m6A)的甲基化，但其在microRNAs中還沒(méi)有被研究。研究者在FTO1C1, FTO2D4 和 FTO3C3細(xì)胞系中，通過(guò)敲除m6A甲基轉(zhuǎn)移酶FTO篩選到表達(dá)差異的microRNA,說(shuō)明miRNA受m6A甲基化的調(diào)控。進(jìn)一步通過(guò)MeRIP-Seq發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分的microRNA具有m6A修飾。通過(guò)motif分析，他們發(fā)現(xiàn)了區(qū)分甲基化和非甲基化microRNA的一致序列。該文章所述的表觀遺傳修飾在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復(fù)雜性上增加了一個(gè)新的層次。
圖6 FTO敲除對(duì)甲基化的miRNAs的穩(wěn)定狀態(tài)的影響。
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