Nature子刊—干擾相分離促進(jìn)抗腫瘤免疫

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2023-11-03
靶向PD-1/PD-L1軸的免疫療法已成為多種癌癥的一線治療,但由于調(diào)控PD-1/PD-L1機制不清,只有有限的一部分個體實現(xiàn)了持久的益處......



       靶向PD-1/PD-L1軸的免疫療法已成為多種癌癥的一線治療。然而,由于調(diào)控PD-1/PD-L1的難以捉摸的機制,只有有限的一部分個體實現(xiàn)了持久的益處。生物分子縮合物涉及廣泛的生理過程,并且也已報道控制癌癥相關(guān)的失調(diào)。詳細(xì)研究生物分子冷凝物形成的機制可能為開發(fā)有效的靶向策略提供機會,因為腫瘤細(xì)胞中的靶向相分離過程有益于臨床。本文首先通過質(zhì)譜、CHIP和空間共定位的方法確定了KAT8與IRF1之間能發(fā)生相分離。同時,KAT8在K78處乙酰化IRF1以促進(jìn)其DNA結(jié)合,這與H4 K16乙酰化協(xié)同作用以增強PD-L1 的表達(dá)。又基于KAT8-IRF1縮合物的形成機制,開發(fā)了一種細(xì)胞穿透阻斷肽2142-R8,其能破壞KAT8-IRF1縮合物,抑制PD-L1的表達(dá),增強體內(nèi)和體外抗腫瘤免疫。
       本文章于2023年3月發(fā)表于《Nature cancer》上,IF=22.7
技術(shù)路線

















主要研究內(nèi)容
1.KAT8能夠調(diào)控PD-L1的轉(zhuǎn)錄

       使用全基因組CRISPR-Cas9基因敲除篩選來鑒定IFNγ暴露后腫瘤細(xì)胞中PD-Ll表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。發(fā)現(xiàn)了編碼組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT8的基因是我們篩選中最顯著富集的基因之一(圖1a,b)。KAT8敲低后在多個細(xì)胞系(骨肉瘤細(xì)胞系143B,惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549)PD-L1的總蛋白和mRNA水平顯著降低(圖1c,d)。更重要的是,野生型(WT)KAT8,而不是其C316S催化缺陷突變體,挽救了KAT8耗盡細(xì)胞中PD-Ll和H4 K16 ac的下調(diào),表明KAT8的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性對于PD-L1表達(dá)的調(diào)節(jié)是關(guān)鍵的(圖1e,f)。接下來,研究了KAT8耗竭導(dǎo)致的PD-L1表達(dá)下調(diào)是否影響抗腫瘤反應(yīng)。體外細(xì)胞毒性測定顯示耗盡KAT8顯著增強T細(xì)胞殺傷(圖1g)。在體內(nèi),KAT8耗竭抑制腫瘤生長并降低腫瘤重量(圖1h,i)同時增加小鼠中CD3+ CD8+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤(圖1j-m)。KAT8消耗不能進(jìn)一步延緩用抗PD-1治療的小鼠中的腫瘤生長(圖1n,o)。此外,免疫組織化學(xué)(IHC),表明在人類癌癥中KAT8和PD-L1之間存在正相關(guān)性(圖1p)。


