USP48的藥理激活——USP48-GSDME軸促進癌細胞焦亡

       焦亡是一種細胞程序性死亡，其特征是炎癥caspase的激活和Gasdermin蛋白的裂解。焦亡可以抑制腫瘤發(fā)展，誘導抗腫瘤免疫，激活焦亡是一種潛在的治療癌癥的策略。本研究中，作者通過CRISPR-Cas9篩選，發(fā)現(xiàn)USP48（一種去泛素化酶）的缺失顯著抑制了細胞焦亡。USP48通過Gasdermin E （GSDME）促進焦亡。該研究于2023年4月發(fā)表在《Cancer Research》，IF：11.2。
技術路線

主要研究結果
1. USP48參與焦亡的調控
       顯微鏡下觀察人宮頸癌HeLa細胞經(jīng)raptinal處理后的形態(tài)學變化，發(fā)現(xiàn)HeLa細胞中出現(xiàn)焦亡的球囊細胞膜，證實raptinal可以誘導HeLa細胞焦亡（圖lA）。在HeLa細胞中進行CRISPR-Cas9基因篩選，以raptinal處理后LDH的分泌量為讀取值，并通過單siRNA篩選技術進一步篩選和驗證獲得的基因（圖1B）。根據(jù)轉染sgRNA后LDH分泌的倍數(shù)變化，選擇36個基因作為主要基因。其中，17個候選基因的沉默使LDH的分泌增加2倍以上，而其他19個基因的沉默則抑制了LDH的分泌（圖1C-D）。干擾USP48對細胞內LDH的釋放有明顯的抑制作用（圖1E）。用raptinal處理細胞，檢測USP48沉默對HeLa細胞LDH、IL-1β和IL-18的影響（圖1F-H）。結果表明，USP48沉默可顯著抑制HeLa細胞中LDH、IL-1β和IL-18的釋放。通過延時顯微鏡觀察轉染USP48特異性siRNA （si-USP48）的HeLa細胞，結果顯示USP48沉默顯著抑制raptinal誘導的焦亡和SYTOX Green吸收（圖1I-J）。USP48沉默抑制raptinal誘導的HMGB1釋放（圖1K）。綜上所述，初步確認USP48可能參與焦亡調控。

圖1. USP48參與焦亡的調控

2. USP48調控GSDM的表達
       檢測6種不同人源性細胞系中USP48的表達，發(fā)現(xiàn)USP48在293T細胞中低表達，在HeLa細胞中高表達（圖2A）。在293T細胞系中穩(wěn)定過表達USP48，在HeLa細胞系中穩(wěn)定敲低USP48（圖2B）。將質譜和蛋白質組學結果結合分析，獲得8個相關蛋白（圖2D和E）。檢測過表達USP48和敲低USP48后這8種蛋白的表達水平變化，發(fā)現(xiàn)GSDME相比其他幾種蛋白的變化更為顯著和穩(wěn)定（圖2F和G）。圖2H進一步證實GSDME的表達與USP48的表達呈正相關，但GSDMD和USP48的表達狀態(tài)不存在顯著相關。催化失活突變體USP48 （USP48/C98A）的過表達不會影響GSDME的表達（圖2I）。通過CO-IP進一步證實USP48與GSDME之間的相互作用（圖2J-K）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)USP48不影響GSDME的裂解（圖2L）。綜上，USP48可以調節(jié)GSDME的表達（但不影響其裂解），并且與GSDME有直接的相互作用。

