細胞實驗證實間充質(zhì)干細胞來源的細胞外囊泡促進人類軟骨再生
細胞實驗證實間充質(zhì)干細胞來源的細胞外囊泡促進人類軟骨再生
Mesenchymal Stromal/stem Cell-derived Extracellular Vesicles Promote Human Cartilage Regeneration In Vitro.
間充質(zhì)干細胞具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下不僅可以分化為造血細胞，還可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、基質(zhì)細胞等。此外，間充質(zhì)干細胞獲取方便，易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，不存在免疫排斥特性。以上特點使得間充質(zhì)干細胞被廣泛應(yīng)用于人類組織器官衰老和損傷的修復(fù)。骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種風(fēng)濕性疾病，能夠?qū)е侣蕴弁春蜌埣玻壳皼]有十分有效的治療方法。近年來，間充質(zhì)干細胞來源的細胞外囊泡在各種生理和病理情況下的功能作用逐漸受到關(guān)注。近期發(fā)表在Theranostics（IF=8.77）上的文章《Mesenchymal Stromal/stem Cell-derived Extracellular Vesicles Promote Human Cartilage Regeneration In Vitro》通過體外實驗證實了間充質(zhì)干細胞來源的細胞外囊泡對人軟骨再生的促進作用，并一定程度上揭示了其作用機制。作者研究了人類骨髓來源的MSC（BMMSC）分泌的細胞外囊泡（EV）在人OA軟骨修復(fù)中的作用。為了檢測BMMSC-EVs對OA軟骨炎癥的作用，作者使用BMMSC-EV處理TNF-α刺激的OA軟骨細胞單層培養(yǎng)物，48小時后通過qRT-PCR測量促炎基因表達。為了評估BMMSC-EV對軟骨再生的影響，將BMMSC-EV添加到人OA軟骨細胞的再生培養(yǎng)物中，4周后對糖胺聚糖含量進行分析。此外，對再生組織的石蠟切片進行蛋白聚糖和II型膠原染色。研究結(jié)果表明，BMMSC來源EV能夠抑制炎癥介質(zhì)對軟骨穩(wěn)態(tài)的不利影響。當(dāng)與OA軟骨細胞共培養(yǎng)時，BMMSC-EV消除了TNF-α介導(dǎo)的COX2和促炎白細胞介素的上調(diào)并抑制TNF-α誘導(dǎo)的膠原酶活性。BMMSC-EVs還促進體外軟骨再生。將BMMSC-EV添加到從OA患者分離的軟骨細胞的培養(yǎng)物中刺激這些細胞產(chǎn)生蛋白聚糖和II型膠原。以上結(jié)果表明BMMSC-EV可以是軟骨修復(fù)的重要介質(zhì)，作為軟骨再生和骨關(guān)節(jié)炎的新型治療劑具有很大的前景。
技術(shù)路線
實驗結(jié)果
1. 兩個獨立健康供體的骨髓來源的MSC分泌外泌體標(biāo)記物陽性的細胞外囊泡
圖1： 細胞外囊泡特征鑒定。A） Western blot結(jié)果顯示CD63、CD9和鈣連接蛋白表達呈陽性。B) 電鏡結(jié)果顯示BMMSC-EVs大小不均一，其中CD9和CD63陽性的EVs大小在40nm到150nm，與外泌體大小一致。
2. 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞內(nèi)化BMMSC來源的EVs
圖2 骨關(guān)節(jié)炎來源的軟骨細胞攝取BMMSC-EVs
3. BMMSC-EV抑制骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細胞中TNF-α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)
圖3：3.BMMSC-EV抑制骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細胞中TNF-α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。A) B)6名骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細胞分別用BMMSC-EVs，BMMSC條件培養(yǎng)基(BMMSC-CM)或去除EVs的BMMSC-CM (BMMSC-EDCM)處理，qRT-PCR檢測軟骨細胞基因表達水平。C) 4名骨關(guān)節(jié)炎病變軟骨細胞用BMMSC-EVs處理48h或/并用TNF-α處理24h后檢測膠原蛋白酶活性；D) BMMSC-EV孵育拯救TNF-α抑制的OA軟骨細胞的增殖。
4. BMMSC-EV在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中抑制TNF-α誘導(dǎo)的促炎性NF-κB信號傳導(dǎo)
圖4：BMMSC-EV在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中抑制TNF-α誘導(dǎo)的促炎性NF-κB信號傳導(dǎo)。A) B)BMSC-EVs抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位；C）BMMSC-EV消除TNF-α誘導(dǎo)的IκBα磷酸化。
5. BMMSC-EV促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞產(chǎn)生蛋白多糖和II型膠原
圖5：BMMSC-EV促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞產(chǎn)生蛋白多糖和II型膠原。A) B) BMMSC-EV在OA軟骨細胞中上調(diào)蛋白質(zhì)水平的蛋白聚糖表達。C)BMMSC-EVs上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中ACAN的表達水平。
6. BMMSC-EVs通過骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞促進蛋白聚糖和II型膠原產(chǎn)生
圖6：BMMSC-EVs通過骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞促進蛋白聚糖和II型膠原產(chǎn)生。A) BMMSC-EVs上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞collagenII蛋白表達水平; B) COLII表達在BMMSC-EVs處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中顯著升高; C) 軟骨細胞再生相關(guān)的基因表達在BMMSC-EVs處理后，表達量顯著升高；D) 肥大軟骨細胞分化相關(guān)的基因表達在BMMSC-EVs處理后顯著下調(diào); E) BMMSC-EVs促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞代謝活性; F) BMMSC-EVs促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖。
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