圖1:KAT8在體內(nèi)外調(diào)控PD-L1的轉(zhuǎn)錄

2.KAT8與IFR1相互作用并形成動態(tài)凝聚物

       為了研究KAT8如何調(diào)節(jié)PD-L1 mRNA轉(zhuǎn)錄,我們應(yīng)用鄰近標(biāo)記方法,通過引入TurboID-tagged KAT8進(jìn)入A375細(xì)胞以標(biāo)記潛在的相互作用蛋白。使用質(zhì)譜法,我們鑒定IRF1為標(biāo)記的蛋白質(zhì)之一。通過內(nèi)源和外源水平的免疫沉淀進(jìn)一步證實了KAT8和IRF1之間的相互作用(圖2b)。用單體增強型綠色熒光蛋白-KAT8(mEGFP-KAT8)和IRF1-mCherry轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在細(xì)胞核中顯示小滴樣凝聚物(圖2c,左)。然而純化的mEGFP-KAT8或IRF1-mCherry單獨顯示出液滴形成的弱能力,而將兩者混合在一起顯著增強液滴形成(圖2c)。液滴形成不依賴于熒光蛋白標(biāo)簽也不依賴于KAT8乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(圖2d)。此外,液滴能夠隨時間融合,并且在體外和細(xì)胞中在光漂白后部分恢復(fù)(光漂白后熒光恢復(fù)(FRAP))(圖2e-g),這些液滴可被1,6-己二醇和高濃度NaCl破壞(圖2h,i)??傊?,這些結(jié)果表明KAT 8-IRF 1凝聚物的動態(tài)和可逆性質(zhì)。超分辨率成像顯示內(nèi)源性KAT8和IRF1在細(xì)胞中形成小的凝聚物,并且觀察到共定位的凝聚物(圖2j-n)。此外,當(dāng)兩種蛋白質(zhì)濃度高于75 nM時,KAT8-IRF1液滴在體外形成(圖2o-q)。更重要的是,在來自患有癌癥(肺癌、黑色素瘤、乳腺癌和胃癌)的個體的樣品中,還觀察到KAT8和IRF1縮合物,并且兩種蛋白的熒光強度與PD-Ll表達(dá)呈正相關(guān)(圖2r )??傊?,這些結(jié)果表明KAT8和IRF1可以在體內(nèi)和體外形成縮合物。


圖2:KAT8與IRF1在體內(nèi)外形成動態(tài)凝聚物


3.KAT8-IRF1的縮合依賴于多價互相作用
       為了探索KAT8-IRF1縮合物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),使用IUPred 2分析了這兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列。將KAT8的氨基酸1-68(KAT81-68)和IRF1140-325(其包括反式激活結(jié)構(gòu)域35)評分為IDR(圖3a,b)。KAT81 -68或IRF11140 -325的耗盡破壞了冷凝物的形成(圖3c,d),而不是預(yù)測的IRFl的IDR,負(fù)責(zé)KAT8相互作用(圖3e)。IRF1 DBD(即IRF1115 -325片段)的缺失也損害了與KAT8的縮合物形成(圖3c,d),表明IRF1的DBD介導(dǎo)與KAT8的相互作用,也是冷凝物形成所必需的。此外,將IRF11 -140與來自不相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYC或OCT4的IDR融合恢復(fù)了與KAT8的縮合物形成,而單獨來自MYC或OCT4的IDR構(gòu)建體則不能(圖1A)。3f)。光液滴測定還顯示,當(dāng)KAT8和IRFl IDR與Cry 2融合時,藍(lán)光誘導(dǎo)增強了兩種蛋白質(zhì)的IDR之間的縮合物形成(圖3g,h )。.總的來說,這些觀察結(jié)果表明多價相互作用模型,其中IRF1 DBD和KAT8之間的相互作用可能是冷凝物引發(fā)的先決條件,并且IRF1和KAT8兩者的IDR之間的弱混雜相互作用促進(jìn)冷凝物形成。