圖2. GSDME是USP48的下游靶蛋白

3. USP48通過調控GSDM的表達影響焦亡
       建立一個同時表達USP48和靶向GSDME的shRNA的293T細胞系（圖3A）。GSDME的下調大大挽救了raptinal處理后293T細胞中USP48過表達對LDH（圖3B）、IL-1B（圖3C）和IL-18（圖3D）的促進作用。相反，在同時表達shUSP48和GSDME的HeLa細胞系中（圖3E），也證實了過表達GSDME可以恢復USP48敲低對293T細胞經(jīng)raptinal處理后產(chǎn)生LDH（圖3F）、IL-1β（圖3G）和IL-18（圖3H）的抑制作用。用延時顯微鏡觀察表達USP48和shRNA靶向GSDME的293T細胞系經(jīng)raptinal處理后SYTOX Green的形態(tài)和吸收情況，得到了一致的結果（圖3I-J）。綜上所述，證實USP48可能以不依賴于caspase-3的方式促進GSDME的表達，從而促進GSDME的表達發(fā)生焦亡。

圖3. USP48通過GSDME調控焦亡

4. USP48通過去泛素化防止GSDME降解
       為進一步確認USP48是否會影響GSDME的穩(wěn)定性，作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體特異性抑制劑MG132可以有效逆轉USP48敲低對GSDME的影響（圖4A），通過環(huán)已酰亞胺（CHX）追蹤分析評價USP48調節(jié)GSDME蛋白腫瘤速率的潛力，結果表明USP48水平的降低與GSDME半衰期的縮短明顯相關（圖4B）。用Dox誘導的野生型USP48 （USP48/WT）和催化失活突變型USP4S （USP48/C98A）建立293T細胞，發(fā)現(xiàn)只有野生型USP48以Dox劑量依賴的方式逐漸增加GSDME水平（圖4C），而表達USP48/C98A的細胞中未檢測到GSDME蛋白水平的顯著變化（圖4D）。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)過表達野生型USP48顯著降低GSDME的泛素化水平，而表達USP48/C98A的293T細胞對GSDME的泛素化沒有影響（圖4E）。相反，敲低USP48會導致泛素化GSDME的積累（圖4F）。作者還發(fā)現(xiàn)USP48影響GSDME中K48連接的泛素，但對K63連接的泛素化沒有影響（圖4G）。體外泛素化實驗表明，泛素K48在K30、K120和K189位點使GSDME泛素化 （圖4H和I）。接下來，為鑒定USP48修飾的GSDME的靶殘基，在GSDME的K30、K120和K189位點構建相應的點突變體（圖4J），結果顯示，USP48在K120處抑制GSDME的K48連鎖泛素化（圖4K）。綜上所述，USP48通過抑制GSDME K120位點的K48連鎖泛素化來阻止GSDME的降解。

圖4. USP48通過去泛素化抑制GSDME的降解

5. USP48通過調節(jié)GSDME的表達影響抗腫瘤免疫
       為了進一步證明USP48的功能，建立USP48缺陷小鼠自發(fā)性胰腺腫瘤發(fā)生（KUC）模型。免疫組化和免疫熒光結果顯示USP48的表達水平與GSDME的表達呈正相關（圖5A-F）。此外，小鼠組織中USP48的缺失對GSDMD的表達也沒有影響（圖5G和H）。免疫熒光結果顯示，KUC小鼠腫瘤浸潤性CD8⁺和CD4⁺T細胞明顯減少（圖5I-J）。自然殺傷細胞和CD8⁺細胞毒性T殺傷細胞的比例明顯降低，而腫瘤相關巨噬細胞和Treg細胞的比例則顯著增加（圖5K）。綜上所述， USP48可以通過調節(jié)GSDME的表達來影響細胞的抗腫瘤免疫。

圖5. USP48參與抗腫瘤免疫的調節(jié)

