大鼠心肌細(xì)胞 RCM

   高度分化的心肌細(xì)胞幾乎沒有分裂能力，它們在a-腎上腺素的刺激下通過Ras/MEK途徑發(fā)生肥大生長。所有的心肌細(xì)胞都能自律性的將膜去極化和復(fù)極化。所有的心肌細(xì)胞收縮都是肌源性的，不受神經(jīng)系統(tǒng)刺激。心肌細(xì)胞具有復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)節(jié)其在心臟節(jié)律性的泵出功能中的作用。心力衰竭時(shí)，心肌細(xì)胞的肥大和凋亡導(dǎo)致心肌收縮功能的下降。更好地了解心臟信號(hào)系統(tǒng)有助于揭示心肌細(xì)胞死亡的細(xì)胞機(jī)制。

   RCM是從出生2天大鼠的心臟分離得到的，原代凍存，冰凍運(yùn)輸。每管細(xì)胞密度超過1×10^6/ml。細(xì)胞特性經(jīng)肌球蛋白（myosin）、sacromeric alpha-actinin 和原肌球蛋白免疫熒光鑒定。本細(xì)胞經(jīng)檢測不含支原體、細(xì)菌、酵母菌和真菌。如采用ScienCell實(shí)驗(yàn)室提供的培養(yǎng)條件，可保證此細(xì)胞繼續(xù)的培養(yǎng)。HCM因?yàn)椴荒茉鲋?，故不能夠擴(kuò)大或長期培養(yǎng)。

分離方法：

大鼠心肌細(xì)胞比乳鼠心肌難養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)基，呈桿狀，橫紋清楚，在培養(yǎng)基里細(xì)胞不搏動(dòng)。大鼠心肌細(xì)胞分離一般是采用二型膠原酶分離，濃度為1mg/ml（用無鈣臺(tái)氏液配制），同時(shí)酶液里加入?；撬?，BSA。一般采用Langendorff灌流的方法，大鼠開胸后，迅速取出心臟，放入冰的臺(tái)氏液中，找到主動(dòng)脈后，掛上Langendorff裝置，衡流泵灌入無鈣臺(tái)氏液（37度），開始心臟會(huì)搏動(dòng)幾下，這樣把心臟中的淤血擠出（此處也有人用有鈣臺(tái)氏液灌流，好讓心臟充分搏動(dòng)，把淤血擠出，不過我們摸索發(fā)現(xiàn)只要取心臟到掛上去的時(shí)間短，一般搏動(dòng)幾下就能把淤血清楚干凈了）。

幾分鐘后，換酶液開始灌流心臟，一般開始時(shí)，心臟較軟，待消化一段時(shí)間后變硬，繼續(xù)消化后又變軟，且心臟發(fā)白，這時(shí)候就可以停止消化，將心室剪下，放入KB液中，用剪刀剪碎后，用滴管吹打，取上清，繼續(xù)加入KB液，吹打，直到上清液不渾濁為止，一般吹打3－4次即可。將各次上清合并，吹打過濾后，沉降20分鐘左右，棄上清，加入無血清培養(yǎng)基（MEM，不含L－谷氨酰胺，并加入肌酸，?；撬幔珺SA，肉毒堿，HEPES），吹打，1000轉(zhuǎn)/分離心半分鐘，棄上清，再洗1－2次后，將沉淀加入到6％的BSA中沉降15－20分鐘（純化心肌細(xì)胞），然后計(jì)數(shù)，點(diǎn)板或培養(yǎng)。

此法中如果各步注意無菌操作，最后先用加倍雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，再換正常培養(yǎng)基，可適用于條件不是很好的試驗(yàn)室。如果能在板或瓶內(nèi)加入Laminin處理后，貼壁很好。如果分離出來的心肌細(xì)胞，逐級(jí)復(fù)鈣后培養(yǎng)，狀態(tài)更好。最佳狀態(tài)此中方法能培養(yǎng)7天以上。