圖3:KAT8-IRF1縮合中的多價相互作用


4.KAT8-IRF1縮合物促進(jìn)PD-L1 mRNA反式激活
       接下來,研究了KAT8-IRF 1縮合物是否可以增強轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄機器組分,包括MED 1 IDR、CDK7、CDK9、BRD4和在絲氨酸5處磷酸化的活性RNA聚合酶II(RNA Pol II-S5 P),在KAT8-IRF1縮合物中富集(4a,b)。為了測試IDR介導(dǎo)的KAT8-IRF 1縮合在轉(zhuǎn)錄增強中的作用,設(shè)計了雷帕霉素誘導(dǎo)的相互作用系統(tǒng),以通過將KAT8 IDR或IRF1 IDR與FKBP 12或FRB-Gal4 DBD融合來解偶聯(lián)結(jié)構(gòu)化的IRF1 DBD-KAT8相互作用和混雜的IDR相互作用。雷帕霉素處理后,用KAT8 IDR-FKBP12和IRF1 IDR-FRB-Gal4 DBD共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在細(xì)胞核中顯示小的凝聚物(圖4c),表明該系統(tǒng)可以模擬由KAT8和IRF1 IDR相互作用引起的冷凝。然后,使用Gal4上游活化位點(UAS)報告基因測定評估了IDR縮合的反式激活作用(圖4d)。IRF1 IDR-FRB-Gal4 DBD的轉(zhuǎn)染增加了報告基因表達(dá),而無IDR對照和KAT8 IDR-FKBP12顯示無活性,并且雷帕霉素誘導(dǎo)不能進(jìn)一步增強報告基因表達(dá)。用KAT 8 IDR-FKBP12和IRF1 IDR-FRB-Gal4 DBD共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出與在不存在雷帕霉素的情況下僅用IRF1 IDR-FRB-Gal 4 DBD轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相似的報道基因表達(dá)水平,而報道基因表達(dá)在雷帕霉素處理后顯著增強(圖4 e)。此外,雷帕霉素劑量-反應(yīng)曲線在KAT8 IDR-FKBP12和IRF1 IDR-FRB-Gal4 DBD穩(wěn)定整合的UAS報告細(xì)胞中顯示非線性活化模式(圖4f)。這些結(jié)果表明IDR介導(dǎo)的KAT8-IRF1縮合促進(jìn)反式激活。此外,在進(jìn)行dCas 9-SunTag-sgARRAY介導(dǎo)的原位標(biāo)記之后,觀察到內(nèi)源性KAT8和IRF1在細(xì)胞中的PD-Ll啟動子處形成縮合物(圖4g-k)??傊琄AT8-IRF1縮合物促進(jìn)PD-L1 mRNA反式激活。


圖4:KAT8-IRF1縮合物促進(jìn)PD-L1 mRNA反式激活


5.KAT8乙?;⒋龠M(jìn)IRF1的活性
       接下來,測試了KAT8是否可以乙?;疘RF1。WT KAT8(但不包括其催化缺陷型C316S突變體)與IRF1的共轉(zhuǎn)染顯著增強了其乙酰化(圖5a)。.在應(yīng)用針對乙?;疘RF1K78(K78ac)的特異性抗體后,通過體內(nèi)和體外乙?;瘻y定進(jìn)一步證實了WT KAT8而不是C316S突變體對IRF1K78的直接催化活性(K78ac)(圖5b,c)。更重要的是,耗盡KAT8導(dǎo)致內(nèi)源IRFl在K78處的乙?;档停▓D5d)??傊@些數(shù)據(jù)表明KAT8特異性乙?;疘RF1K78。為了探索KAT8-IRF1縮合是否促進(jìn)IRF1K78ac,進(jìn)行有或沒有液滴形成的體外組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性測定。IRF1K78ac在液滴中顯著增加(圖5e,f),并且液滴中的KAT8的乙?;芰Ρ缺倔w中的高約39.67 ± 1.997倍(圖5g)。這些結(jié)果提供了KAT8通過共縮合促進(jìn)IRFl乙?;淖C據(jù)。接下來,評估了IRF1 K78ac對PD-L1表達(dá)的影響。IRF1 K78R突變體未能上調(diào)PD-L1表達(dá),并且在PD-L1啟動子處顯示出降低的豐度(圖5 h)。這些結(jié)果表明K78處的乙?;瘜τ贗RFl的DNA結(jié)合是重要的。與這些數(shù)據(jù)一致,通過sgRNA處理消除KAT 8顯著降低IRFl在PD-Ll啟動子處的豐度(圖5i,j)。K78 R細(xì)胞表現(xiàn)出PD-Ll mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的顯著降低(圖5 k)。IRF1在PD-Ll啟動子處的豐度在經(jīng)受IFNγ處理的K78R細(xì)胞中也顯著降低(圖5l)。同樣,由KAT8-IRF1 K78R形成的細(xì)胞內(nèi)縮合物顯示出大的不規(guī)則和較低動態(tài)的簇,而不與RNA Pol II-SSP共定位(圖5m,n)。盡管K78 R突變體在體外顯示出與KAT8相互作用和共縮合的類似能力(圖5 o,p)。與WT液滴相比,由KAT8-IRF1 K78R形成的液滴顯示來源于PD-L1啟動子的DNA探針的募集顯著減少(圖5o)??傊@些結(jié)果表明KAT8在K78處乙?;疘RF1,這增強了IRF1的DNA結(jié)合活性及其對PD-L1啟動子的定位和隨后的PD-L1 mRNA轉(zhuǎn)錄的激活。