6. 單細胞測序實驗闡明USP48對抗腫瘤免疫的調控作用
       對KC和KUC小鼠的胰腺組織進行單細胞測序，所有細胞CD45基因（PTPRC）均呈陽性（圖6A）。大小聚類算法顯示KC和KUC小鼠胰腺腫瘤組織中的細胞分布（圖6B）。將細胞分組，定義捕獲TAM的5個細胞群，即樹突狀細胞（dc）、T細胞、單核細胞-1細胞和單核細胞-2細胞（圖6C）。比較KC和KUC胰腺癌組織中細胞亞群的差異，發(fā)現(xiàn)USP48表達的下調顯著增加了TAM和單核細-2的數(shù)量（圖6D）。通過熱圖和點陣圖 （圖6E和F），得到KC和KUC胰腺癌組織中各細胞亞組的數(shù)量和比例（圖6G）。對KC和KUC胰腺癌組織中的T細胞進行亞群分析（圖7A）。結果發(fā)現(xiàn)， Tex細胞和Treg細胞在KUC胰腺癌組織中的比例顯著增加，表明USP48表達的降低抑制腫瘤免疫的發(fā)生（圖7B）。使用UMAP顯示T細胞亞群分類標準標記基因的表達以及T細胞亞群在KC和KUC胰腺癌組織中的比例，進一步證實上述結果（圖7C-D）。使用多色免疫熒光實驗檢測KC和KUC小鼠胰腺癌組織中Tex細胞和Treg細胞的分布，得到的結果與測序結果一致（圖7E和F）。敲低USP48顯著增加TAM亞群的比例（圖7G和H）。多色免疫熒光實驗證實USP48的缺失增加TAM在胰腺癌組織中的分布（圖7I）。綜上所述， USP48缺失抑制胰腺癌細胞的抗腫瘤免疫。

圖6. 胰腺癌中KC和KC；USP48^-/-CD45⁺細胞的單細胞分析

圖7. 敲除USP48可增加浸潤胰腺癌的去勢T細胞、Treg和TAM的比例

7. USP48-GSDME調節(jié)小鼠對抗PD -1免疫治療的敏感性
       將過表達USP48的Pan02細胞或空載體皮下植入C57/B6小鼠。在第7天、第11天和第15天用抗aPD-1處理小鼠，連續(xù)觀察小鼠的生長情況，并在第30天處死小鼠（圖8A）。結果表明，過表達USP48可顯著抑制小鼠體內腫瘤的生長，而過表達USP48突變體（USP48/C98A）對小鼠體內腫瘤生長無抑制作用。過表達USP48也顯著提高小鼠對抗PD -1治療的敏感性（圖8B-E）。在過表達USP48的Pan02細胞中表達shGSDME或scramble，并皮下注射到C57/B6小鼠體內。與預期結果一致，在USP48過表達的Pan02小鼠中，敲低GSDME的表達可有效逆轉USP48過表達對腫瘤生長的抑制作用和促進抗PD -1治療的敏感性（圖8F-I）。對小鼠腫瘤進行流式細胞術檢測，結果與之前的結果一致 （圖8J-K）。這些結果進一步證實USP48-GSDME通路在抗腫瘤免疫中的重要作用，并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤免疫治療中的關鍵調控作用。

圖8. USP48-GSDME影響小鼠對抗PD-1免疫療法的敏感性

結論
       綜上所述，本研究確定了USP48對焦亡的關鍵調控作用，并闡明了其分子機制以及USP48在抗腫瘤免疫和免疫治療中的作用。因此，特異性靶向USP48或USP48-GSDME軸可能是未來潛在的治療策略。

實驗方法
細胞培養(yǎng)，逆轉錄病毒轉染， CRISPR敲除，免疫組化，多重免疫熒光，WB，Co-IP，體外泛素化實驗，qRT-PCR，流式細胞術，SYTOX green 染色，LDH檢測，IL-18和IL-1β檢測，RNA-seq文庫構建，腫瘤異種移植。
參考文獻
Ren Y, Feng M, Hao X, Liu X, Li J, Li P, Gao J, Qi Q, Du L, Wang C, Wang Q, Wang Y. USP48 Stabilizes Gasdermin E to Promote Pyroptosis in Cancer. Cancer Res. 2023 Apr 4;83（7）:1074-1093. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-22-1812. PMID: 36607699.