圖5:KAT8乙酰化并促進(jìn)IRF1的活性


6.IRF 1乙?;瘜AT 8募集至PD-L1啟動子
       KAT8是哺乳動物細(xì)胞中H4K16ac所需的主要乙酰轉(zhuǎn)移酶,研究KAT 8是否調(diào)節(jié)PD-Ll啟動子中的H4K16ac。KAT 8敲低細(xì)胞顯示出H4K16ac的總體減少,而其他H4乙?;稽c(H4K5ac、H4K8ac和H4K12ac)保持不受影響(圖6a)。來自ENCODE數(shù)據(jù)庫的染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-seq)數(shù)據(jù)顯示KAT 8和IRF 1在PD-L1的啟動子區(qū)域富集(圖6 b)。ChIP-qPCR顯示,當(dāng)KAT 8表達(dá)被sgRNA耗盡時,PD-L1啟動子處的H4K16ac也顯著降低(圖6c)。鑒于KAT8和IRF1的共縮合,評估了IRF1是否進(jìn)而增強響應(yīng)IFNγ的PD-L1啟動子處的KAT 8募集。具有IRFl耗竭的細(xì)胞在IFNγ處理后具有PD-Ll啟動子處的KAT 8和H4 K16 ac的豐度顯著降低(圖6d,e)。此外,K78R細(xì)胞在IFNγ暴露后還顯示出降低的KAT8定位和PD-Ll啟動子處的H4K16ac(圖6 f,g),表明IRF 1乙酰化增強PD-L1啟動子處的KAT 8募集和H4K16ac修飾作為正反饋。


圖6:IRF 1乙?;瘜AT 8募集至PD-L1啟動子


7.破壞KAT 8-IRF 1縮合物抑制PD-L1表達(dá)
       IRF1 DBD和KAT8之間的結(jié)構(gòu)化結(jié)構(gòu)域相互作用在縮合物形成中的重要作用,表明靶向結(jié)構(gòu)化結(jié)構(gòu)域相互作用也可能破壞KAT8-IRF1縮合物,而不是靶向非結(jié)構(gòu)化IDR。為了測試該假設(shè),構(gòu)建了一系列IRF1 DBD截斷(圖7a)并各自在細(xì)胞中與KAT8共轉(zhuǎn)染以鑒定負(fù)責(zé)與KAT8相互作用的IRF1的最小區(qū)域。然后將人和小鼠中的完全保守的N-末端區(qū)域鑒定為負(fù)責(zé)IRF1-KAT 8相互作用的主要區(qū)域(圖7 b-d),并且預(yù)測的β-片層的關(guān)鍵殘基47、48(Mut)的突變消除了相互作用(圖7c-f)。接下來,合成了兩種肽,2142-R8和Mut-R8,其衍生自2142和Mut,其中8個精氨酸殘基融合到它們的C末端(R8)。為了評估2142-R8在細(xì)胞中的生理條件下對KAT8-IRF 1縮合物的破壞能力,使用具有V5-TurboID標(biāo)記的KAT 8的鄰近標(biāo)記系統(tǒng)(圖2a)。在用2142-R8處理細(xì)胞后,生物素標(biāo)記的IRF1的水平顯著降低(圖7 g),表明細(xì)胞中IRF 1和KAT 8之間的相互作用被抑制。因此,IRF1 K78的乙?;灰种疲⑶襊D-L1啟動子處的H4K16ac減少(圖7h,i)。同樣,在細(xì)胞中和體外2142-R8處理后,KAT 8-IRF 1縮合物減少(圖7j,k)。最重要的是,2142-R8有效地抑制了用IFNγ處理的細(xì)胞中PD-Ll表達(dá)的上調(diào)(圖7l,m)。此外,RNA測序分析顯示,2142-R8處理下調(diào)PD-Ll,而主要組織相容性復(fù)合物I類(MHCI類)相關(guān)基因和大多數(shù)IRFl下游的表達(dá)保持不變,這與來自KAT 8耗盡細(xì)胞的數(shù)據(jù)一致(圖7 n,o)??傊@些結(jié)果表明了2142-R8破壞KAT 8-IRF 1縮合物抑制PD-L1表達(dá)。


圖7:2142-R8破壞KAT 8-IRF 1縮合物抑制PD-L1表達(dá)


8.2142-R8肽增強抗腫瘤免疫
       評估2142-R8在增強抗腫瘤免疫中的功效,體外細(xì)胞毒性測定顯示2142-R8而非Mut-R8增強T細(xì)胞殺傷(圖8a)。在體內(nèi),用2142-R8而不是Mut-R8處理減少了荷瘤小鼠中KAT 8-IRF1斑點的共定位、腫瘤體積和腫瘤重量(圖8b-e)。同樣,腫瘤PD-Ll表達(dá)降低,并且活性CD8 + T細(xì)胞的浸潤通過2142-R8而不是Mut-R8增加(圖8f-l)。總之,這些結(jié)果說明2142-R8肽抑制PD-L1表達(dá)并增強體內(nèi)抗腫瘤免疫。


圖8:2142-R8肽增強抗腫瘤免疫


結(jié)論
       越來越多的證據(jù)表明生物分子縮合物在調(diào)節(jié)癌癥發(fā)展,這表明靶向這一過程可能是有希望的。這篇文章在KAT8-IRF1縮合物的背景下,證明了IRF1 DBD和KAT8之間的特定結(jié)構(gòu)化相互作用是縮合物引發(fā)的先決條件,而IRF1和KAT8 IDR的弱混雜相互作用促進(jìn)縮合物形成?;谶@種機制,鑒定了2142-R8肽,其可以阻斷IRF1 DBD和KAT8相互作用并破壞KAT8-IRF1縮合物的形成,隨后抑制PD-L1表達(dá)和增強體外和體內(nèi)抗腫瘤免疫。總之,這些的數(shù)據(jù)表明,抑制癌癥相關(guān)冷凝物的形成可能是一種潛在的癌癥治療策略。

實驗方法
構(gòu)建質(zhì)粒,免疫共沉淀實驗,共轉(zhuǎn)染實驗,細(xì)胞免疫熒光實驗,組織IHC和熒光IHC,體外乙?;瘻y定,液滴和大量樣品的乙酰化,體外毒性試驗,肽下拉實驗,蛋白表達(dá)和純化實驗,相分離實驗,optoDroplets實驗,Gal 4-UAS-mEGFP報告基因?qū)嶒?,質(zhì)譜,鄰近標(biāo)記分析,流式細(xì)胞術(shù),dCas9-SunTag PD-L1啟動子可視化,全基因組CRISPR-Cas9基因敲除篩選,RNA測序和分析流水線,westernblot,RT-qPCR,體內(nèi)成瘤實驗,熒光漂白恢復(fù)實驗。
參考文獻(xiàn)
Wu, Y., Zhou, L., Zou, Y., Zhang, Y., Zhang, M., Xu, L., Zheng, L., He, W., Yu, K., Li, T., Zhang, X., Chen, Z., Zhang, R., Zhou, P., Zhang, N., Zheng, L., & Kang, T. (2023). Disrupting the phase separation of KAT8-IRF1 diminishes PD-L1 expression and promotes antitumor immunity. Nature cancer, 4(3), 382–400. https://doi.org/10.1038/s43018-023-00522-1